鄭韻英,梁敏麗,莫柳艷,勞燕芹,胡漢嬌

(北部灣大學(xué)石油與化工學(xué)院,廣西 欽州 535011)

辣木籽為辣木的種子,呈球狀,直徑大概8 mm,其種子殼為褐色,有三棱,在種子的基部有膜質(zhì)的翅[1]。辣木籽營養(yǎng)豐富,大量研究表明,辣木含有多種營養(yǎng)化學(xué)物質(zhì)及人體所需的生命元素,如P、K、Mg、Na、Ca、Fe、Cu、Zn、Se 等元素[2]。辣木籽還有凈化水源[3]、抗菌[4]、抗癌[5]、抗病毒、抗氧化、護(hù)肝[6]、降三高[7-8]等功效。辣木籽中的各成分具有一定的生理和藥理作用,其中多肽具有抗氧化性、降血壓等功能和易吸收、無毒副作用等優(yōu)點(diǎn),廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品等行業(yè)[9]。

目前國內(nèi)外對于生物多肽的提取方法主要有:酶解法[10]、堿溶酸沉法[11]、超聲波提取法[12]、微生物發(fā)酵法[13]等。如張靜等[14]用堿性蛋白酶直接水解制備得到花蕓豆多肽。周麗卿[15]采用堿溶酸沉法提取鷹嘴豆多肽獲得了較好的提取效果。聶艷峰等[16]在直接酶解的基礎(chǔ)上加入了超聲輔助功能來提取多肽以達(dá)到優(yōu)化的目的。牟金秀[17]采用微生物發(fā)酵法對玉米多肽進(jìn)行提取,獲得較高的轉(zhuǎn)化率。目前,對辣木籽的研究主要集中在蛋白質(zhì)提取、油脂提取、營養(yǎng)功能、脂肪酸組成、多糖和多酚等方面,對辣木籽多肽進(jìn)行提取的報(bào)道較少。本研究選用脫脂后的辣木籽粉為原料,采用超聲波輔助酶解法提取辣木籽多肽,為辣木籽功能化產(chǎn)品的生產(chǎn)提供參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料:脫脂辣木籽粉(廣西習(xí)緣辣木有限公司),Gly-Gly-Tyr-Arg 標(biāo)準(zhǔn)品(上海麥克林生化科技有限公司);堿性蛋白酶(北京譜析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司);其余試劑均為優(yōu)級純試劑。

儀器:HR/T16M 臺式高速冷凍離心機(jī)(湖南郝西儀器裝備有限公司);KQ-300DE 數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);UV-2600紫外可見分光光度計(jì)(島津公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

參考張靜等[14]關(guān)于多肽標(biāo)準(zhǔn)曲線試驗(yàn)的方法,取一定量由100%三氯乙酸溶液稀釋成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的TCA 溶液,依次配制0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28 mg/mL 的Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液;從10 mL 容量瓶中分別取6 mL 四肽標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL 離心管,同時(shí)加入4 mL 雙縮脲試劑,借助漩渦混合器使其混合均勻,靜置0.5 h 后于3 000 r/min 條件下離心5 min。測定吸光值,以肽的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)x(mg/mL),吸光值為縱坐標(biāo)y,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 工藝流程

脫脂辣木籽粉→酶解提取→滅酶→辣木籽多肽酶解液→去蛋白→多肽含量測定。

1.2.3 多肽含量的測定

將經(jīng)過去蛋白的上清液轉(zhuǎn)至50 mL 比色管中,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的三氯乙酸水溶液定容到刻度線,搖晃使其混合。用10 mL 規(guī)格的移液槍從上述50 mL 溶液中移取6.0 mL 置于10 mL 離心管中(空白用5%TCA 代替);用5 mL 規(guī)格的移液槍移取4.0 mL 雙縮脲試劑加入,混合均勻后孵育30 min。在高速離心機(jī)3 000 r/min 條件下離心5 min,取上清液于540 nm 下測定吸光值,對照Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線求得所測樣品溶液中多肽的質(zhì)量濃度C(mg/mL),進(jìn)而可求得樣品中多肽的含量。

式中:y表示樣品溶液中多肽的質(zhì)量濃度,mg/mL;C表示標(biāo)準(zhǔn)曲線中得到的多肽質(zhì)量濃度,mg·mL;n表示稀釋倍數(shù)。

1.2.4 堿性蛋白酶超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉單因素研究

1.2.4.1 超聲溫度的確定

控制料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲功率為240 W、酶添加量為1.75%、酶解pH 為10、酶解時(shí)間為60 min,超聲溫度為30、35、40、45 和50 ℃時(shí)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.4.2 超聲功率的確定

控制料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲功率為240 W、酶添加量為1.75%、酶解pH 為10、酶解時(shí)間為60 min、超聲溫度為40 ℃,探究超聲功率為150、180、210、240 和270 W 時(shí)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.4.3 酶添加量的確定

控制實(shí)驗(yàn)過程中的料液比、超聲溫度、功率、酶解pH 以及時(shí)間分別為1 ∶40(g/mL)、40 ℃、240 W、10、60 min,探究酶添加量分別為0.75%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、2%、2.25%時(shí),對多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.4.4 超聲時(shí)間的確定

控制其他變量一致:料液比為1 ∶40(g/mL)、超聲溫度為40 ℃、超聲功率為240 W、酶解pH 為10、酶添加量為2%,探究超聲時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min 和70 min 時(shí)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.4.5 pH 值的確定

控制其他變量一致,料液比為1 ∶40(g/mL),設(shè)定超聲波的參數(shù)為定值:溫度40 ℃、功率240 W、時(shí)間40 min,酶添加量為2%。探究pH 分別為7、8、9、10、11、12 時(shí)對多肽質(zhì)量濃度的影響。

