盧文潔，尹桂芳，王艷青，孫道旺，隆文杰，李程鵬，陳 佳，王莉花

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實驗室/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實驗室，昆明 650205)

【研究意義】蕎麥屬蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬(Fagopyrum)一年生或多年生雙子葉植物。蕎麥具有耐寒和耐貧瘠的優(yōu)良特性，在云南的高寒、冷涼地區(qū)廣泛種植。蕎麥含豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)物質(zhì)[1]，尤其富含具有多種功效的生物黃酮類物質(zhì)[2]。黃酮類活性物質(zhì)不僅對葡萄糖苷酶、淀粉酶等多種酶的活性有抑制作用[3-6]，并具有降血壓、降糖、降脂、降膽固醇、抗氧化、抗癌、抗腫瘤、清除自由基、抑菌消炎等功效[7-10]。蕎麥?zhǔn)且环N藥用和食用的同源作物，主要用于生產(chǎn)加工營養(yǎng)食品和功能食品，并且越來越受到人們的認(rèn)可和青睞?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國內(nèi)研究報道的蕎麥病害主要有草莖點(diǎn)霉(Phomaherbarum)引起的輪紋病[11],蓼白粉菌(Erysiphepolygoni)引起的白粉病[12],鏈格孢(Alternariaalternata)引起的葉枯病[13],異形柱隔孢(Ramulariaanomala)引起的白霉病[14],稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)引起的褐斑病[15]以及南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)和花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)引起的根結(jié)線蟲病[16]。國外研究報道的蕎麥病害主要有菌核菌(Sclerotiniasclerotiorum)引起的根冠腐爛病[17]，霜霉菌(Peronospora)引起的霜霉病[18]，菌核菌(Sclerotinia)引起的幼苗根腐病[19],立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)引起的莖潰瘍病[20]等。研究者對危害蕎麥的鏈格孢[13]、異形柱隔孢[14]、稻黑孢菌[15]、草莖點(diǎn)霉[21]等病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究， 闡明了病原菌在不同培養(yǎng)基、pH、碳源、氮源、光照等培養(yǎng)條件下的生長特性，為有效防控病害提供了重要的理論依據(jù)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物所蕎麥課題組調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在云南省澄江縣蕎麥種植基地發(fā)生了蕎麥莖枯病。該病害為蕎麥生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的病害之一，隨著澄江地區(qū)蕎麥種植面積的不斷擴(kuò)大，該病害發(fā)生危害逐年加重。據(jù)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該病害一般在6月中下旬開始發(fā)病，發(fā)病較為輕微，在7—8月雨水多時發(fā)病加重，植株發(fā)病率可高達(dá)20%左右。蕎麥植株一旦感染該病害，莖稈易折斷倒伏，給蕎麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為明確蕎麥莖枯病的病原種類，本研究開展了病原菌的分離和純化、形態(tài)學(xué)觀察、致病性測定和分子生物學(xué)分析，并測定病原菌的生物學(xué)特性，為蕎麥莖枯病的綜合防控技術(shù)研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

課題組于云南省澄江縣蕎麥種植基地調(diào)查并記錄病害的發(fā)病部位、癥狀特征，采集蕎麥莖枯病樣品，并對樣品進(jìn)行分離培養(yǎng)。取蕎麥莖稈發(fā)病部位，經(jīng)消毒處理后置于PDA培養(yǎng)基平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)，純化菌株后于4 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性測定

按照柯赫氏法則對分離菌株進(jìn)行致病性測定。將分離菌株在PDA 培養(yǎng)基上28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，取培養(yǎng)的菌絲對健康蕎麥植株莖部進(jìn)行活體接種，以接種PDA瓊脂塊作為對照。接種48 h后取掉接種的菌絲餅和對照處理的PDA瓊脂塊，每天觀察接種部位的發(fā)病情況。

1.3 孢子的形態(tài)觀察

用PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)菌株M38，28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，每天觀察菌落的形態(tài)特征；取少許菌絲制片，在顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子、厚垣孢子、產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征。

