吳圣進(jìn)，陳雪鳳，劉增亮，張雯龍

（廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所，廣西南寧 530007）

0 引言

【研究意義】香菇［Lentinula edodes（Berk.）Pegler］屬于擔(dān)子菌門傘菌綱傘菌目光茸菌科香菇屬的一種大型食用真菌，不僅肉質(zhì)肥厚細(xì)嫩、味道鮮美、香氣獨特、營養(yǎng)豐富，而且具有增強(qiáng)免疫力、降低膽固醇、降血壓、抑制腫瘤、抗病毒等保健功效（Jong and Birmingham，1993；Markova et al.，2003），是我國栽培最廣、消費最多的食用菌品種（Chang，2002；趙春艷等，2021）。香菇育種技術(shù)的發(fā)展和新品種的不斷推出為我國香菇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供強(qiáng)有力的支撐（譚琦等，2000）。雜交育種是香菇新品種選育中最常用、最有效的技術(shù)手段，主要包括單單雜交與雙單雜交兩種方法。雜交育種過程中雜交后代的鑒定篩選是關(guān)鍵限速步驟之一，傳統(tǒng)方法通過拮抗試驗和顯微觀察菌絲是否存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)進(jìn)行判別，非常費時、費工，而且效率低、誤判率高（袁濱等，2019）。因此，開發(fā)分子技術(shù)手段鑒定雜交后代對于提高香菇雜交育種工作效率具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著分子生物技術(shù)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)以其穩(wěn)定、精準(zhǔn)和高效等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于食用菌雜交育種中（陳世通等，2013；王麗寧等，2015；宋瑩等，2015），其中隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）和簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是食用菌雜交育種篩選鑒別雜交子中使用最廣泛的2種分子標(biāo)記技術(shù)（呂長武等，2006；孟虎等，2016）。這2種分子標(biāo)記判別雜合子的主要依據(jù)是分析雜交后代和親本菌株是否存在遺傳差異。葉明等（2000）利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對香菇6個雙單雜交后代及其兩個雙核親本的遺傳差異進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示雜交菌株與雙核親本間的基因組有較大差異，判定為真正的雜交子。王波等（2012）利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析金針菇單核原生質(zhì)體菌株配對構(gòu)建而成的雙核體和雜交菌株，結(jié)果顯示雙單雜交種與其單核原生質(zhì)體和具有相同基因型的單單雜交菌株的親緣關(guān)系較近。王麗寧等（2015）、趙妍等（2016）在鏡檢和拮抗試驗獲得初篩雜交子的基礎(chǔ)上，分別選用8條引物對耐高溫的香菇單孢雜交后代和2個親本進(jìn)行了ISSR分析，結(jié)果表明雜交菌株與親本均存在一定的遺傳差異，是新的香菇耐高溫菌株。李慧等（2021）在出菇試驗驗證基礎(chǔ)上，選用了8條引物對選育的金針菇雙單雜交子FHJ-12及其雙核親本、單核親本進(jìn)行ISSR分析，聚類分析結(jié)果證明該雜交子為雙單雜交的雜合子。由此可見，采用RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析雜交菌株與親本間的遺傳差異多用于初篩雜交子的驗證，需要基于多個引物的擴(kuò)增結(jié)果。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)還可以通過分析雜交后代是否同時擁有兩個親本菌株的特異性條帶對雜交后代進(jìn)行鑒別。陳世通等（2013）利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對香菇單孢雜交后代進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)45個菌株具有兩親本的特異性條帶，從分子水平證明其為真正的雜合子，另有39個菌株只有1個親本的特異性條帶，結(jié)合拮抗試驗結(jié)果判定為非雜合子。宋瑩等（2015）在鑒定香菇單孢雜交菌株0912時發(fā)現(xiàn)，該雜交菌株與其中一個親本的拮抗反應(yīng)較弱，利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒別卻發(fā)現(xiàn)其同時具有兩親本特異性條帶，是真正的香菇雜合子?？