農(nóng)知旺，謝鋒華，陳宇辰，吳 娟,2，郭珍珍,2，竺錫武,2

（1. 湖南人文科技學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，湖南 婁底 417000；2. 婁底市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，湖南 婁底 417000）

斜紋夜蛾與棉鈴蟲都是世界上分布廣泛的農(nóng)業(yè)害蟲，可為害作物300種以上，包括煙草、棉花和十字花科蔬菜等重要的經(jīng)濟(jì)作物，危害甚大，如何有效控制對斜紋夜蛾和棉鈴蟲的發(fā)生為害是重要的科學(xué)問題[1-4]。RNA沉默技術(shù)快速發(fā)展[5-6]，為斜紋夜蛾和棉鈴蟲的防控提供了一條新途徑。病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus induced gene silencing，VIGS）是以RNA干擾為基礎(chǔ)，主要用于研究動植物基因功能的一種技術(shù)，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）[7-9]。寄主誘導(dǎo)的基因沉默 （Host induced gene silencing，HIGS） 是以RNA干擾為基礎(chǔ)的進(jìn)一步發(fā)展，近十年來研究應(yīng)用于提高植物抗病蟲害的性能[10-14]，展現(xiàn)了很好的前景。有文獻(xiàn)報道沉默棉鈴蟲一個定位于線粒體的 NDPH 脫氫酶黃素蛋白2（NDUFV2，NV2）基因能夠抑制棉鈴蟲的生長發(fā)育[15]。筆者利用昆蟲NV2基因片段構(gòu)建的重組病毒質(zhì)粒，通過VIGS和HIGS誘導(dǎo)的煙草植株對斜紋夜蛾與棉鈴蟲的抗性進(jìn)行比較研究，分析對害蟲的抗性是否有差異，以期為應(yīng)用植物病毒載體防治斜紋夜蛾及棉鈴蟲，降低斜紋夜蛾及棉鈴蟲的發(fā)生程度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pCB-CMVF209-2b61aa、pCB301-CMVF209-no2b、pCB-CMVF109、pCB-CMVF209、pCB-CMVF309、pTRV1、pTRV2、pCB301-CMVF209-2b61aa-SliNV2370、pCB301-CMVF209-no2b-GFP350、pCB301-CMVF209-no2b-SliNV2370、pCB301-CMVF209-no2b-HaNV2370、pTRV2-GFP350、pTRV2-SliNV2370、pTRV2- HaNV2370，由實驗室保存或構(gòu)建。本氏煙種子由實驗室保存。

1.2 主要試劑

rTaq DNA聚合酶、 qPCR Mix (SYBR Green I)由Takara公司購得；TRIzol購自Thermo公司；2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（MES）、乙酰丁香酮（AS）、卡那霉素（Kana）、利福平（Rif）等試劑購自杭州蘭堡海博生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器與引物序列

主要儀器為PCR儀（美國）；熒光定量PCR儀（美國）；凝膠成像系統(tǒng)（美國）。引物序列以斜紋夜蛾和棉鈴蟲的NV2及actin基因序列設(shè)計RT-qPCR引物（表1），由北京擎科生物公司合成。

表1 PCR引物序列

1.4 方 法

1.4.1 重組病毒在本氏煙植株表達(dá)SliNV2370或HaNV2370片段的試驗設(shè)計 采用重組病毒質(zhì)粒-農(nóng)桿菌浸潤法在本氏煙煙草植株4～6葉期接種，使病毒載體及其外源基因片段在煙草植株中表達(dá)，其具體步驟參照吳娟[16]的研究報道。

試驗設(shè)計一：利用pCB-CMVF209-2b61aa-SliNV2370重組病毒質(zhì)粒在本氏煙植株中表達(dá)SliNV2-370基因片段。用pCB-CMVF209-2b61aa空載體和不接種病毒的本氏煙作對照。每個處理12缽，每缽3株苗。具體設(shè)計如下：（1）pCB-CMVF109+ pCB-CMVF309+ pCBCMVF209-2b61aa-SliNV2370，（2）pCB-CMVF109+pCB-CMVF309+ pCB-CMVF209-2b61aa，（3）Mock。