1.4 rDNA-ITS序列分析

于28 ℃恒溫條件下，用PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)菌株M38，刮取菌絲，用植物真菌DNA試劑盒提取菌株M38菌絲基因組DNA。PCR擴(kuò)增采用真菌引物對ITS1/ITS4，引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序參照盧文潔等[13]的研究方法。利用回收試劑盒回收純化菌株DNA片段，經(jīng)華大基因生物公司測序，在NCBI 上進(jìn)行DNA序列BLAST 同源性比對，DNA序列分析采用軟件MEGA 6.0，構(gòu)建菌株M38的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 菌株M38生物學(xué)特性的測定

1.5.1 培養(yǎng)基對菌株M38生長的影響 取菌絲餅(直徑6 mm)，分別移植于PSA(馬鈴薯蔗糖瓊脂)培養(yǎng)基、PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基、OMA(燕麥片瓊脂)培養(yǎng)基、Czapek(查彼)培養(yǎng)基、CMA(玉米粉瓊脂)培養(yǎng)基、CA(胡蘿卜)培養(yǎng)基、SDA(沙氏葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基的平板中央，對照為WA(水瓊脂)培養(yǎng)基。每個處理重復(fù)5 次，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d，測量菌落直徑大小采用十字交叉法。菌絲餅的大小、不同處理的重復(fù)次數(shù)、培養(yǎng)溫度(除不同溫度處理)、培養(yǎng)天數(shù)及測量菌落直徑的方法下同。

1.5.2 溫度對菌株M38生長的影響 將菌絲餅放于PDA培養(yǎng)基的平板中央，分別在5、10、15、20、25、28、30、35 ℃共8個處理的不同溫度下恒溫培養(yǎng)，觀察菌落，測量直徑。

1.5.3 菌絲致死溫度的測定 取菌絲餅于消毒試管中，加入2.5 mL ddH2O，分別在40、45、50、55、60、61、62、63、65 ℃的水浴中恒溫處理10 min后取出，待菌絲餅冷卻，移至PDA培養(yǎng)基的平板中央，恒溫培養(yǎng)，觀察不同溫度處理的菌絲能否生長。

1.5.4 pH 對菌株M38生長的影響 分別用HCl溶液(1 mol/L)和NaOH 溶液(1 mol/L)將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)為4.0～11.0，共8個處理，取直徑大小為6 mm的菌絲餅，置于不同pH的PDA培養(yǎng)基平板中央恒溫培養(yǎng)，菌落觀察，測量直徑。

1.5.5 光照對菌株M38生長的影響 取菌絲餅置于PDA培養(yǎng)基的平板中央，分別在連續(xù)黑暗(24 h)、光暗交替(12 h光照/12 h黑暗)、連續(xù)光照(24 h) 3種不同光照處理下恒溫培養(yǎng)，觀察菌落特征，測量菌落直徑。

1.5.6 碳源、氮源對菌株M38生長的影響 用葡萄糖、乳糖、可溶性淀粉、木糖、甘露糖、果糖、蔗糖、麥芽糖8種碳源配置濃度為2%的不同碳源培養(yǎng)基；用硝酸鉀、氯化銨、苯丙氨酸、硫酸銨、硝酸鈉、胱氨酸、尿素、蛋白胨、牛肉浸膏9種氮源配置濃度為0.2%的不同氮源培養(yǎng)基。將菌絲餅放于不同碳源、氮源的培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)，菌落觀察，測量直徑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

生物學(xué)特性的實驗數(shù)據(jù)分析采用軟件SPSS 23.0，顯著性分析采用新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

蕎麥莖枯病主要是由病菌侵染危害植株莖部引起。發(fā)病初期，蕎麥莖部出現(xiàn)小面積褐色不規(guī)則病斑，隨著病情發(fā)展，病斑沿上、下莖部及側(cè)枝擴(kuò)展蔓延，受害部位呈深褐色至黑色(圖1-A)，高溫高濕條件下發(fā)病嚴(yán)重，病斑快速蔓延擴(kuò)散，莖稈、葉片萎蔫干枯或腐爛(圖1-B)，導(dǎo)致蕎麥莖稈折斷，植株倒伏，給蕎麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失。