梢?，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對雜合子的鑒定結(jié)果比傳統(tǒng)拮抗試驗結(jié)果更穩(wěn)定、準(zhǔn)確和可靠，但對非雜合子的判定仍需結(jié)合傳統(tǒng)方法。除了RAPD和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)外，其他分子標(biāo)記技術(shù)鑒定食用菌雜交后代的應(yīng)用也有少量報道。巫萍等（2016）利用基于香菇全基因組序列信息開發(fā)的簡單重復(fù)序列擴(kuò)增（Simple sequence repeat，SSR）分子標(biāo)記被成功應(yīng)用于香菇原生質(zhì)體單核體、孢子單核體及其雜交后代的鑒定。于浩等（2019）采用單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）分子標(biāo)記技術(shù)證明長根菇雙單雜交后代的2個細(xì)胞核分別來自O(shè)uC雙核親本和OuE單孢菌株，從而確定雜合子?！颈狙芯壳腥朦c】特定序列擴(kuò)增（Sequence characterized amplified regions，SCAR）是 一 種 以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)，具有穩(wěn)定性和重復(fù)性高、操作簡捷高效、結(jié)果可靠等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物的種質(zhì)資源和菌株鑒定（吳學(xué)謙等，2005；趙微微等，2010）、分子標(biāo)記輔助育種和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建（謝寶貴等，2004；傅俊生等，2010）。目前有關(guān)SCAR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于鑒定食用菌雜交后代的研究報道很少，僅傅俊生等（2010）利用SCAR分子標(biāo)記技術(shù)成功鑒別出草菇單孢雜交子代。尚未見有關(guān)SCAR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于食用菌雙單雜交后代鑒定的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】將SCAR分子標(biāo)記技術(shù)拓展應(yīng)用于香菇雙單雜交后代的鑒別篩選，并通過區(qū)分導(dǎo)入細(xì)胞核對雜合子進(jìn)行歸類分組，以期為提高香菇雜交育種和遺傳分析效率提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的香菇親本為菌株808和YX7，均由廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物研究所提供，其中，菌株808是廣西推廣栽培品種，具有外觀品質(zhì)好、栽培產(chǎn)量高等優(yōu)良性狀；菌株YX7是廣西野生香菇菌株，具有耐高溫、香味濃、出菇早等優(yōu)良性狀。DNA Gel Extraction Kit和2×TaqPCR MasterMix試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。主要儀器設(shè)備：顯微鏡及成像系統(tǒng)（Olympus，日本）、PCR儀（ETC821，北京東勝龍）。PDA固體培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g和蒸餾水1000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 孢子單核體菌株的獲取.親本香菇菌株808栽培出菇后，選擇菇形圓整、開傘七八分的子實體，在無菌環(huán)境下采集孢子。采用稀釋涂板法分離單孢子（陳英南等，2008；王麗寧等，2015），菌絲萌發(fā)并純化1次后，顯微鏡檢測3次均無鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)的判定為單孢菌株，試管培養(yǎng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 雙單雜交及雜交菌株的獲得.參照程爽爽等（2020）的方法，隨機(jī)選取40個分離自菌株808的孢子單核體菌株，分別與供體親本雙核菌株YX7同時接種到PDA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行兩兩配對雜交，兩菌株接種點相距1.5 cm，25℃下培養(yǎng)15 d，挑取單核體菌株遠(yuǎn)離供體親本菌株一邊的菌絲塊接種于新的PDA固體培養(yǎng)基上，純化2次后保存，作為后續(xù)研究的候選雜交菌株。

