劉東東，高佳怡，張璐瑤，龔理

（浙江海洋大學(xué)海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/海洋生物種質(zhì)發(fā)掘與利用國家地方研究中心，浙江舟山 316022）

0 引言

【研究意義】線粒體基因組作為細(xì)胞核外能獨(dú)立進(jìn)化的遺傳系統(tǒng)，具有結(jié)構(gòu)簡單、呈母系遺傳、進(jìn)化速率快且不同結(jié)構(gòu)進(jìn)化速率不一致等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于物種鑒定、群體遺傳結(jié)構(gòu)、適應(yīng)性進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析等研究領(lǐng)域（石林波等，2013；Wang et al.，2019；羅純等，2021；Zhang et al.，2021）。DNA條形碼首次由Hebert等（2003a，2003b）提出，經(jīng)過近20年的發(fā)展現(xiàn)已普遍應(yīng)用于物種分類鑒定和生物多樣性評(píng)估等領(lǐng)域，在海關(guān)、法醫(yī)鑒定、市場監(jiān)督及生物多樣性保護(hù)中心等行業(yè)部門發(fā)揮著重要作用（張瑞玲等，2017；劉娟等，2019；熊娟等，2020）。溪蟹科（Potamidae）是短尾次目（Brachyura）中物種十分豐富的類群，由于溪蟹生境復(fù)雜、近緣種形態(tài)接近、研究起步較晚，導(dǎo)致其分類及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系長期存在爭議（鄒節(jié)新等，2013；Zhang et al.，2020）。因此，建立溪蟹科DNA條形碼數(shù)據(jù)庫，輔以形態(tài)學(xué)特征，有望解決溪蟹物種長期存在的鑒定問題，為溪蟹科系統(tǒng)進(jìn)化研究及其他類群物種鑒定提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自2003年Hebert等（2003a，2003b）首次提出DNA條形碼概念以來，作為分類鑒定的有效技術(shù)手段在從低等的真菌、藻類和無脊椎動(dòng)物到高等的兩棲爬行類、魚類和哺乳類動(dòng)物均已得到證實(shí)（孔曉瑜等，2001；孟瑋等，2010；王淑英等，2014；張瑞玲等，2017；徐巖等，2019）?？讜澡さ龋?001）通過比較分析黃河口和珠江流域中華絨螯蟹與日本絨螯蟹間的COI基因序列差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃河口和珠江流域的中華絨螯蟹COI基因序列完全一致，但二者與日本絨螯蟹的COI基因序列差異較明顯，支持存在中華絨螯蟹和日本絨螯蟹或二者為不同地理亞種的觀點(diǎn)；Ortman等（2010）基于COI基因序列分析1種立方水母、10種缽水母和84種水螅水母的遺傳距離，結(jié)果證實(shí)了DNA條形碼間隔的存在，并提出COI基因可作為水母亞門種類鑒定的分子標(biāo)記，類似方法在根口水母科（Rhizostomatidae）物種鑒定中同樣有效（李玉龍等，2017）；王淑英等（2014）在研究鰈形目鰨科（Soleidae）魚類物種鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)，COI基因在種內(nèi)和屬內(nèi)種間的平均遺傳距離分別為0.33%和19.91%，二者的遺傳差異約60倍（個(gè)別最小相差19倍），符合Hebert等（2003a，2003b）提出的物種鑒定標(biāo)準(zhǔn)；張瑞玲等（2017）基于線粒體COI基因序列，通過遺傳距離和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹對(duì)蚊、蠅、蜱、蟑螂等主要醫(yī)學(xué)媒介生物進(jìn)行鑒定，證實(shí)了DNA條形碼技術(shù)在這些媒介生物鑒定中的可行性；徐巖等（2019）基于COI基因序列對(duì)中國沿海相手蟹（Sesarmidae）進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明相手蟹為多系起源，且日本的無齒螳臂相手蟹（Chiromantes dehaani）與我國長江口的無齒螳臂相手蟹（C.neglectum）雖然在形態(tài)上存在一定差異，但分子數(shù)據(jù)顯示二者為同種異名。此外，孟瑋等（2010）將線粒體COI基因序列作為基因條形碼運(yùn)用于三種鮭科魚類（亞東鮭、大西洋鮭和紅點(diǎn)鮭）鑒定，其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示亞東鮭和大西洋鮭首先聚為一類，再與紅點(diǎn)鮭聚類，表明線粒體COI基因序列對(duì)鮭科魚類物種鑒定具有一定的可行性和有效性，類似的方法在刀鱭（Coilia nasus）、湖鱭（C.nasus taihuensis）、短頜鱭（C.branchygnathus）、七絲鱭（C.grayii）、鳳鱭（C.mystus）（楊巧莉，2012）及裂腹魚亞科（Schizothoracinae）（周建設(shè)等，2019；迪麗娜·茹斯坦木，2021）等物種鑒定中也得到證實(shí)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我國溪蟹物種資源豐富，但研究起步較晚，且主要集中在形態(tài)學(xué)分類、生態(tài)習(xí)性及生長繁殖等方面（戴愛云和陳國孝，1981；楚克林等，2018）。雖然目前針對(duì)溪蟹科已有分子方面的相關(guān)研究，但涉及的物種不多（鄭芳等，2006；石林波等，2013；Ji et al.，2016），關(guān)于溪蟹科物種分類及其內(nèi)部親緣關(guān)系至今尚未得到較全面系統(tǒng)研究。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過擴(kuò)增測定2種溪蟹代表種［長安龍溪蟹（Longpotamon changanense）和龍溪蟹未定種（Longpotamonsp.）］的COI基因全序列，結(jié)合GenBank中已公布的18種溪蟹科COI基因序列，比較分析20種溪蟹的線粒體COI基因序列，評(píng)估其序列多態(tài)性，探究COI基因作為分子標(biāo)記在溪蟹物種鑒定中的適用性；同時(shí)基于COI基因序列構(gòu)建溪蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，分析不同種類間的親緣關(guān)系，為溪蟹科的物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2種溪蟹樣品分別采自陜西洛南（東經(jīng)110°07′41.36″，北緯34°06′17.43″）和湖南新化（東經(jīng)111°20′23.68″，北緯27°43′40.19″）附近溪流，將新鮮樣品用酒精固定后運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室；根據(jù)形態(tài)學(xué)特征并輔以NCBI中的線粒體COI基因序列進(jìn)行鑒定，其中，陜西洛南采集到的樣品鑒定為長安龍溪蟹，湖南新化采集的樣品可能為龍溪蟹屬新紀(jì)錄種。由于該新紀(jì)錄種樣品采集數(shù)量有限，故暫命名為龍溪蟹未定種。