2.2 致病性測定

菌株M38接種蕎麥莖部5 d后，接種點(diǎn)可見褐色不規(guī)則小病斑，接種20 d后，病斑沿向上、下莖部擴(kuò)展蔓延，病斑呈深褐色或黑色，接種蕎麥莖稈的發(fā)病癥狀與蕎麥莖枯病的田間癥狀相似(圖2-A)，接種PDA瓊脂塊(CK)的蕎麥莖稈無發(fā)病癥狀(圖2-B)。接種發(fā)病的蕎麥莖稈用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得的菌株與接種菌株M38的孢子形態(tài)特征完全一致，由此可見，接種菌株M38為蕎麥莖枯病的致病病原菌。

A、B：田間癥狀A(yù) and B: Symptoms of stem blight of buckwheat in the field圖1 蕎麥莖枯病癥狀Fig.1 Symptoms of stem blight of buckwheat

2.3 培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)特征

用PDA培養(yǎng)基活化培養(yǎng)菌株M38，5 d后菌落直徑為85～90 mm。菌落呈圓形，菌絲初期為白色，生長至后期，絨毛狀氣生菌絲較濃密，菌落正面呈淡黃色(圖3-A)，背面為黃色(圖3-B)。在Bilay培養(yǎng)基上菌絲呈白色，菌落稀薄(圖3-C，3-D)。在米飯培養(yǎng)基上菌絲呈米白色，菌落緊貼培養(yǎng)基(圖3-E，3-F)。分生孢子產(chǎn)生于細(xì)長不分枝的瓶梗，大型分生孢子不彎曲或稍彎曲，鐮刀形，中部細(xì)胞顯著膨大，頂端細(xì)胞漸細(xì)呈鉤狀或錐形，基胞有足跟，多為3～5個隔膜，大小為 (17～45.5)μm ×(1.6～5.5)μm(圖4-A，4-B，4-C)；小型分生孢子極少，單胞，透明，橢圓形或長矩圓形(圖 4-C)；厚垣孢子呈球形，在菌絲間單生或串生，大小為7～10 μm(圖 4-D，4-E，4-F)。產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，分枝或不分枝(圖4-G，4-H，4-I)。根據(jù)形態(tài)特征初步鑒定菌株M38為鐮刀菌屬(Fusarium)真菌[22]。

A：接種發(fā)病癥狀；B：對照A: The symptoms after inoculation; B: Control圖2 接種M38菌株后蕎麥莖枯病的癥狀Fig.2 Symptoms of stem blight of buckwheat after inoculating strain M38

2.4 蕎麥莖枯病菌株M38分子鑒定

應(yīng)用真菌引物對ITS1/ITS4擴(kuò)增菌株M38的菌絲基因組DNA，測序獲得長度為517 bp的rDNA-ITS序列(登錄號：KP205542.1)。將該序列與GenBank上已發(fā)表的禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、茄鐮刀菌(Fusariumsolani)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、木賊鐮刀菌(Fusariumequiseti)等菌株序列進(jìn)行比對，菌株M38與木賊鐮刀菌的2個菌株(MG736112.1和 MG736187.1)序列的同源性均為100%。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征以及rDNA-ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖5)，鑒定該病原菌為鐮刀菌屬(Fusarium)木賊鐮刀菌(F.equiseti)。

A～B：PDA培養(yǎng)基正、反面菌落形態(tài)；C～D：Bilay培養(yǎng)基正、反面菌落形態(tài)； E～F：米飯培養(yǎng)基正、反面菌落形態(tài)A-B: Colony morphology of the front side on the PDA plate and of the reverse side on the PDA plate; C-D: Colony morphology of the front side on the Bilay plate and of the reverse side on the Bilay plate; E-F: Colony morphology of the front side on the rice plate and of the reverse side on the rice plate圖3 蕎麥莖枯病病原菌的菌落形態(tài)Fig.3 Colony morphology of the pathogen causing stem blight of buckwheat