1.2.3 雜交菌株的鏡檢和拮抗試驗.挑取待檢雜交菌株菌落邊緣不同部位的菌絲，置于顯微鏡下觀察是否存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)。同時挑取候選雜交菌株菌絲塊，接種于新的PDA固體培養(yǎng)基上，分別與兩個親本菌株對峙，25℃下培養(yǎng)15 d，觀察候選雜交菌株與兩親本菌株的拮抗反應(yīng)情況。

1.2.4 供體特異條帶篩選.將親本菌株和候選雜交菌株分別接種至鋪有玻璃紙的PDA固體培養(yǎng)基，25℃下培養(yǎng)10 d，收集菌絲，采用吳圣進(jìn)等（2020）的方法提取基因組總DNA。采用預(yù)先篩選出的ISSR引物（5'-AGAGAGAGAGAGAGAGT-3'）對待測菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增。ISSR-PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPCR MasterMix 10 μL，10 μmol/L引物1 μL，150 ng/μL DNA模板1 μL，ddH2O 8 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，54℃45 s，72℃90 s，進(jìn)行35個循環(huán)；72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用含有GelRed染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并根據(jù)ISSR電泳結(jié)果，篩選出含供體菌株YX7的2條目標(biāo)特異條帶。

1.2.5 SCAR標(biāo)記分析.采用DNA Gel Extraction Kit試劑盒回收選定的2條目標(biāo)條帶。根據(jù)目標(biāo)條帶測序結(jié)果，分別設(shè)計2條目標(biāo)特異條帶的SCAR標(biāo)記引物對。目標(biāo)條帶的測序和SCAR引物合成均委托生工生物工程（上海）股份有限公司完成。采用篩選出的引物對，以候選雜交菌株總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系20 μL：2×TaqPCR Master-Mix 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，15 ng/μL DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃30 s，60℃或70℃30 s，72℃60 s，進(jìn)行30個循環(huán)，72℃延伸7 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物采用含有GelRed染料的1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體菌株特異條帶篩選

采用預(yù)先篩選出的ISSR引物對雙核親本菌株XY7和菌株808，以及部分香菇雜交子菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜如圖1所示。a條帶和b條帶屬于供體親本菌株YX7的特異性條帶，菌株808的擴(kuò)增產(chǎn)物中沒有發(fā)現(xiàn)這兩條條帶，但能出現(xiàn)在雜交子菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物中，說明這些雜交子菌株擁有供體親本的細(xì)胞核。同時發(fā)現(xiàn)，a條帶和b條帶在雜交子菌株中存在分離現(xiàn)象，即部分菌株如菌株2、3、9、13、23和31只有a條帶，而沒有b條帶；還有部分菌株如菌株7、24和34則只有b條帶而沒有a條帶，說明a條帶和b條帶的位點分別位于供體親本菌株XY7的兩個細(xì)胞核中，隨著雙單雜交時遷移導(dǎo)入的細(xì)胞核不同，兩條帶也在不同雜交子菌株中出現(xiàn)分離現(xiàn)象。因此，可利用a條帶和b條帶分別標(biāo)記供體親本的兩個細(xì)胞核。

圖1 基于引物P1的香菇部分雜交菌株的ISSR圖譜Fig.1 ISSR profile of partial hybrid strains of L.edodes based on primer P1

分別膠回收a條帶和b條帶并測序，測序結(jié)果如圖2所示。根據(jù)a條帶和b條帶的核苷酸序列，分別設(shè)計二者特異擴(kuò)增引物對PA和PB。其中，a條帶的特異性引物對PA的上游引物序列：5'-AATCTCCCAA AGGACTGGATCG-3'，下游引物序列：5'-CACCAT TTCGGAGCCAAGAGC-3'，引物退火溫度為60℃；b條帶的特異性引物對PB的上游引物序列：5'-CA TTCAGCGCCAATCGAGCAG-3'，下游引物序列：5'-GAGAAGCTTCGTCAGCCACTG-3'，引物退火溫度為70℃。

