蘇鑫安 薛冀蘇 陳 慧

(1 蘭州大學(xué)第二醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，甘肅省蘭州市 730030； 2 深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，廣東省深圳市 518101)

【提要】 自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)在臨床上比較常見(jiàn)，包括Graves病、橋本甲狀腺炎、產(chǎn)后甲狀腺炎等疾病。研究顯示，促甲狀腺激素受體(TSHR)通過(guò)與促甲狀腺激素受體抗體(TRAb)相結(jié)合來(lái)調(diào)控AITD的發(fā)生和發(fā)展。TSHR包含TSHR-A亞基和TSHR-B亞基，TRAb分為TSHR刺激性抗體(TSAb)和促甲狀腺激素(TSH)刺激阻斷性抗體(TSBAb)，TSAb通過(guò)與TSHR-A亞基結(jié)合，模擬TSH的作用，刺激甲狀腺濾泡細(xì)胞增生和功能增強(qiáng)，引起甲狀腺功能亢進(jìn)；TSBAb通過(guò)與TSHR-B亞基結(jié)合，能抑制甲狀腺增生和甲狀腺激素的合成和分泌，導(dǎo)致甲狀腺功能減退和甲狀腺萎縮。目前，已有大量有關(guān)TSHR-A亞基及其自身抗體TSAb的研究，但鮮見(jiàn)有關(guān)TSHR-B亞基的研究。研究TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb對(duì)AITD的診治尤為重要，故本文就TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身抗體TSBAb在AITD診治中的應(yīng)用等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

促甲狀腺激素受體(thyroid-stimulating hormone receptor,TSHR)存在于甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞和其他多種細(xì)胞的質(zhì)膜上，是一種7次跨膜糖蛋白受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體[1]。TSHR能和促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)結(jié)合，是T淋巴細(xì)胞和自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)TSHR抗體(TSHR antibody,TRAb)最常見(jiàn)的抗原靶點(diǎn)[2]。TSHR主要由TSHR-A亞基和TSHR-B亞基組成，兩個(gè)亞基通過(guò)C肽二硫鍵形成TSHR的二級(jí)結(jié)構(gòu)。TRAb是一組多克隆抗體，主要包括TSHR刺激性抗體(TSH receptor stimulating antibody,TSAb)和TSH刺激阻斷性抗體(TSH-stimulation blocking antibody,TSBAb)兩種類型。病理?xiàng)l件下，TSAb和TSBAb分別作用于TSHR上的A、B亞基，介導(dǎo)AITD的發(fā)生和發(fā)展。本文對(duì)TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)、功能及其與自身抗體TSBAb在AITD診治中的應(yīng)用等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為探討AITD的發(fā)病機(jī)制、診斷、治療及評(píng)估預(yù)后提供參考依據(jù)。

1 TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)和功能

TSHR基因位于染色體14q31.1上，由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成，TSHR-B亞基主要由TSHR基因第10號(hào)外顯子編碼。TSHR有764個(gè)氨基酸，B亞基的C末端位于TSHR的第764位氨基酸殘基，但對(duì)于B亞基的起始位點(diǎn)目前尚未達(dá)成共識(shí)，諸多研究者采用不同的劃分方法，得到的B亞基的相對(duì)分子質(zhì)量大小不一。目前最常見(jiàn)的劃分方法為B亞基的N末端起始于TSHR的第370位氨基酸殘基，相應(yīng)的B亞基的相對(duì)分子量約為45 000。其他較常見(jiàn)的劃分方法還有第310～764位氨基酸殘基、第367～764位氨基酸殘基、第380～764位氨基酸殘基，對(duì)應(yīng)的B亞基的相對(duì)分子量分別為52.6 000，45.3 000和42 000[3-4]。但迄今為止，TSHR-B亞基的大小及劃分規(guī)范仍未統(tǒng)一。B亞基是跨膜兼細(xì)胞內(nèi)的亞單位，主要包括一小段胞外域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)區(qū)(胞質(zhì)羧基端部分)，具有信息傳遞、維持自身三維結(jié)構(gòu)及生物活性等功能。

1.1 胞外域 B亞基的胞外域主要指TSHR的第370～418位氨基酸殘基，此片段含有潛在的磷酸化位點(diǎn)、C-激酶和G-蛋白偶聯(lián)受體激酶，負(fù)責(zé)接收TSH信號(hào)并將信號(hào)傳導(dǎo)至胞內(nèi)[5]。B亞基胞外域的第381～385位氨基酸殘基和A亞基上的第246～260位氨基酸殘基、第277～296位氨基酸殘折疊在一起，形成一個(gè)“結(jié)合口袋”以便與TSH結(jié)合[6]。其中，第385位氨基酸(酪氨酸)殘基和第390位氨基酸(半胱氨酸)殘基是與TSH結(jié)合的重要部分，它們對(duì)TSHR空間構(gòu)象發(fā)揮著決定作用[7]。TSHR翻譯后修飾導(dǎo)致部分A亞基及C肽從B亞基上脫落，使B亞基上硫酸化的酪氨酸殘基暴露在胞外，以便于TSH及TSBAb與TSHR結(jié)合[8]。B亞基的胞外域是它的免疫原性區(qū)段，也是AITD抗原決定簇所在的重要部位。研究表明，TSBAb在B亞基的結(jié)合靶點(diǎn)主要有第370～386位氨基酸殘基、第382～401位氨基酸殘基、第392～415位氨基酸殘基等，這些表位以散在不連續(xù)的方式分布，參與TSBAb與TSHR的結(jié)合[9]。