1.2 基因組DNA提取及檢測

取2種溪蟹螯足肌肉組織約30 mg，剪碎后放入離心管中，利用鹽析法提取2種溪蟹的基因組。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組完整性，并采用核酸定量儀（NanoDrop）檢測其純度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴(kuò)增及測序

基于NCBI已公布的蟹類線粒體基因組COI序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增2種溪蟹線粒體COI基因序列的通用引物（F-COI：5'-ATGCAACGATGATTTTTTTCYA-3'；R-COI：5'-TARCGGTTGATHARGAGT-3'）。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系33.0 μL：PCR Mix酶（北京溪洋匯智科技有限公司）15.0 μL，ddH2O 13.5 μL，正、反向引物各1.5 μL，DNA模板1.5 μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃30 s，48~54℃50 s，68℃1~3 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；68℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，電泳緩沖液為1×TAE（pH 8.0）、電壓為4 V/cm，以EB核酸染料染色，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照，回收目的片段送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序；無法直接測序的片段則通過分子克隆后再測序。

1.4 序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

運(yùn)用CodonCode Aligner 5.1.5將各目的基因序列進(jìn)行拼接，并輔以手工校對(duì)；再以Sequin v15.10（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Sequin/）對(duì)線粒體COI基因全序列進(jìn)行注釋，利用ClustalX對(duì)測定的2種溪蟹和GenBank已公布的其他溪蟹線粒體COI基因核苷酸及其推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比較分析（Larkin et al.，2007），利用MEGA X計(jì)算其堿基組成、保守位點(diǎn)和遺傳距離（Kumar et al.，2018），采用MatGAT 2.02進(jìn)行多序列相似性比較分析（Campanella et al.，2003），并以PhyloSuite構(gòu)建貝葉斯樹（BI）和最大似然樹（ML）（李加愛等，2021），探究溪蟹科物種內(nèi)部親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 20種溪蟹COI基因全序列比較分析結(jié)果

