姚春曉,樊俊洋,李倩楠 ，郝瀟雅，楊明凡，2，3，常 娟，2，寧長申，2，張紅英，2，3

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，鄭州 450002；2. 河南省動物性食品安全重點實驗室，鄭州 450002；3. 河南省鄭州市中獸藥創(chuàng)制與評價重點實驗室，鄭州 450002)

【研究意義】湖羊是我國珍貴的綿羊品種，也是稀有的白色羔皮羊品種，主要產(chǎn)于浙江嘉興和太湖地區(qū)，具有耐熱、耐濕及肉質(zhì)好等優(yōu)點。在湖羊斷奶時期，由于飼養(yǎng)條件的改變，極易導(dǎo)致羔羊生長遲緩、腹瀉等，嚴(yán)重影響羔羊的生長發(fā)育[1-2]。【前人研究進(jìn)展】中藥具有毒性小、藥效強(qiáng)、無耐藥性、低殘留等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于抗菌[3]、抗病毒[4]、免疫調(diào)節(jié)[5]等方面。相較于傳統(tǒng)的煎煮中藥，益生菌發(fā)酵中藥不僅可以獲得更多的藥物成分[6]，使藥物大分子分解為更易被吸收的小分子，益生菌的存在還可以與有害菌競爭氧、營養(yǎng)成分、定植位點等，抑制有害菌的繁殖，提高動物成活率[7-8]。研究表明，中藥發(fā)酵產(chǎn)物通過抑制有害菌增殖，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高機(jī)體的生長性能與非特異性免疫力[9-10]。板藍(lán)根、黃芪是臨床應(yīng)用較多的中藥藥材，研究表明，板藍(lán)根與黃芪聯(lián)用可以提高育肥羊生產(chǎn)性能、屠宰率，改善機(jī)體的免疫功能和抗氧化性能，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，且經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后可以顯著增加板藍(lán)根、黃芪總多糖及黃芪皂苷的含量[11-12]?！颈狙芯壳腥朦c】本試驗將板芪發(fā)酵液制成日糧添加劑，飼喂羔羊觀察增重情況并借助高通量測序技術(shù)分析發(fā)酵藥液對十二指腸、空腸、回腸腸道菌群的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究為中藥提取液用于預(yù)防斷奶羔羊菌群失調(diào)、促進(jìn)羔羊生長提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及基礎(chǔ)日糧

采用單因子試驗設(shè)計, 挑選體重為13～16 kg、40日齡的羔羊(湖羊)42只，基礎(chǔ)日糧(TMR)由三木綠源畜牧有限公司提供，具體組成與營養(yǎng)水平如表1所示。

1.2 試驗菌種、發(fā)酵藥液

本試驗所用菌種包括枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、DY芽孢桿菌，均由河南省動物性食品安全重點實驗室進(jìn)行分離保存。

板芪發(fā)酵液的制備：將黃芪、板藍(lán)根飲片(二者比例2∶1)加入蒸餾水浸泡、煎煮，將藥液濃縮至1 g/mL，制成板芪水提液。分別用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、DY芽孢桿菌、混合菌株[v(枯草芽孢桿菌)∶v(地衣芽孢桿菌)=1∶1]發(fā)酵板芪水提液，37 ℃培養(yǎng)28 h，測得各菌液中有效活菌數(shù)分別為1.21×1010、1.41×1010、1.63×1010、2.18×1010、3.34×1010CFU/mL，即制得板芪發(fā)酵液。

1.3 試驗設(shè)計

將試驗動物適應(yīng)性飼喂7 d后隨機(jī)分為7組，具體試驗分組情況如表2所示。對照組飼喂基礎(chǔ)日糧，未發(fā)酵組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上每只每天添加6 g板芪提取液，發(fā)酵組則每只每天添加6 g板芪發(fā)酵液，定期清理糞便，保持圈舍衛(wèi)生，試驗期28 d。

1.4 生長性能測定

試驗期間每天計算平均日采食量。試驗開始與結(jié)束空腹測體重，計算平均日增重及料重比。

平均日增重(g/d)=[末重(g)-始重(g)]/試驗時間(d)