A～B：大型分生孢子；C：大型分生孢子和小型分生孢子；D～F：厚垣孢子；G～I(xiàn): 產(chǎn)孢細(xì)胞A-B: Macroconidia; C: Macroconidia and Microconidia; D-F: Chlamydospores; G-I: Conidiogenous cells圖4 蕎麥莖枯病病原菌的孢子形態(tài)Fig.4 The spore morphology of the pathogen of buckwheat stem blight

圖5 蕎麥莖枯病木賊鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic of Fusarium equiseti of buckwheat stem blight

2.5 菌株M38的生物學(xué)特性

2.5.1 培養(yǎng)基對菌株M38生長的影響 在OMA培養(yǎng)基上菌絲生長最快，平均菌落直徑大小為65.51 mm，但在該培養(yǎng)基上菌落稀薄，菌絲緊貼培養(yǎng)基。菌絲在培養(yǎng)基PDA和PSA生長較快，平均菌落直徑大小分別為61.69、57.93 mm，且2種培養(yǎng)基上菌落緊致，菌絲疏松茂密，因此培養(yǎng)基PDA和PSA最適菌絲生長。菌絲在CA、Czapek培養(yǎng)基上生長較慢，平均菌落直徑大小分別為56.20、54.45 mm。菌絲在CMA培養(yǎng)基上生長最慢，平均菌落直徑大小為50.78 mm(表1)。

2.5.2 溫度對菌株M38生長的影響 菌絲在28 ℃下生長最快，菌落致密，平均菌落直徑大小為61.23 mm，與其他溫度處理存在顯著差異，因此最適菌絲生長的溫度為28 ℃。菌絲在25、30 ℃溫度下生長較快，平均菌落直徑大小分別為59.91、57.94 mm。菌絲在5 ℃下生長最慢，平均菌落直徑大小為16.86 mm(表1)。

將分別在40、45、50、55、60、61、62、63、64 ℃水浴恒溫處理10 min的菌絲餅接種于PDA培養(yǎng)基平板，于28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后9種溫度水浴處理的菌絲餅均長出菌絲，在65 ℃水浴恒溫處理10 min的菌絲餅接種于PDA培養(yǎng)基平板，于28 ℃恒溫條件下培養(yǎng)10 d，菌絲未能長出，由此可見，菌絲的致死溫度為65 ℃(時長10 min)。

2.5.3 pH對菌株M38生長的影響 pH 4.0～11.0內(nèi)菌絲均能生長，其中在pH 8.0時菌絲生長最快，平均菌落直徑大小為68.60 mm，生長速度明顯快于其他處理，且菌落致密，表明pH 8.0最適菌絲生長。其次，菌絲在pH 9.0～11.0時生長較快，平均菌落直徑大小依次為66.42、66.39、66.34 mm。在pH 4.0時，菌絲生長最慢，平均菌落直徑大小為38.76 mm(表2)。

2.5.4 光照對菌株M38生長的影響 菌絲在連續(xù)黑暗條件下生長最快，平均菌落直徑大小為59.55 mm，其次為光暗交替(12 h光照/12 h黑暗)，平均菌落直徑大小為57.19 mm，連續(xù)光照條件下的平均菌落直徑最小，為53.51 mm(表2)，由此可見，連續(xù)黑暗最適菌絲生長。

表1 培養(yǎng)基、溫度對菌株M38生長的影響

表2 pH、光照對菌株M38生長的影響

表3 碳源、氮源對菌株M38生長的影響

2.5.5 碳源對菌株M38生長的影響 菌絲在以可溶性淀粉為碳源的培養(yǎng)基上生長最快，平均菌落直徑大小為66.55 mm，生長速度快于其他碳源處理。其次，菌絲在以果糖、麥芽糖、甘露糖、葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長較快，平均菌落直徑依次為65.76、63.14、62.06、61.69 mm。乳糖碳源培養(yǎng)基的平均菌落直徑為19.98 mm(表3)，最不適宜菌絲生長。