1.2.5 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn),選出超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉效果影響較大的四個(gè)因素:超聲溫度(A)、超聲功率(B)、酶添加量(C)、pH(D)為自變量,以多肽含量作為評價(jià)指標(biāo)來確定影響的水平,設(shè)計(jì)L9(34)正交表進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)(見表1)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Origin 2021 軟件處理數(shù)據(jù)繪圖,正交試驗(yàn)用正交設(shè)計(jì)助手3.1 軟件。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)品繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線圖(見圖1),得到回歸方程y=0.134 9x-0.000 21,R2=0.997 0。

圖1 Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 堿性蛋白酶超聲輔助酶解脫脂辣木籽粉最優(yōu)條件篩選

2.2.1 超聲溫度的選擇

如圖2所示,溫度在30～40 ℃時(shí),由于溫度的提高,可以使分子運(yùn)動(dòng)加快,從而使酶活性增加,多肽質(zhì)量濃度呈線性上升趨勢;在40～50 ℃時(shí),多肽質(zhì)量濃度呈下降趨勢,這是由于蛋白酶空間結(jié)構(gòu)被破壞,部分酶變性失活。堿性蛋白酶的活性受到溫度的影響較大,溫度太高或太低都會(huì)使酶解反應(yīng)的效果變得不理想。因此,選擇溫度范圍為35～45 ℃較適宜。

圖2 超聲溫度對多肽含量的影響

2.2.2 超聲功率的選擇

如圖3所示,超聲功率在150～240 W 時(shí),由于超聲作用可以使分子運(yùn)動(dòng)加快從而使酶活性增加,多肽質(zhì)量濃度呈線性上升趨勢;在超過240 W之后,多肽質(zhì)量濃度呈下降趨勢。原因是過高的超聲強(qiáng)度導(dǎo)致部分溶液受熱的程度加快,破壞了多肽結(jié)構(gòu)。與此同時(shí),超聲產(chǎn)生的空化作用使酶結(jié)構(gòu)被損壞,降低了酶活力。因此,選擇超聲功率范圍為210 ～270 W 較適宜。

圖3 超聲功率對多肽含量的影響

2.2.3 堿性蛋白酶酶添加量的選擇

如圖4所示,酶添加量為0.75%～2.25%。由于酶與底物結(jié)合的能力增大促進(jìn)了酶解效果,多肽質(zhì)量濃度呈穩(wěn)定上升趨勢;在酶添加量2%之后,多肽質(zhì)量濃度呈下降趨勢。原因是酶和底物的結(jié)合已經(jīng)達(dá)到上限,這時(shí)過多的酶會(huì)抑制酶促效果。因此,酶的添加量在1.75%～2.25%較適宜。

圖4 酶添加量對多肽含量的影響

2.2.4 超聲時(shí)間的選擇

如圖5所示,超聲時(shí)間在不斷增加,酶和底物接觸的面積越發(fā)充分,同時(shí),超聲的輔助蛋白酶的作用位點(diǎn)逐漸顯露出來,促進(jìn)了酶解作用,多肽質(zhì)量濃度呈迅速升高趨勢;在40 min 之后,多肽質(zhì)量濃度呈下降趨勢,原因是酶解產(chǎn)物的累積和過度酶解成了寡肽。因此,選擇超聲時(shí)間為40 min。

圖5 超聲時(shí)間對多肽含量的影響

2.2.5 pH 的選擇

如圖6所示,堿性蛋白酶的酶解性能、水解效率的提升需要適宜的堿性環(huán)境,但過高的堿濃度會(huì)使蛋白酶本體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,使其失活。pH 會(huì)顯著影響酶的活性,所以隨著pH 的增大多肽產(chǎn)生了先增后降的質(zhì)量濃度變化,在pH 為10 時(shí)表現(xiàn)出最好的酶解性能。因此,選擇pH 的范圍宜為8～10。

圖6 pH 對多肽含量的影響

2.3 正交試驗(yàn)分析

由表2的極差值可判斷出以上所選取的4 個(gè)因素都對辣木籽多肽的提取量有一定的影響。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

其大小順序?yàn)锽＞A＞C＞D,即這幾個(gè)因素中影響最大的是超聲功率,其次是超聲溫度,再次是酶添加量,影響最小的是pH。正交實(shí)驗(yàn)后各因素理論最優(yōu)組合為A2B2C2D3,和單因素實(shí)驗(yàn)做出來的最優(yōu)結(jié)果一致,即超聲溫度為40 ℃、酶添加量為2%、超聲功率為240 W、pH 為10。選用正交實(shí)驗(yàn)中所得的最佳組合條件進(jìn)行平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),得到辣木籽多肽為9.12 mg/mL,優(yōu)化方案具有一定的穩(wěn)定性和可行性。

3 小結(jié)

本實(shí)驗(yàn)以脫脂辣木籽粉為原料,研究了超聲波輔助酶解法在不同的超聲條件(溫度、功率、時(shí)間)、pH 和酶添加量因素下對多肽質(zhì)量濃度的影響。在單因素的基礎(chǔ)上,設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),得到堿性蛋白酶提取脫脂辣木籽多肽的提取工藝在料液比1 ∶40(g/mL)、超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間40 min、酶添加量2%、功率240 W、pH=10 的情況下,多肽質(zhì)量濃度高達(dá)9.12 mg/mL。本研究可為新種類功能化的多肽制備提供新思路,可為后續(xù)多肽的純化、多肽分子量的分布、抗氧化性等性能研究提供理論參考。