長安龍溪蟹和龍溪蟹未定種的線粒體COI基因序列全長分別為1534和1539 bp，均以ATG為起始密碼子，分別連續(xù)編碼511和512個(gè)氨基酸殘基，不存在堿基插入或缺失；長安龍溪蟹以不完全終止密碼子T為終止密碼子，龍溪蟹未定種以常見的TAA為終止密碼子。2種溪蟹的堿基含量差異不明顯，4種堿基的含量分別為36.7%~38.3%（T）、18.4%~19.2%（C）、28.1%~28.6%（A）和15.3%~15.4%（G）。為了比較溪蟹科線粒體COI基因序列多態(tài)性，從GenBank下載18種溪蟹科COI基因全序列，對(duì)這20種溪蟹的COI基因序列差異進(jìn)行比較分析。結(jié)果（表1）顯示，COI基因序列全長1534~1539 bp，連續(xù)編碼511~512個(gè)氨基酸殘基；所有物種均以ATG為起始密碼子，6種以不完全終止密碼子T為終止密碼子，其余均以TAA為終止密碼子（圖1）。20種溪蟹的堿基含量略有不同（表1），分別為35.9%~40.7%（T）、16.4%~20.2%（C）、26.8%~28.9%（A）和14.7%~17.2%（G），呈明顯的AT偏向性。核苷酸序列比較分析結(jié)果（圖1）顯示，共有962個(gè)保守位點(diǎn)，577個(gè)變異位點(diǎn)（約占37.3%）；基因序列變異主要發(fā)生在密碼子的第3位密碼子上（452個(gè)變異位點(diǎn)），第1位密碼子存在100個(gè)變異位點(diǎn)，第2位密碼子非常保守，僅有25個(gè)變異位點(diǎn)。將核苷酸翻譯成氨基酸序列再進(jìn)行比較分析，結(jié)果（圖2）顯示僅有98個(gè)變異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)率僅占19.0%，遠(yuǎn)低于核苷酸序列變異率?？梢?，線粒體COI基因第3位密碼子具有搖擺性，但第3位密碼子變異并不一定改變氨基酸種類，該現(xiàn)象稱為遺傳密碼簡并性。

圖1 20種溪蟹線粒體COI基因核苷酸序列比較分析結(jié)果Fig.1 Alignment of nucleotide sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

圖2 20種溪蟹線粒體COI基因推導(dǎo)氨基酸序列比較分析結(jié)果Fig.2 Alignment of deduced amino acid sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹的物種信息Table 1 List of the species to build phylogenetic tree

2.2 遺傳距離及相似分析結(jié)果

基于COI基因核苷酸序列計(jì)算20種溪蟹科物種的遺傳距離及其序列相似性（表2），結(jié)果顯示，近溪蟹屬（Potamiscus）的易武近溪蟹（P.yiwuensis）與山區(qū)近溪蟹（P.montosus）間的遺傳距離最?。?.007），二者對(duì)應(yīng)的序列相似性最高（99.4%）；其次是澤蟹屬（Geothelphusa）的漢氏澤蟹（G.dehaani）與澤蟹未定種（Geothelphusasp.），二者的遺傳距離為0.028，對(duì)應(yīng)的序列相似性為97.3%；最大遺傳距離出現(xiàn)在龍溪蟹未定種（Longpotamonsp.）和泰王中印溪蟹（Indochinamon bhumibol）間（0.234），對(duì)應(yīng)的序列相似性最低（80.7%）。值得注意的是：小石蟹屬（Tenuilapotamon）中的寬腹小石蟹（T.latilum）與龍溪蟹屬中的小龍溪蟹（L.parvum）遺傳距離最?。?.110），序列相似性最高（89.6%），而寬腹小石蟹與玉溪小溪蟹（Tenuipotamon yuxiense）間的遺傳距離為0.199（大于0.110），序列相似性僅為83.0%（低于89.6%），小龍溪蟹與同屬其他物種的遺傳距離最小為0.122（與長安龍溪蟹），序列相似性最高為88.7%（與長安龍溪蟹）。類似現(xiàn)象也存在于近溪蟹屬物種中，近溪蟹屬中的永勝近溪蟹（P.yongshengense）與小溪蟹屬（Tenuipotamon）的玉溪小溪蟹（T.yuxiense）間的遺傳距離（0.135）低于永勝近溪蟹與同屬的易武近溪蟹和山區(qū)近溪蟹間的遺傳距離（均為0.188）；永勝近溪蟹與玉溪小溪蟹間的COI基因序列相似性（88.1%）高于永勝近溪蟹與易武近溪蟹（84.2%）和山區(qū)近溪蟹（84.3%）間的相似性。此外，長安龍溪蟹和龍溪蟹未定種間的遺傳距離最小（0.088），序列相似性最高（91.5%）。