試驗設(shè)計二： 利用pCB-CMVF209-no2b-SliNV2370重組病毒質(zhì)粒在本氏煙植株中表達(dá)SliNV2-370基因片段。用pCB-CMVF209-no2b-GFP350和不接種病毒的本氏煙作對照。每個處理12缽，每缽3株苗。具體設(shè)計 如 下：（1）pCB-CMVF109+ pCB-CMVF309+ pCBCMVF209-no2b-SliNV2370，（2）pCB-CMVF109+ pCBCMVF309+ pCB-CMVF209-no2b-GFP350，（3）Mock。

試驗設(shè)計三：利用pTRV2-SliNV2370重組病毒質(zhì)粒在本氏煙植株中表達(dá)SliNV2-370基因片段。用pTRV2-GFP350和不接種病毒的本氏煙作對照。每個處理12缽，每缽3株苗。具體設(shè)計如下。（1）pTRV1+pTRV2-SliNV2370，（2）pTRV1+ pTRV2-GFP350，（3）Mock。

試驗設(shè)計四：利用pCB-CMVF209-no2b-HaNV2370重組病毒質(zhì)粒在本氏煙植株中表達(dá)HaNV2-370基因片段。用pCB-CMVF209-no2b-GFP350和不接種病毒的本氏煙作對照。每個處理12缽，每缽3株苗。具體設(shè)計 如 下：（1）pCB-CMVF109+ pCB-CMVF309+ pCBCMVF209-no2b-HaNV2370，（2）pCB-CMVF109+ pCBCMVF309+ pCB-CMVF209-no2b-GFP350，（3）Mock。

試驗設(shè)計五：利用pTRV2-HaNV2370重組病毒質(zhì)粒在本氏煙植株中表達(dá)HaNV2-370基因片段。用pTRV2-GFP350和不接種病毒的本氏煙作對照。每個處理12缽，每缽3株苗。具體設(shè)計如下：（1）pTRV1+pTRV2-HaNV2370，（2）pTRV1+ pTRV2-GFP350，（3）Mock。

1.4.2 本氏煙煙草植物總RNA 的提取 取本氏煙接種12 d后的完全展開的非接種葉片提取總RNA，具體方法參照Trizol 試劑說明書，具體操作步驟參考吳娟[16]的研究報道。

1.4.3 目的基因在本氏煙植株中的表達(dá)情況 提取RNA 后，RT-PCR檢測目的基因是否在本氏煙中表達(dá)，檢測重組病毒質(zhì)粒是否在本氏煙上接種成功，用重組病毒質(zhì)粒構(gòu)建時相對應(yīng)的引物進(jìn)行檢測，具體步驟參考吳娟的研究報道[16]。

1.4.4 接種重組病毒的本氏煙植株對斜紋夜蛾和棉鈴蟲的抗性試驗 RT-PCR 檢測接種重組病毒成功的本氏煙植株用于飼養(yǎng)斜紋夜蛾和棉鈴蟲試驗，試驗處理與浸潤接種病毒的本氏煙處理相對應(yīng)。以一齡的斜紋夜蛾或棉鈴蟲作為試驗對象，每個處理分別設(shè)置4個重復(fù)，每個培養(yǎng)皿為一次重復(fù)。將一齡的斜紋夜蛾或棉鈴蟲饑餓2 h后，選取重量、大小、生命活力基本一致的一齡幼蟲分別放入每個試驗皿中，每個試驗皿各4頭幼蟲（由于棉鈴蟲存在自相殘殺習(xí)性，故將試驗皿分成四小格，每個小格里面放一頭棉鈴蟲）。分別選取相對應(yīng)處理的本氏煙植株相同葉位的葉子喂食。試驗在溫室中進(jìn)行，溫度設(shè)置為25℃，光照時間設(shè)置為16 h；黑暗時間為8 h，濕度60%，每隔3 d稱重一次斜紋夜蛾或棉鈴蟲的重量。試驗結(jié)束前，收集各處理的幼蟲，稱重后用液氮處理保存于-80℃。

