周連仲 馮 勇 劉 瑋 周子寧 張建新

天津市第四中心醫(yī)院 南開(kāi)大學(xué)附屬第四中心醫(yī)院 天津市耳鼻咽喉頭頸外科醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 300000

軟骨調(diào)節(jié)素(ChM)是一族新的軟骨特異性蛋白，它的家族包括ChM-Ⅰ、ChM-Ⅱ、ChM-Ⅲ三種生物因子[1]，ChM-I是最早被明確的軟骨調(diào)節(jié)素。 ChM-I的生物學(xué)作用表現(xiàn)為刺激軟骨細(xì)胞DNA和基質(zhì)合成，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞和體內(nèi)軟骨的快速生長(zhǎng)；抑制血管發(fā)生，能夠抑制血管長(zhǎng)入軟骨內(nèi)，進(jìn)一步抑制軟骨內(nèi)骨化和骨的形成。本文將對(duì)ChM-Ⅰ的研究進(jìn)展加以概述。

1 ChM-I的結(jié)構(gòu)

人們?cè)谘芯看碳ぼ浌巧L(zhǎng)的因子的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)一種軟骨提純物,其刺激軟骨細(xì)胞的活性和TGF完全不同。這種提純物為ChM-Ⅰ，是一種由121個(gè)氨基酸構(gòu)成的糖蛋白，相對(duì)分子質(zhì)量為25 000。其在胎牛軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中大量存在，具有促進(jìn)軟骨細(xì)胞增生和蛋白多糖合成的作用。為了更好地研究ChM-Ⅰ的功能，人們對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析：成熟的ChM-Ⅰ蛋白質(zhì)在其C末端帶有3個(gè)糖基化位點(diǎn)，由1個(gè)疏水區(qū)和8個(gè)半胱氨酸構(gòu)成；其N端，具有很高的親水性。Yanagihar等[2]以人ChM-Ⅰ的cDNA作為探針，從人基因組粘粒文庫(kù)中篩選出兩組含有ChM-Ⅰ的cDNA的克隆，對(duì)其進(jìn)行核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ基因是由7個(gè)外顯子和外顯子—內(nèi)含子邊界構(gòu)成的。利用所獲得的克隆為探針，進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)人的ChM-Ⅰ基因位于染色體13q14-21處，編碼334氨基酸Ⅱ型跨膜糖蛋白。

2 ChM-Ⅰ的表達(dá)與調(diào)控

2.1 ChM-Ⅰ在軟骨組織中的表達(dá) ChM-Ⅰ最早是在骨骺軟骨中被發(fā)現(xiàn)并分離出來(lái)。人們?cè)谡诎l(fā)育的牛尾椎軟骨組織中檢測(cè)到了ChM-Ⅰ的表達(dá)；而在牛的軟骨膜和肌肉等非軟骨組織中并未檢測(cè)到ChM-Ⅰ的表達(dá)。ChM-Ⅰ這種在軟骨組織中特異性表達(dá)的特性，提示其表達(dá)可能是軟骨細(xì)胞分化表型的一部分。 Shukunami等[3]采用Northern blot分析顯示，ChM-Ⅰ轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)與胎齡11～17d時(shí)表達(dá)Ⅱ塑膠原的軟骨形成相關(guān)，此時(shí)軟骨骨基正在被骨替代。同時(shí)，ChM-Ⅰ的mRNA在眼及胸腺中有低水平的表達(dá)。原位雜交顯示ChM-Ⅰ在13.5～16d的小鼠胚中所有軟骨樣組織中均有大量的表達(dá)。在退化的軟骨組織中，ChM-Ⅰ的mRNA的表達(dá)是幾乎不存在的。并且轉(zhuǎn)錄子的表達(dá)隨著肥大軟骨細(xì)胞X型膠原的出現(xiàn)而下降。