平均日采食量(g/d) = 總采食量(g) /試驗時間(d)

料重比= 平均日采食量(g/d)/平均日增重(g/d)

表1 TMR組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

表2 試驗動物分組及處理

1.5 小腸絨毛形態(tài)觀察

試驗結(jié)束后宰殺羔羊，收集十二指腸、空腸、回腸，使用2.5%的多聚甲醛-戊二醛固定液固定腸道組織，制備組織切片，觀察板芪發(fā)酵液對羔羊小腸絨毛形態(tài)的影響。

1.6 DNA提取、擴(kuò)增及測序

為探究板芪發(fā)酵液是否通過影響腸道菌群提高羔羊的生長性能,本試驗使用DNA提取試劑盒提取發(fā)酵Ⅰ組、未發(fā)酵組、對照組各3只羔羊的腸段內(nèi)容物的總基因組DNA，通過細(xì)菌共同基因16S rDNA設(shè)計引物，對提取的基因進(jìn)行擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，采用Illumina高通量測序技術(shù)對各腸段內(nèi)容物擴(kuò)增基因進(jìn)行測定(由派森諾生物科技有限公司代測)，分析腸道微生物群落的多樣性和豐度，通過LEFSe分析尋找差異菌株，初步探討板芪發(fā)酵液與腸道菌群的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用 IBM SPSS 24.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對于多個樣本的腸道分析數(shù)據(jù)處理采用Kruskal-Wallis秩和檢驗并使用事后檢驗(Dunn)對差異顯著數(shù)據(jù)進(jìn)行多重矯正，使用GraphPad Prism 8 軟件處理分析后的數(shù)據(jù)，置信區(qū)間為95%，其中P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 板芪發(fā)酵液對羔羊生長性能的影響

如表 3 所示，發(fā)酵Ⅰ組平均日增重為208.57 g/d，極顯著高于對照組(P<0.01)，顯著高于未發(fā)酵組(P<0.05)，其它各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表3 板芪發(fā)酵液對羔羊生長性能的影響

2.2 板芪發(fā)酵液對羔羊小腸絨毛形態(tài)的影響

各處理組的小腸絨毛寬度、隱窩深度均無顯著差異(圖1)。與對照組相比，發(fā)酵Ⅰ組(枯草芽孢桿菌發(fā)酵板芪提取液)大幅提升羔羊十二指腸的絨毛長度?；啬c的絨毛長度極顯著高于未發(fā)酵組(P<0.01)，顯著高于發(fā)酵Ⅱ組、發(fā)酵Ⅳ組、發(fā)酵Ⅴ組以及對照組(P<0.05)，對于空腸則沒有改變(表4)。說明，枯草芽孢桿菌發(fā)酵板芪提取液提升羔羊的生長性能可能與提高小腸絨毛長度有直接關(guān)系。

圖1 羔羊小腸絨毛形態(tài)(×100)Fig.1 Small intestine villi morphology of lambs(×100)

表4 板芪發(fā)酵液對羔羊小腸絨毛長度的影響

2.3 板芪發(fā)酵液對羔羊腸道菌群的影響

2.3.1 板芪發(fā)酵液對羔羊腸道菌群OTU分析 為進(jìn)一步探究板芪發(fā)酵液對羔羊腸道菌群的影響，本研究采用通過高通量測序技術(shù)對發(fā)酵發(fā)酵Ⅰ組、未發(fā)酵組和對照組綿羊的腸道菌群進(jìn)行測定，按照97%的序列相似度進(jìn)行OUT劃分并繪制韋恩圖。如圖2所示，3個處理組共有的OTU數(shù)量為701，其中發(fā)酵Ⅰ組OTU數(shù)量最大。說明，發(fā)酵中藥可以增加羔羊腸道菌群豐度。