1.4.5 供試幼蟲NV2基因的表達(dá)情況 取-80℃保存的幼蟲樣品提取總RNA，并以提取的RNA 為模板去除基因組DNA。以設(shè)計的RT-qPCR引物，按照RTqPCR儀器說明書步驟開展RT-qPCR，并參考吳娟[16]的具體步驟。

1.4.6 數(shù)據(jù)處理 所有試驗數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析（Duncan法多重比較）。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組病毒質(zhì)粒表達(dá)SliNV2370基因片段的本氏煙植株對斜紋夜蛾的抗性

2.1.1 各處理重組病毒及其插入的基因片段在本氏煙中的表達(dá) 以提取的RNA 為模板，以CMVF209序列設(shè)計的通用引物2bNcoIF2和2bAvrⅡR對各CMV重組質(zhì)粒的試驗處理樣品作RT-PCR 檢測，結(jié)果如圖1A、B所示，PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符。表明各重組病毒CMV2b61aa、CMV2b61aa-SliNV2370、CMVno2b-GFP350、CMVno2b-SliNV2370已 經(jīng) 分 別 在相應(yīng)試驗處理的本氏煙植株中成功表達(dá)。以TRV RNA2序列設(shè)計的通用引物TRV2F1和TRV2R1對各TRV重組質(zhì)粒的試驗處理樣品做RT-PCR 檢測，結(jié)果如圖1C所示，表明重組病毒TRV2-GFP350、TRV2-SliNV2370在相應(yīng)試驗處理的本氏煙植株中成功表達(dá)。

圖1 RT-PCR檢測目的病毒及其外源基因片段的電泳結(jié)果

2.1.2 重組病毒質(zhì)粒表達(dá)SliNV2370基因片段的本氏煙植株對斜紋夜蛾的抗性 試驗結(jié)果如圖2所示。圖2A 所示CMV2b61aa-SliNV2370表達(dá)SliNV2370的試驗結(jié)果。分析表明，pCB-CMVF209-2b61aa-SliNV2370處理與mock處理、pCB-CMVF209-2b61aa處理的斜紋夜蛾的平均每頭幼蟲重量分別相差3%、13%，但方差分析差異都不顯著。圖2B 所示CMVF209-no2b-SliNV2370表達(dá)SliNV2370的試驗結(jié)果。分析表明，pCBCMVF209-no2b-SliNV2370處理與mock處理之間的斜紋夜蛾的平均每頭幼蟲重量相差30%，差異顯著；與pCB-CMVF209-no2b-GFP350處理之間的斜紋夜蛾的平均每頭幼蟲重量分別相差23%，但方差分析差異不顯著。圖2C所示TRV-SliNV2370表達(dá)SliNV2370的試驗結(jié)果。分析表明，pTRV2-SliNV2370處理與mock處理、pTRV2-GFP350處理的斜紋夜蛾的平均每頭幼蟲重量分別相差16%、15%，方差分析差異都不顯著。

圖2 試驗各處理的本氏煙植株對斜紋夜蛾的抗性結(jié)果

2.1.3 RT-qPCR檢測斜紋夜蛾NV2基因表達(dá)結(jié)果RT-qPCR分析結(jié)果如圖3所示。圖3A所示，pCBCMVF209-no2b-SliNV2370處理中的斜紋夜蛾的NV2基因的表達(dá)水平分別是mock處理和pCB-CMVF209-no2b-GFP350處理的0.746和0.801倍，方差分析差異顯著，表明pCB-CMVF209-no2b-SliNV2370處理的斜紋夜蛾的NV2基因表達(dá)量相對于pCB-CMVF209-no2b-GFP350空載體處理顯著性地下調(diào)了19.9%。圖3B所示，pTRV2-SliNV2370處理中的斜紋夜蛾的NV2基因的表達(dá)水平分別是mock處理和pTRV2-GFP350處理的0.763和0.807倍，方差分析差異顯著。結(jié)果表明pTRV2-SliNV2370處理的斜紋夜蛾的NV2基因表達(dá)量相對于pTRV2-GFP350空載體處理顯著性地下調(diào)了19.3%。但按轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)[17][差異倍數(shù)大于2，即log2(FoldChange) ＞ 1]判定，兩類病毒載體表達(dá)SliNV2基因片段試驗處理與空載體處理的斜紋夜蛾SliNV2基因表達(dá)差異都沒有達(dá)到差異表達(dá)基因的水平。