2.2 不同種屬間ChM-Ⅰ的表達(dá) 研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬間ChM-Ⅰ的表達(dá)是有所差異的。Shukunami等[4]對(duì)雞的ChM-Ⅰ的cDNA核苷酸序列進(jìn)行分析：發(fā)現(xiàn)雞的成熟的ChM-ⅠN端親水區(qū)序列要比哺乳動(dòng)物的長(zhǎng)，其原因可能是由于多腺苷酸化信號(hào)的交替使用，使雞的胚胎可以表達(dá)多種不同大小的轉(zhuǎn)錄子(3.7、2.0和1.7kb)，但哺乳動(dòng)物僅表達(dá)一種轉(zhuǎn)錄子(1.7kb)。在雞的胚胎發(fā)育早期，在體節(jié)、心臟、支氣管弓、視網(wǎng)膜和肢芽中可檢測(cè)到ChM-I的mRNA的表達(dá)；在發(fā)育后期，ChM-I的mRNA的表達(dá)僅局限于軟骨及眼。在雞的胚胎發(fā)育過(guò)程中，ChM-Ⅰ的表達(dá)并不是只局限在無(wú)血管的軟骨區(qū)，其轉(zhuǎn)錄子在脊索、神經(jīng)管底板及頂板和軟骨前體組織如:體節(jié)生骨節(jié)、發(fā)育中的四肢及咽弓、耳道及鞏膜中也有表達(dá)。

2.3 ChM-Ⅰ的調(diào)控 Aoyama等[5]在骨肉瘤細(xì)胞系中研究ChM-Ⅰ基因表達(dá)的分子機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，ChM-Ⅰ基因DNA甲基化與去甲基化作用和組蛋白的乙酰化與去乙?；饔弥g的轉(zhuǎn)化,在ChM-Ⅰ的基因表達(dá)調(diào)控中也起著重要的作用。PI3K/AKT信號(hào)的下游缺陷可能會(huì)影響mTOR網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在顳下頜關(guān)節(jié)(TMJ)的穿孔盤中，血管生成似乎受NF-κB途徑的調(diào)控，與健康盤相比，ChM-Ⅰ在穿孔盤中的表達(dá)明顯較低，似乎在白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)的存在下通過(guò)NF-κB途徑進(jìn)行調(diào)控，將ChM-Ⅰ與受體介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)和TMJ的病理血管生成聯(lián)系起來(lái)[6]。

3 ChM-I 的生物學(xué)作用

3.1 在軟骨生長(zhǎng)、軟骨損傷修復(fù)及軟骨、椎間盤退變中的作用 ChM-Ⅰ具有刺激軟骨細(xì)胞DNA和基質(zhì)合成的作用，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞和體內(nèi)軟骨的快速生長(zhǎng)。ChM-Ⅰ與FGF-2具有協(xié)同作用，而且具有濃度依賴性，當(dāng)ChM-Ⅰ的濃度達(dá)到200ng/ml時(shí)，ChM-Ⅰ刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)的活性最強(qiáng)，這些發(fā)現(xiàn)表明ChM-Ⅰ在軟骨的生長(zhǎng)過(guò)程中起著特殊的作用。研究表明[7]，正常發(fā)育成年鼠健康關(guān)節(jié)軟骨中可檢測(cè)到大量ChM-Ⅰ蛋白的表達(dá)；在骨關(guān)節(jié)炎早期，淺表關(guān)節(jié)軟骨中的ChM-Ⅰ蛋白表達(dá)有所減少；在骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展期，所有關(guān)節(jié)軟骨中的ChM-Ⅰ蛋白表達(dá)均減少，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)子的表達(dá)反而增加。據(jù)此筆者推測(cè)：在關(guān)節(jié)軟骨的正常生長(zhǎng)和無(wú)血管特性的維持過(guò)程中ChM-Ⅰ起著重要的作用，其表達(dá)的下調(diào)可使血管侵入關(guān)節(jié)軟骨，并最終導(dǎo)致軟骨的骨化和骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)[8]，退變初期的椎間盤中，ChM-I的表達(dá)反而有所升高。筆者推測(cè)ChM-Ⅰ在退變初期的增多是為了阻止椎間盤退變的進(jìn)展，ChM-Ⅰ在維持軟骨組織的完整性中發(fā)揮著保護(hù)性作用。另有證據(jù)表明ChM-Ⅰ的表達(dá)與骨關(guān)節(jié)炎可能有關(guān)，在軟骨細(xì)胞分化和軟骨的調(diào)控中維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。綜合以上研究結(jié)果，筆者發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ在軟骨生長(zhǎng)、軟骨損傷修復(fù)及軟骨、椎間盤退變中發(fā)揮著重要作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 在心臟瓣膜中的作用 研究證明[9]：在維持心臟瓣膜正常功能的過(guò)程中，ChM-Ⅰ具有重要的作用。它阻止心臟瓣膜中新生血管的形成，而這一過(guò)程很可能導(dǎo)致心臟瓣膜病的發(fā)生。炎癥誘導(dǎo)的新血管重建是感染性心內(nèi)膜炎(IE)發(fā)展的一個(gè)致病性特征。在IE早期的瓣膜組織中，ChM-Ⅰ的表達(dá)被下調(diào)，這可能導(dǎo)致血管重建和心內(nèi)膜炎的進(jìn)展，與 ChM-Ⅰ水平的降低引起的免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的結(jié)果。此外，缺氧相關(guān)的ChM-Ⅰ表達(dá)降低也可能是中晚期瓣膜疾病進(jìn)展的一個(gè)因素。在植入過(guò)程中，ChM-Ⅰ被證明對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和入侵有抑制作用，這意味著ChM-Ⅰ可能會(huì)影響胚胎發(fā)育過(guò)程中組織分化和血管生成的調(diào)節(jié)。還需要進(jìn)一步的研究來(lái)促進(jìn)我們對(duì)ChM-Ⅰ在感染性心內(nèi)膜炎的發(fā)展和胚胎發(fā)生中作用的理解。