2.3.2 板芪發(fā)酵液對羔羊十二指腸、空腸和回腸菌群Alpha多樣性的影響 Alpha多樣性可在一定程度上反映樣本內(nèi)的物種豐富度、多樣性、均勻度，通常以Chao1指數(shù)表示物種豐富度，以Simpson 指數(shù)表示物種的多樣性，以Goods coverage指數(shù)、Faith’spd指數(shù)和Pielou evenness指數(shù)分別表示物種覆蓋度、物種進(jìn)化多樣性和均勻度。

圖2 羔羊腸道菌群OUT聚類分析Fig.2 OTU cluster analysis of lamb intestinal flora

從圖3可以看出，發(fā)酵Ⅰ組十二指腸菌群的Chao1指數(shù)和Simpson指數(shù)顯著高于對照組(P<0.05)，空腸和回腸的Simpson指數(shù)顯著高于未發(fā)酵組(P<0.05)。說明，發(fā)酵Ⅰ組可以顯著提升羔羊十二指腸的菌群豐度及各腸段的菌群多樣性。

圖3 羔羊十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)腸道菌群Alpha多樣性分析Fig.3 Alpha diversity analysis of intestinal flora in duodenal (A), jejunum (B) and ileum(C) of lambs

圖4 十二指腸(A)、空腸(B)、回腸(C)腸道菌群Beta多樣性分析Fig.4 Beta diversity analysis of intestinal flora in duodenum (A), jejunum (B) and ileum (C)

2.3.3 板芪物發(fā)酵液對羔羊十二指腸、空腸、回腸菌群Beta多樣性的影響 Beta多樣性可以比較不同樣本間物種組成的差異性，由于各腸段菌群數(shù)據(jù)復(fù)雜，通常使用主坐標(biāo)分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理。將發(fā)酵Ⅰ組、未發(fā)酵組和對照組的十二指腸、空腸、回腸測序結(jié)果進(jìn)行基于Unweighted unifrac距離的PCoA分析(主坐標(biāo)分析)。從圖4可知，各處理組中十二指腸、回腸樣本比較集中，表明組內(nèi)各樣本的差異較小。說明，發(fā)酵或未發(fā)酵中藥對羔羊腸道菌群的改變較為穩(wěn)定，空腸樣本較分散，但未出現(xiàn)交叉。

2.3.4 板芪發(fā)酵液對羔羊十二指腸、空腸、回腸菌群構(gòu)成門水平的影響 從表5可知，對照組羔羊十二指腸變形菌門(Proteobacteria)的豐度最高(62%)，飼喂板芪發(fā)酵液后羔羊的十二指腸變形菌門顯著降低，同時，放線菌門(Actinobacteria)與厚壁菌門(Fimicutes)的菌群豐度升高，發(fā)酵中藥對空腸、回腸菌群構(gòu)成沒有顯著影響。

2.3.5 板芪發(fā)酵液對羔羊十二指腸、空腸、回腸菌群構(gòu)成屬水平的影響 從表6可知，對照組十二指腸菌群內(nèi)貪銅菌屬(Cupriavidus)的豐度最高(53%)，飼喂發(fā)酵或未發(fā)酵板芪液后貪銅菌屬豐度降低，但丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)豐度升高；板芪發(fā)酵液組提高了羔羊回腸蘇黎世桿菌屬Turicibacter菌豐度，單用中藥組志賀菌屬(Shigella)的豐度增加。說明，板芪發(fā)酵液可以提升羔羊腸道有益菌的豐度，降低致病菌的豐度。

2.3.6 板芪發(fā)酵液對羔羊十二指腸菌群差異組成差異分析 板芪發(fā)酵液可以提升腸道菌群豐度與多樣性，其中對十二指腸菌群的影響最為顯著。為進(jìn)一步評估板芪發(fā)酵液對腸道菌群的影響，本試驗對發(fā)酵Ⅰ組、未發(fā)酵組、對照組的十二指腸進(jìn)行Lefse分析(設(shè)定LDA>3，表7)。