圖2 供體菌株YX7特異性條帶a和b序列Fig.2 Specific band a and b sequences of donor strain YX7

2.2 SCAR標(biāo)記技術(shù)鑒別分析雙單雜交菌株

分別用PA和PB兩對特異性引物對40個待測菌株的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖3所示。兩對特異性引物對親本菌株808均未擴(kuò)增出條帶，而對供體親本菌株YX7則均有擴(kuò)增條帶，說明兩對引物在菌株YX7的基因組上均有擴(kuò)增位點，而在菌株808上無擴(kuò)增位點；雜交菌株2、3、9、13、23、31、35m、37m、37e、38、46、52e、57、58e、66、67、70、70e和79僅在特異性引物PA擴(kuò)增下有條帶，而在特異性引物PB擴(kuò)增下無條帶，說明這19個雜交菌株獲得條帶a標(biāo)識的供體細(xì)胞核，是雜交成功的雜合子；雜交菌株7、8、24、34、39、42、47和52則僅在特異性引物PB擴(kuò)增下有條帶，而在特異性引物PA擴(kuò)增下無條帶，說明這8個雜交菌株獲得條帶b標(biāo)識的供體細(xì)胞核，也是雜交成功的雜合子；雜交菌株1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74和78在PA和PB引物擴(kuò)增下均有條帶，其結(jié)果與供體親本菌株YX7相同，說明這11個菌株均同時擁有供體親本的2個細(xì)胞核，是誤挑取到的供體菌株YX7，不屬于雜合子；菌株56m和73則與菌株808一樣在PA和PB引物擴(kuò)增下均無條帶，說明沒有供體細(xì)胞核導(dǎo)入，屬于未雜交成功的808單孢菌株?？梢?，40個待測雜交菌株中共有27個為真正的雜合子。

圖3 基于引物P1的香菇部分雜交菌株的ISSR電泳圖譜Fig.3 ISSR electrophoregram of partial hybrid strains of L.edodes based on primer P1

2.3 雙單雜交子的鏡檢和拮抗測試

為了驗證SCAR分子標(biāo)記對雜交菌株的鑒別結(jié)果，分別對待測的40個雜交菌株進(jìn)行顯微檢測及與兩親本菌株的拮抗測試，結(jié)果如表1所示。僅引物PA有擴(kuò)增條帶的19個雜合子菌株2、3、9、13、23、31、35m、37m、37e、38、46、52e、57、58e、66、67、70、70e和79，以及僅引物PB有擴(kuò)增條帶的8個雜合子菌株7、8、24、34、39、42、47和52，菌絲均存在鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，且菌落均與兩親本菌株YX7和808同時存在拮抗反應(yīng)，說明這些27個雜合子菌株均是與兩親本菌株存在遺傳差異的雙核菌株，是兩親本雜交成功所獲得的雜合子；引物PA和PB均有擴(kuò)增條帶的11個菌株1、15、36m、36e、49、52m、58m、60、68、74和78，菌絲也檢測出鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，但與供體親本菌株YX7均無拮抗反應(yīng)，說明這11個菌株是與菌株XY7相同的雙核菌株；菌株56m和73的菌絲未檢測出鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)，說明二者是單核體，是未雜交成功所產(chǎn)生的菌株808單孢菌株。

表1 雜交菌株鎖狀聯(lián)合和與親本的拮抗反應(yīng)情況Table 1 Clamp connection of hybrid strains and antagonistic reaction with parents

3 討論

雙單雜交是擔(dān)子菌的供體雙核親本中的一個細(xì)胞核遷移至受體單核親本細(xì)胞中完成配對的非對稱雜交現(xiàn)象，又稱布勒現(xiàn)象，最早由加拿大真菌學(xué)家布勒發(fā)現(xiàn)（Callac et al.，2006）。由于雙單雜交供體菌株的兩個細(xì)胞核不存在遺傳物質(zhì)的重組和交換，雜交成功后其中一個細(xì)胞核進(jìn)入受體形成雜合子，對該細(xì)胞核的分子標(biāo)記也帶入雜合子（葉明等，1999）。因此，可通過跟蹤雜交子中導(dǎo)入的供體細(xì)胞核情況，判斷其是否為真正的雜合子。本研究設(shè)計的SCAR引物PA和PB能分別特異擴(kuò)增雙核親本菌株YX7的2個細(xì)胞核，對YX7和808雙單雜交后代進(jìn)行鑒別結(jié)果表明，SCAR分子標(biāo)記能清晰顯示每個雜交后代是否導(dǎo)入供體細(xì)胞核以及導(dǎo)入哪個核型細(xì)胞核，從而成功鑒定出每個香菇雙單雜交后代是否為雜交子。傅俊生等（2010）采用SCAR分子標(biāo)記分別跟蹤2個草菇單孢菌株細(xì)胞核，通過對2個單孢菌株雜交后代細(xì)胞核型的辨別，成功鑒定出兩單孢菌株的雜合子。但該研究的SCAR分子標(biāo)記只限于對供試兩個單孢菌株間的配對雜交后代進(jìn)行鑒別，使用上具有很大的局限性。本研究的SCAR分子標(biāo)記適用于雙核菌株YX7與808任一單孢菌株間的雙單雜交后代，更有實際運用價值。與本研究思路相似，巫萍等（2016）通過比較香菇808雙核菌株及其兩個不同核型的原生質(zhì)體單核體菌株的遺傳差異，篩選出SSR引物用于標(biāo)記香菇808的兩個核型細(xì)胞核，并成功運用于香菇單核體及其雜交后代的鑒定?？梢?，利用分子標(biāo)記跟蹤供體親本細(xì)胞核，進(jìn)而鑒定雜交后代的方法是完全可行的。與上述SSR分子標(biāo)記相比，本研究的SCAR分子標(biāo)記直接通過ISSR遺傳差異分析獲得標(biāo)識供體兩個細(xì)胞核的引物，不用制備原生質(zhì)體單核體，也不需要獲得菌株的全基因組數(shù)據(jù)，方法更簡單便利。