3.3 在抑制內(nèi)皮細(xì)胞及血管形成中的作用 軟骨由于存在大量的抗血管形成因子，而表現(xiàn)出無(wú)血管化狀態(tài)。然而在軟骨內(nèi)骨化過(guò)程中，其鈣化中心是允許血管長(zhǎng)入的，這也是骨替代軟骨的開(kāi)始。軟骨的血管化和無(wú)血管化的狀態(tài)改變，在軟骨內(nèi)成骨過(guò)程中起關(guān)鍵的作用。在體外試驗(yàn)中，觀察到ChM-Ⅰ具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管狀的形成。ChM-Ⅰ抑制血管形成的作用已得到廣泛的認(rèn)同。 Shigenori Miura等[10]研究人重組軟骨調(diào)節(jié)素在小鼠角膜血管形成中有抵抗血管形成的作用。他們主要關(guān)注VEGF-A介導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移這一步驟，此步驟是血管形成中關(guān)鍵的調(diào)控步驟。分別用VEGF、FGF-2和IGF-1介導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的超化性遷移，加人人重組軟骨調(diào)節(jié)素Ⅰ(rhChM-Ⅰ)濃縮液阻滯這一過(guò)程，并用改良后的趨化實(shí)驗(yàn)裝置進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ的功能是建立在內(nèi)皮細(xì)胞黏附的獨(dú)立性和專一性之上的。這一作用與細(xì)胞伸展的阻滯和在VEGF刺激下的肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的斷裂重組有關(guān)。與這些觀察相一致，在細(xì)胞擴(kuò)展期間，rhChM-Ⅰ明顯降低了Rac1/Cdc42的活力，在靜止期的細(xì)胞，VEGF 介導(dǎo)的Rac1活力并不是它的基本活力。綜上所述，目前的數(shù)據(jù)顯示，ChM-Ⅰ損傷了內(nèi)皮細(xì)胞由VEGF-A刺激所產(chǎn)生的活力，進(jìn)而阻止內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3.4 在抗腫瘤中的作用 研究表明[11]，ChM-Ⅰ的抗血管生成特性可以抑制腫瘤的生長(zhǎng)、傳播和轉(zhuǎn)移，這表明ChM-Ⅰ功能的喪失可能會(huì)誘導(dǎo)腫瘤的發(fā)生。ChM-Ⅰ已被證明可以抑制體內(nèi)人骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，并抑制體外人骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。研究發(fā)現(xiàn)[12]ChM-Ⅰ在胃癌中的表達(dá)下調(diào)，ChM-Ⅰ似乎是一種潛在的腫瘤抑制劑，這也可能成為胃癌治療和預(yù)后的重要生物標(biāo)志物。ChM-Ⅰ在多種內(nèi)分泌腫瘤(MEN)中有所表達(dá)，在多形性腺瘤的發(fā)病機(jī)制研究過(guò)程中，也檢測(cè)到ChM-Ⅰ的表達(dá)，這表明它有可能參與了多形性腺瘤的低血管性和軟骨體的形成。在細(xì)胞水平上，ChM-Ⅰ似乎能夠通過(guò)以劑量依賴關(guān)系促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)來(lái)表現(xiàn)出雙重作用。低濃度的ChM-Ⅰ似乎可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，而高濃度的ChM-Ⅰ抑制了腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移，如人宮頸癌(HeLa)細(xì)胞和人神經(jīng)母細(xì)胞瘤(SH-SY5Y)細(xì)胞，并抑制了人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)的增殖和血管生成[13]。ChM-Ⅰ通過(guò)抑制STAT信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮直接的抗腫瘤作用。ChM-Ⅰ還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)水平來(lái)抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，因此可能對(duì)治療乳腺癌有潛在的臨床應(yīng)用[14]?？偟膩?lái)說(shuō)，這些發(fā)現(xiàn)提示ChM-Ⅰ在各種癌癥的發(fā)病機(jī)制中起作用，與ChM-Ⅰ調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞分化和抗血管生成特性有關(guān)。ChM-Ⅰ在癌癥發(fā)病機(jī)制中的作用需要進(jìn)一步的研究，以開(kāi)發(fā)其作為癌癥治療的新靶點(diǎn)。