Lefse分析共獲得16個生物標(biāo)記物，其中發(fā)酵Ⅰ組顯著提高放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)藻菌門(Tenericutes)、小桿菌屬(Mogibacterium)、L7A-E11菌屬的相對豐度(P<0.05)；未發(fā)酵組顯著提高迷蹤菌門(Elusimicrobia)相對豐度(P<0.05)；不動桿菌屬(Acinetobacter)則在對照組中顯著富集(P<0.05)。說明板芪發(fā)酵液可能通過提升上述功能菌的豐度提升羔羊的生長性能。

表5 門水平下的菌群分布

表7 羔羊十二指腸菌群組成差異分析

3 討 論

3.1 板芪發(fā)酵液對羔羊小腸絨毛形態(tài)的影響

本研究給羔羊飼喂不同益生菌發(fā)酵板芪提取液，以期篩選可以促進(jìn)羔羊生長的發(fā)酵中藥飼料添加劑。發(fā)酵Ⅰ組(枯草芽孢桿菌發(fā)酵板芪提取液)平均日增重208.57 g/d，比空白對照組高75.9%。從料重比來看，發(fā)酵Ⅰ組最低，只有4.38，是空白對照組的73.5%，說明黃芪、板藍(lán)根水提液經(jīng)過發(fā)酵后可以明顯提高羔羊的日增重并同時可以提高飼料轉(zhuǎn)化率，這與已有報道基本一致[13-16]。小腸是消化吸收的主要部位，本研發(fā)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵Ⅰ組顯著提高羔羊回腸絨毛長度，對十二指腸絨毛長度提升效果最為明顯，故飼喂枯草芽孢桿菌板芪發(fā)酵液可提升羔羊腸道的吸收功能，這為料重比的降低提供了有力的支撐。

3.2 板芪發(fā)酵液對羔羊腸道菌群的影響

腸道菌群是動物機(jī)體的重要組成部分，研究表明腸道菌群不僅與動物生長性能、腸道免疫相關(guān)[17]，更能通過“腸-腦軸”、“腸肝軸”、“腸-肺軸”、“腸-腎軸”等影響全身的組織器官[18-21]。為探究板芪發(fā)酵液對羔羊腸道菌群的影響，對發(fā)酵組、未發(fā)酵組、對照組進(jìn)行了腸道菌群測定，結(jié)果顯示發(fā)酵Ⅰ組可以穩(wěn)定提升羔羊腸道菌群豐度與多樣性，門、屬水平分析同樣證明了這一點，這表明板芪發(fā)酵液可以提升羔羊腸道菌群多樣性，預(yù)防腸道菌群失調(diào)，這與Wang等[22]的研究結(jié)果一致。放線菌門可分泌多種活性成分，如酶、抑菌物質(zhì)、抗生素等，內(nèi)含多種益生菌(如雙歧桿菌等)，同時在分解纖維素中具有較大作用[23]；軟壁菌門具有促進(jìn)脂質(zhì)代謝和高密度脂蛋白的能力[24]；小桿菌屬可形成苯乙酸，是反芻動物腸道菌降解纖維素的必需成分[25]；不動桿菌屬為條件致病菌，可引起肺炎、腹膜炎、腦膜炎、心內(nèi)膜炎，且對大多數(shù)抗生素均不敏感[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵Ⅰ組顯著提高放線菌門、軟壁菌門、小桿菌屬的相對豐度，顯著下調(diào)對照組中富集的不動桿菌屬。因此推測，飼喂枯草芽孢桿菌發(fā)酵板芪提取液顯著提高羔羊的平均日增重，降低料重比，可能與纖維素消化相關(guān)菌(放線菌門、小桿菌屬)、脂肪合成相關(guān)菌(軟壁菌門)的豐度上升有直接關(guān)系。

4 結(jié) 論

枯草芽孢桿菌發(fā)酵板芪提取液可以提高腸絨毛長度與菌群多樣性，提高放線菌門、軟壁菌門、小桿菌屬等有益菌，降低不動桿菌屬等致病菌，為發(fā)酵中藥預(yù)防斷奶羔羊菌群失調(diào)、提高羔羊生長性能提供理論依據(jù)。