本研究ISSR分析結(jié)果表明，當(dāng)篩選出合適的引物時，采用單引物也可擴(kuò)增出a和b兩條特異性條帶，分別標(biāo)識菌株YX7的2個不同核型細(xì)胞核?？梢姡鄳?yīng)單引物ISSR技術(shù)可直接運用于雙單雜交后代鑒定。但在實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，b條帶信號較弱，存在不穩(wěn)定現(xiàn)象，這有可能是ISSR引物為非特異性所導(dǎo)致。為解決ISSR結(jié)果不穩(wěn)定可能導(dǎo)致鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確問題，本研究將a和b兩條特異性條帶轉(zhuǎn)化為特異性強(qiáng)的SCAR標(biāo)記引物PA和PB，最終獲得非常清晰而穩(wěn)定的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。

本研究傳統(tǒng)鏡檢和拮抗試驗結(jié)果表明，SCAR分子標(biāo)記鑒定出的27個雜合子菌株是真正的雜合子，傳統(tǒng)方法與SCAR分子標(biāo)記方法鑒定結(jié)果一致，可見，SCAR分子標(biāo)記方法準(zhǔn)確可行。傳統(tǒng)方法中，鎖狀聯(lián)合結(jié)構(gòu)有時不易找到而產(chǎn)生誤檢（巫萍等，2016；袁濱等，2019）。本研究雜合子47和79也是經(jīng)過多次反復(fù)鏡檢才找到鎖狀聯(lián)合。拮抗試驗中部分菌株如菌株37m、37e、47、58e、70、70e和79與親本菌株僅有輕微拮抗反應(yīng)，但輕微拮抗反應(yīng)與無拮抗反應(yīng)很難區(qū)分，也易產(chǎn)生錯誤的鑒定結(jié)果。與傳統(tǒng)方法相比，SCAR分子標(biāo)記方法具有條帶清晰、結(jié)果穩(wěn)定可靠、用工耗時少、效率高等優(yōu)點。

值得注意的是，本研究的SCAR分子標(biāo)記引物只能鑒別香菇菌株YX7為供體親本與菌株808單孢的雜交后代，若選用其他品種作為親本則需要重新設(shè)計引物。由于設(shè)計SCAR分子標(biāo)記引物首先要通過ISSR分析獲得供體菌株的2條特異條帶，當(dāng)選用的兩親本親緣關(guān)系很近時，可能會難以獲得合適的特異性位點而導(dǎo)致鑒定技術(shù)無法建立。

4 結(jié)論

SCAR分子標(biāo)記方法可準(zhǔn)確鑒別待測菌株是雜合子還是非雜合子，并可對雜合子依據(jù)導(dǎo)入核核型歸類，解決了傳統(tǒng)顯微觀察和拮抗試驗方法效率低、準(zhǔn)確性差的問題，是一種簡便、快速和有效的香菇雙單雜交后代鑒定方法。