1.2 跨膜結(jié)構(gòu)域 B亞基的跨膜結(jié)構(gòu)域7次穿膜，呈蛇形，共有264個(gè)氨基酸殘基(第419～682位氨基酸殘基)，將胞外信號(hào)傳遞給G蛋白，包括7個(gè)跨膜螺旋(TM1～TM7)、3個(gè)胞外環(huán)(e1～e3)和3個(gè)胞內(nèi)環(huán)(i1～i3)；B亞基跨膜結(jié)構(gòu)域中存在鉸鏈區(qū)，這個(gè)部位對(duì)于TSHR與TSH的結(jié)合，以及TSHR激活后向細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起著非常重要的作用[10]。一般情況下TSHR處于非激活狀態(tài)，而它的激活依賴于受體內(nèi)抑制的解除，這種抑制作用除了與A亞基和B亞基細(xì)胞外環(huán)之間的靜電相互作用有關(guān)，還與B亞基跨膜部分的分子開(kāi)關(guān)有關(guān)[11]。B亞基TM5中的第601位氨基酸殘基、TM6中的第633位氨基酸殘基、TM7中的第674位氨基酸殘基被認(rèn)為是G 蛋白偶聯(lián)的分子開(kāi)關(guān)[12]，它們協(xié)同影響TSHR的激活。當(dāng)TSHR被激活后，胞內(nèi)環(huán)i2中的第525～530位氨基酸殘基參與Galphas/Galphaq雙重蛋白激活、i3中的第605～622位氨基酸殘基參與Galphaq介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)[13]、i3中第652～656位氨基酸殘基的疏水簇通過(guò)影響G蛋白的活化，它們共同影響TSHR的分子內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]，同時(shí)B亞基的3個(gè)胞外環(huán)負(fù)責(zé)維持TSHR的結(jié)構(gòu)和活性。

B亞基跨膜結(jié)構(gòu)域容易突變并使TSHR產(chǎn)生獨(dú)特的刺激性反應(yīng)，與AITD的發(fā)生密切相關(guān)[15]。如B亞基跨膜部分第486位氨基酸殘基/第568位氨基酸殘基/第656位氨基酸殘基三重突變，TSH信號(hào)傳導(dǎo)可增加70倍[16]；TM6中F631S處的突變可使激動(dòng)型G蛋白介導(dǎo)的環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)途徑激活，促進(jìn)甲狀腺激素的產(chǎn)生和甲狀腺生長(zhǎng)[17]；胞內(nèi)環(huán)i3中第617～620位氨基酸殘基的突變可導(dǎo)致功能性甲狀腺腺瘤[18]。開(kāi)展針對(duì)這些區(qū)域基因突變的研究可協(xié)助探索相關(guān)B亞基跨膜片段的功能。

1.3 胞內(nèi)區(qū) B亞基胞內(nèi)區(qū)有82個(gè)氨基酸殘基(第683～764位氨基酸殘基)，并有一個(gè)C端和C激酶磷酸化位點(diǎn)與G蛋白偶聯(lián)，負(fù)責(zé)將胞外信號(hào)傳遞到胞內(nèi)而產(chǎn)生效應(yīng)，對(duì)TSHR的信號(hào)傳導(dǎo)活動(dòng)至關(guān)重要[19]。有研究報(bào)告，B亞基胞內(nèi)區(qū)尾段第691位氨基酸殘基有助于保持TSHR 在激動(dòng)型Gα蛋白/cAMP 通路中的非激活狀態(tài)，而且在Gαq/11蛋白/磷酸肌醇級(jí)聯(lián)中亦起關(guān)鍵作用[20]。B亞基第684～692位氨基酸殘基及其相鄰的胞內(nèi)區(qū)域在激動(dòng)劑誘導(dǎo)的磷酸肌醇信號(hào)傳導(dǎo)中也有重要作用[21]。