3.5 在軟骨組織工程中誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的作用 骨髓間充干細(xì)胞因其具有多向分化潛能，在組織工程中的應(yīng)用前景越來(lái)越好，受到越來(lái)越多的學(xué)者的關(guān)注。因生物因子對(duì)誘導(dǎo)種子細(xì)胞向軟骨細(xì)胞分化、增殖的關(guān)鍵作用而成為軟骨組織工程的一個(gè)重要研究方向。翟立杰所帶領(lǐng)的課題組在這方面做了大量的工作。他們利用基因芯片篩選大鼠MSCs和透明軟骨及彈性軟骨細(xì)胞差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)ChM-Ⅰ基因在MSCs中低表達(dá)，而在透明軟骨及彈性軟骨細(xì)胞中高表達(dá)[15]。通過(guò)生物信息學(xué)檢索結(jié)果提示，ChM-Ⅰ可能在誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞方向分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用。Western blot發(fā)現(xiàn)在透明軟骨細(xì)胞和彈性軟骨細(xì)胞中ChM-Ⅰ的表達(dá)明顯高于MSCs，推測(cè)ChM-Ⅰ可能成為誘導(dǎo)MSCs向軟骨細(xì)胞分化的一個(gè)重要的生物因子。

4 展望

ChM-Ⅰ是軟骨源性的生長(zhǎng)因子，同時(shí)也是一種血管生成抑制劑，其可以調(diào)控軟骨的形成，刺激軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)，對(duì)軟骨的無(wú)血管化的維持起重要作用。ChM-Ⅰ在抵抗軟骨退化方面的研究也有很多報(bào)道，但關(guān)于其分子機(jī)制，如ChM-Ⅰ作用的受體、受體結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)以及生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞過(guò)程的研究很少。ChM-Ⅰ抑制血管生成的作用，在實(shí)體腫瘤的治療中展示了很好的應(yīng)用前景，同時(shí)也有ChM-Ⅰ直接抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)方面的研究及相關(guān)作用機(jī)制的探討，但仍缺乏更廣泛深入的研究。另外，對(duì)ChM-Ⅰ在軟骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用也有學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)的研究，具有很好的研究前景?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，ChM-Ⅰ的基因及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究也在不斷深入，已提純得到了ChM-Ⅰ重組蛋白，并在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了其功能的有效性。相信在不遠(yuǎn)的將來(lái)，對(duì)ChM-Ⅰ的研究必將有更進(jìn)一步的發(fā)展，其在臨床應(yīng)用方面的價(jià)值也會(huì)不斷展現(xiàn)，最終為相關(guān)臨床疾病的治療帶來(lái)新的方法。