圖3 斜紋夜蛾NV2基因表達(dá)量的RT-qPCR分析

2.2 重組病毒表達(dá)HaNV2370基因片段的本氏煙植株對棉鈴蟲的抗性

2.2.1HaNV2370基因片段在本氏煙植株中的表達(dá)結(jié)果 以CMV F 209序列設(shè)計的通用引物2bNcoIF2和2bAvrⅡR對各CMV重組質(zhì)粒的試驗處理樣品作RT-PCR檢測，結(jié)果如圖4A所示，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符，表明病毒載體pCB-CMVF209-no2b-GFP350、pCB-CMVF209-no2b-HaNV2370已經(jīng)在本氏煙中表達(dá)。用TRV RNA2序列設(shè)計的引物TRV2F1 和TRV2R1 對TRV重組質(zhì)粒的試驗處理樣品作RT-PCR檢測，結(jié)果如圖4B所示，PCR 產(chǎn)物大小與預(yù)期大小相符，表明重組病毒TRV-GFP350、TRV-HaNV2370已經(jīng)在相應(yīng)試驗處理的本氏煙植株中成功表達(dá)。

圖4 RT-PCR檢測試驗中目的病毒及其外源基因片段的電泳結(jié)果

2.2.2 重組病毒質(zhì)粒表達(dá)HaNV2370基因片段的本氏煙植株對棉鈴蟲的抗性 試驗結(jié)果如圖5所示。圖5A所示CMVno2b-HaNV2370表達(dá)HaNV2370的試驗結(jié)果。分析表明，pCB-CMVF209-no2b-HaNV2370處理與mock處理、pCB-CMVF209-no2b-GFP350處理之間的斜紋夜蛾的平均每頭幼蟲重量分別相差35%和38%，方差分析差異顯著。圖5B所示TRV2-HaNV2370表達(dá)HaNV2370的試驗結(jié)果，分析表明，TRV2-HaNV2370處理與mock、TRV2-GFP350處理之間的棉鈴蟲的平均每頭幼蟲重量分別相差33%和30%，方差分析差異顯著。

圖5 試驗中各處理的本氏煙植株對棉鈴蟲的抗性結(jié)果

2.2.3 RT-qPCR檢測棉鈴蟲NV2基因的表達(dá)結(jié)果RT-qPCR分析結(jié)果如圖6所示。圖6A所示，pCBCMVF209-no2b-HaNV2370處理中的棉鈴蟲的NV2基因的表達(dá)水平分別是mock處理和pCB-CMVF209-no2b-GFP350處理的0.248和0.275倍。結(jié)果表明pCBCMVF209-no2b-HaNV2370處理的棉鈴蟲的NV2基因表達(dá)量相對于pCB-CMVF209-no2b-GFP350處理下調(diào)了72.5%。圖6B所示，pTRV2-HaNV2370處理中的棉鈴蟲的NV2基因的表達(dá)水平分別是mock處理和pTRV2-GFP350處理的0.203和0.213倍。表明TRV-HaNV2370處理的棉鈴蟲的NV2基因表達(dá)量相對于pTRV2-GFP350下調(diào)了78.7%。按轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)[17][差異倍數(shù)大于2，即log2(FoldChange) ＞ 1]判定，兩類病毒載體表達(dá)HaNV2基因片段試驗處理與空載體處理比較，試驗中的棉鈴蟲HaNV2基因表達(dá)差異都達(dá)到了差異表達(dá)基因的水平。