2 TSHR-B亞基與其自身抗體TSBAb

TSHR是導(dǎo)致AITD發(fā)生和發(fā)展的最主要自身抗原之一，其中A、B亞基發(fā)揮著最主要的致病作用[22]。TSHR產(chǎn)生的自身抗體稱為TRAb，主要分為TSAb和TSBAb。TSAb與TSHR氨基端的A亞基結(jié)合形成復(fù)合體，激活腺苷酸環(huán)化酶-CAMP通路系統(tǒng)，導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)及甲狀腺細(xì)胞增生；A亞基可從跨膜的B亞基上脫落，在病理?xiàng)l件下暴露的B亞基可誘導(dǎo)TSBAb的產(chǎn)生[8]，TSBAb與TSHR羧基端的B亞基結(jié)合后，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合影響TSH與TSHR的結(jié)合，阻斷TSHR的信號(hào)傳導(dǎo)進(jìn)而產(chǎn)生抑制效應(yīng)，從而抑制甲狀腺激素的分泌，導(dǎo)致甲狀腺功能減退(簡(jiǎn)稱甲減)和甲狀腺細(xì)胞萎縮[23]。

研究表明，TSBAb通過(guò)與TSHR-B亞基相結(jié)合，與AITD的發(fā)生有關(guān)[24]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，約10%的AITD患者為TSBAb陽(yáng)性[25]，其中多數(shù)為甲減相關(guān)的AITD，如橋本甲狀腺炎、萎縮性甲狀腺炎、黏液性水腫等[26-28]，隨著體內(nèi)TSBAb水平的降低，患者甲減癥狀逐漸恢復(fù)。TSBAb還可出現(xiàn)在Graves病患者中，Graves病患者在接受抗甲狀腺藥物治療期間或治療后均可檢測(cè)到較高的TSBAb[29]。還有學(xué)者通過(guò)CT掃描發(fā)現(xiàn)，TSBAb水平與Graves眼病癥狀呈強(qiáng)負(fù)相關(guān)性[30]。此外，有研究顯示隨著TSBAb水平的降低，TSBAb陽(yáng)性的甲減患者可發(fā)展為甲亢[31]，是自身免疫性甲減向甲亢自發(fā)性轉(zhuǎn)化可能的影響因素?？梢?jiàn)TSBAb與AITD的發(fā)生密切相關(guān)，并且這種相關(guān)是通過(guò)其與TSHR-B亞基相互作用引起的，因此開(kāi)展有關(guān)TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb的相關(guān)研究具有重要臨床意義。

3 TSHR-B亞基及其自身抗體TSBAb在AITD中應(yīng)用的前景分析

3.1 TSBAb應(yīng)用于診斷及評(píng)估AITD的價(jià)值 大量研究表明，TSBAb有助于AITD的診斷和病情評(píng)估，是一種鑒別可逆性甲減的指標(biāo)。例如，Wallaschofski等[32]發(fā)現(xiàn)采用TSBAb進(jìn)行篩檢，可早期發(fā)現(xiàn)TRAb相關(guān)性AITD患者及新生兒甲減，及時(shí)進(jìn)行早期治療可取得最大的臨床治療效果。然而，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)TSBAb的檢測(cè)方法均有一定的局限性，如放射受體分析法只能檢測(cè)TRAb總和，不能區(qū)分TSAb和TSBAb；化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)TSBAb操作步驟煩瑣，流程長(zhǎng)且價(jià)格昂貴，目前多用于科研，在臨床上難以應(yīng)用推廣。近年來(lái)，眾多研究者基于TSHR-B亞基蛋白制備的酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)試劑盒為TSBAb的檢測(cè)提供了新的方法，如李寧[33]通過(guò)在原核系統(tǒng)表達(dá)截短的B亞基片段開(kāi)發(fā)出以檢測(cè)人血清TSBAb為主的TRAb/TSBAb-CLEIA試劑盒，提高了血清TSBAb檢測(cè)的敏感性及特異性；周靜[34]以TrxTSHRn(B亞基片段)蛋白為抗原建立的TSBAb檢測(cè)方法，對(duì)橋本甲狀腺炎伴甲減的診斷具有重要意義。這些基于TSHR-B亞基制備的酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)試劑盒提高了臨床上檢測(cè)TSBAb的準(zhǔn)確性，且不需要額外的特殊儀器，未來(lái)可為AITD的臨床診斷及治療提供幫助。