2.5.6 氮源對菌株M38生長的影響 在硝酸鈉氮源培養(yǎng)基中菌絲生長最快，平均菌落直徑為71.16 mm。其次，菌絲在牛肉浸膏、尿素、硝酸鉀、蛋白胨4種氮源培養(yǎng)基中生長較快，其平均菌落直徑依次為66.60、65.66、62.55、61.39 mm。以硫酸銨為氮源的培養(yǎng)基最不適宜菌絲生長，平均菌落直徑為52.95 mm(表3)。

3 討 論

本研究通過觀察菌株M38分別在PDA培養(yǎng)基、Bilay培養(yǎng)基和米飯培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征，并利用顯微鏡觀察病原菌的分生孢子、厚垣孢子及產(chǎn)孢細(xì)胞的形態(tài)特征，結(jié)合分析菌株M38的rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，將該病原菌鑒定為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。木賊鐮刀菌為鐮刀菌屬真菌，寄主范圍廣，可侵染危害多種植物引起病害發(fā)生。國內(nèi)研究報道主要病害有大白菜枯萎病[23]、剛竹稈褐腐病[24]、辣木枝枯病[25]、頭花蓼梢腐病[26]、煙草根腐病[27]、北蒼術(shù)枝枯病[28]等，國外研究報道的主要病害有豇豆根腐病[29]、蘇柏葉枯病[30]、魚尾葵葉莖枯病[31]等，該病原菌引起的作物病害給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

康迅等[25]對辣木枝枯病菌株MO157的生物學(xué)特性研究發(fā)現(xiàn)，PDA和PSA培養(yǎng)基最適菌絲生長，28 ℃為最適溫度，這與本研究的結(jié)論一致；蔗糖和牛肉浸膏分別為最適菌絲生長的碳源和氮源，光照條件對菌絲生長無明顯影響，這與本研究得到的菌株M38菌絲生長最適的碳源為可溶性淀粉，氮源為硝酸鈉，連續(xù)黑暗最有利于菌絲生長的研究結(jié)論不同。任靜等[26]對頭花蓼莖枯病病原菌研究發(fā)現(xiàn)，硝酸鈉為最適病原菌菌絲生長的氮源，28 ℃最適菌絲生長，65 ℃(時長10 min)為菌絲的致死溫度，這與本研究的結(jié)果一致；頭花蓼莖枯病病原菌生長的最適碳源為果糖，與本研究結(jié)果存在差異。溫曉蕾等[28]對北蒼術(shù)枝枯病病原菌的生物學(xué)特性研究結(jié)果表明，病原菌菌絲生長的最適溫度為25～30 ℃，最適pH為8～11，這與本研究的菌株M38菌絲生長的最適溫度為28 ℃，pH為8.0，適宜在偏堿性的環(huán)境下生長結(jié)論相似；北蒼術(shù)枝枯病病原菌菌絲生長最適的培養(yǎng)基為燕麥和玉米面培養(yǎng)基，最適碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母浸出粉，與本研究的結(jié)果不同。

4 結(jié) 論

本研究通過觀察菌株M38的孢子形態(tài)特征，結(jié)合菌株M38 rDNA-ITS的序列分析，對云南蕎麥莖枯病的病原菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，明確了引起為該病害的病原菌為木賊鐮刀菌(F.equiseti)。通過測定病原菌的生物學(xué)特性，明確菌株M38的菌絲最適宜生長的培養(yǎng)基為PDA和PSA，最適宜生長的溫度為28 ℃；菌絲的致死溫度為65 ℃(時長10 min)；菌絲最適宜生長的pH為8.0，最適宜生長的光照條件為連續(xù)黑暗，最適宜生長的碳源和氮源分別為可溶性淀粉和硝酸鈉。