圖6 棉鈴蟲NV2基因表達(dá)量的RTq-PCR分析

3 小結(jié)與討論

通過重組病毒質(zhì)粒-農(nóng)桿菌浸潤接種本氏煙植株，表達(dá)SliNV2370或HaNV2370基因片段的本氏煙植株分別用于飼養(yǎng)斜紋夜蛾、棉鈴蟲試驗，結(jié)果表明，通過CMV載體或TRV載體表達(dá)SliNV2370基因片段的本氏煙植株都不能顯著增強(qiáng)對斜紋夜蛾的抗性；CMV載體與TRV載體分別表達(dá)HaNV2370基因片段的本氏煙植株都能顯著增強(qiáng)對棉鈴蟲的抗性。RTq-PCR分析，各處理斜紋夜蛾的NV2基因表達(dá)差異都沒有達(dá)到差異表達(dá)基因的水平；棉鈴蟲相關(guān)的試驗中，CMV載體或TRV載體表達(dá)HaNV2370基因片段的處理與空載體處理棉鈴蟲NV2基因表達(dá)差異達(dá)到了差異表達(dá)基因的水平，與抗性試驗結(jié)論具有一致性，驗證了抗性試驗結(jié)果的正確性。

在發(fā)現(xiàn)3種重組病毒質(zhì)粒表達(dá)SliNV2370基因片段的本氏煙植株都沒有顯著性地增強(qiáng)對斜紋夜蛾的抗性后，通過CMVno2b載體、TRV載體開展了抗棉鈴蟲試驗，與對斜紋夜蛾的抗性試驗結(jié)果比較，以確認(rèn)對斜紋夜蛾的抗性試驗結(jié)果的真實性、正確性，確認(rèn)表達(dá)SliNV2370基因片段不能顯著增強(qiáng)本氏煙對斜紋夜蛾的抗性是否與載體不同有關(guān)？是否與試驗操作有關(guān)？是否與不同昆蟲種類有關(guān)？不同載體在本氏煙植株中表達(dá)NV2基因片段都不能增強(qiáng)本氏煙植株對斜紋夜蛾的抗性，但都能增強(qiáng)對棉鈴蟲的抗性，表明抗性差異與病毒載體無關(guān)，也與試驗操作無關(guān)，可能與昆蟲種類不同有關(guān)。

此研究病毒載體結(jié)合HIGS誘導(dǎo)的植株對棉鈴蟲的抗性效果沒有毛穎波等[18]報道的效果好，但其抗棉鈴蟲趨勢是相同的。毛穎波等[18]的研究采用了兩對引物分別表達(dá)HaNV2基因不同片段的寄主植物對棉鈴蟲的抗性效果，此研究只采用了其中的一對引物可能是其原因之一，原因仍有待進(jìn)一步分析和試驗證實。表達(dá)HaNV2基因的本氏煙植株飼養(yǎng)棉鈴蟲能降低78.7%的棉鈴蟲NV2基因表達(dá)量，這與毛穎波[18]等報道的基本一致。用成功表達(dá)SliNV2基因的本氏煙飼養(yǎng)斜紋夜蛾只能相對降低斜紋夜蛾NV2基因表達(dá)量19.3%，雖然方差分析結(jié)果顯示差異顯著，但按轉(zhuǎn)錄組測序篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)判定，SliNV2基因表達(dá)量沒有達(dá)到基因差異表達(dá)水平，因而表觀上表現(xiàn)為不能顯著性地增強(qiáng)本氏煙植株對斜紋夜蛾的抗性。這可能是HIGS方法不適合應(yīng)用于沉默斜紋夜蛾基因。已有報道的沉默斜紋夜蛾基因較好的方法都是微注射法[19-20]。并且另有報道，轉(zhuǎn)Bt基因植物對棉鈴蟲抗性好而對斜紋夜蛾抗性差，是由于斜紋夜蛾的中腸酶液將Cry1Ac蛋白降解為60 kDa的片段大小和水解為38 kDa的片段大小，Cry1Ac蛋白的過度降解導(dǎo)致殺蟲活性降低[21]，這一研究結(jié)果表明斜紋夜蛾具有不同于棉鈴蟲等鱗翅目害蟲的特異的生理生化特性。VIGS結(jié)合HIGS方法對斜紋夜蛾幼蟲SliNV2基因的沉默效果不佳可能是因為斜紋夜蛾物種由其生理生化特異性導(dǎo)致?？傊?，病毒載體表達(dá)NV2-370基因片段的本氏煙植株對斜紋夜蛾、棉鈴蟲的抗性有明顯差異的原因，可能是因為斜紋夜蛾與棉鈴蟲兩個不同的物種的幼蟲有生理生化差異，具體還需后續(xù)進(jìn)一步研究。