3.2 TSHR-B亞基應(yīng)用于自身免疫性甲減動(dòng)物模型的制備 國(guó)內(nèi)外關(guān)于自身免疫性甲減的動(dòng)物模型研究較少，目前改模型的構(gòu)建方法有脾細(xì)胞體外活化移植免疫法、自發(fā)性甲狀腺炎模型法、基因工程小鼠模型法及外源性甲狀腺抗原免疫法等[35]。脾細(xì)胞體外活化法是將實(shí)驗(yàn)小鼠的脾細(xì)胞在體外培養(yǎng)，使用特定的異源信號(hào)肽免疫后再次注射入同源受體小鼠體內(nèi)，使之發(fā)生自身免疫性甲減，此法可加重甲狀腺淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，并且會(huì)引起肉芽腫性改變，主要用于研究肉芽腫性甲狀腺炎。自發(fā)性甲狀腺炎模型法主要使用具有自身免疫傾向的NOD.H-2h4小鼠和OS雞[36]，這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可自發(fā)性形成遺傳性自身免疫性甲減，成功率較高，但這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物需在無(wú)特定病原體清潔等級(jí)下喂養(yǎng)，成本較高且疾病周期較長(zhǎng)?；蚬こ绦∈竽Ｐ椭饕ㄟ^(guò)基因重組技術(shù)獲得，此法成本高，效率低且重復(fù)性差，目前其使用價(jià)值仍在研究探索中。外源性甲狀腺抗原免疫法是一種較為成熟的造模方法，相對(duì)于其他方法具有操作較容易、造模周期短、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)較低等優(yōu)點(diǎn)。眾多研究者將TSHR-A亞基蛋白通過(guò)質(zhì)粒、腺病毒等載體注入小鼠體內(nèi)成功誘發(fā)了Graves動(dòng)物模型[37-38]。岳瑞宏[39]則使用TSHR胞外段羧基端蛋白(B亞基片段)免疫Balb/c小鼠，誘發(fā)類似于自身免疫性甲減的激素改變及甲狀腺組織病理改變，這為建立自身免疫性甲減動(dòng)物模型提供了新的思路。此法不僅簡(jiǎn)便可行、重復(fù)性高，并且能模擬自身免疫性甲減的發(fā)生及發(fā)展，適用于觀察甲狀腺細(xì)胞的病理及結(jié)構(gòu)變化。

3.3 TSBAb單克隆抗體的制備 人工獲得的TSHR-B亞基蛋白可協(xié)助動(dòng)物源性TSBAb單克隆抗體的制備，對(duì)AITD的預(yù)防及治療意義重大。目前，TSBAb單克隆抗體主要包括5C9、K1-70、RSR-B2、Tab-8、7G10等[40]，其中5C9、K1-70為人源性單克隆抗體，RSR-B2、Tab-8、7G10為動(dòng)物源性單克隆抗體。人源性單克隆抗體是直接分離人類體內(nèi)B淋巴細(xì)胞，通過(guò)雜交瘤技術(shù)制備而得；動(dòng)物源性TSBAb單克隆抗體通過(guò)將人工獲得的TSHR-B亞基蛋白注入動(dòng)物體內(nèi)的方法獲取。相對(duì)人源性單克隆抗體，動(dòng)物源性單克隆抗體的制備操作較簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)周期短，經(jīng)費(fèi)較低，易于實(shí)現(xiàn)，可用于初期實(shí)驗(yàn)。通過(guò)TSHR-B亞基蛋白獲得的TSBAb單克隆抗體，除可用于研究TSBAb與TSHR結(jié)合的分子生物學(xué)機(jī)制外，還可用于TSBAb檢測(cè)手段的研發(fā)及探索AITD的發(fā)病機(jī)制及其診斷治療。

3.4 TSBAb檢測(cè)對(duì)于妊娠期婦女及新生兒的意義 當(dāng)妊娠期婦女合并自身免疫性甲減時(shí)，其體內(nèi)TSBAb常為陽(yáng)性，并可通過(guò)胎盤影響胎兒體內(nèi)甲狀腺激素平衡，導(dǎo)致新生兒甲減[41]。對(duì)妊娠合并自身免疫性甲減的婦女進(jìn)行TSBAb檢測(cè)，可以評(píng)估新生兒的甲狀腺功能，并且對(duì)新生兒是否會(huì)患有暫時(shí)性甲減具有重要的預(yù)測(cè)意義。最新研究表明，妊娠期Graves病患者的TSAb水平總體呈下降趨勢(shì)，而TSBAb水平呈升高趨勢(shì)，妊娠期TSBAb水平的增加可能有助于妊娠期甲亢的緩解[42]。在妊娠期婦女中開(kāi)展對(duì)上述現(xiàn)象的研究，有助于探索免疫療法以實(shí)現(xiàn)AITD的病情緩解及新生兒甲減的預(yù)防。

4 小 結(jié)

AITD的主要病因之一是TRAb升高，其中TSBAb可以通過(guò)與TSHR-B亞基相互作用介導(dǎo)甲減相關(guān)的AITD的發(fā)生與發(fā)展。開(kāi)展有關(guān)TSHR-B亞基的結(jié)構(gòu)和功能、B亞基與TSBAb的關(guān)系及其應(yīng)用的研究，對(duì)深入探討AITD的診斷、治療、預(yù)后評(píng)估及發(fā)病機(jī)制具有重要意義，有望為建立新的AITD診斷和治療模式提供參考依據(jù)。