表2 20種溪蟹科物種的線粒體COI基因遺傳距離及其序列相似性Table 2 The genetic distance and sequence similarity based on mitochondria COI gene in 20 Potamidae species

2.3 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析結(jié)果

基于線粒體COI基因及線粒體基因組中的13個(gè)蛋白編碼基因序列，以束腹蟹科（Parathelphtlsidae）中的波陽束腰蟹（Somanniathelphusa boyangensis）和壩王束腰蟹（S.bawangensis）為外類群，同時(shí)構(gòu)建溪蟹科貝葉斯樹和最大似然樹，結(jié)果顯示，基于COI基因構(gòu)建的2種系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3和圖4）略有不同，而基于13個(gè)蛋白編碼基因構(gòu)建的貝葉斯樹和最大似然樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（圖5）完全一致，且基于COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹與基于蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也存在一定差異。雖然采用不同方法基于不同數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上有所不同，但所有樹型均顯示長安龍溪蟹與同屬的龍溪蟹未定種親緣關(guān)系最近，除了小龍溪蟹與寬腹小石蟹聚在一起外，其余4種龍溪蟹屬物種聚為一支，表明龍溪蟹屬為非單系群；近溪蟹屬4個(gè)物種中，易武近溪蟹與山區(qū)近溪蟹的親緣關(guān)系最近，聚為一支，而其他2個(gè)物種［永勝近溪蟹和墨脫近溪蟹（P.motuoensis）］分散在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹不同分支中，且永勝近溪蟹與玉蟹小溪蟹間的親緣關(guān)系明顯比永勝近溪蟹與墨脫近溪蟹間的親緣關(guān)系近，說明近溪蟹屬也是非單系群；澤蟹屬中的漢氏澤蟹和澤蟹未定種聚在一起，二者存在較近的親緣關(guān)系。

圖3 基于線粒體COI基因序列構(gòu)建的溪蟹科貝葉斯樹Fig.3 Bayesian tree of Potamidae species based on mitochondria COI gene sequence

圖4 基于線粒體COI基因序列構(gòu)建的溪蟹科最大似然樹Fig.4 The maximum likelihood tree of Potamidae species based on mitochondria COI gene sequence

圖5 基于13種蛋白編碼基因核苷酸序列構(gòu)建的溪蟹科的貝葉斯樹和最大似然樹Fig.5 Bayesian tree and the maximum likelihood tree of Potamidae species based on 13 protein coding genes nucleotide sequence

續(xù)圖1 20種溪蟹線粒體COI基因核苷酸序列比較分析結(jié)果Continued Fig.1 Alignment of nucleotide sequence of mitochondria COI gene of 20 Potamidae species

3 討論

線粒體是細(xì)胞核外獨(dú)立的遺傳系統(tǒng)，能自主進(jìn)行DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。線粒體基因組具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、編碼效率高、進(jìn)化速度快等優(yōu)點(diǎn)，在物種鑒定和分類、遺傳多樣性分析及系統(tǒng)進(jìn)化研究等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用（Wang et al.，2019；羅純等，2021；Zhang et al.，2021；Sultana et al.，2022）。在眾多線粒體基因中，COI基因因具有易擴(kuò)增、進(jìn)化速度適中等特點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于不同類群生物分類和鑒定，很大程度上彌補(bǔ)了形態(tài)學(xué)分類的不足，尤其為形態(tài)特征極其相似的隱存種及形態(tài)界限模糊不清或形態(tài)破損不易區(qū)分的近緣種鑒定提供了有效依據(jù)（范蔓樺等，2020；唐富江等，2020；張格等，2020）。Hebert等（2003a）最早比較分析了13320種不同門類動(dòng)物的COI基因序列，提出COI基因用于物種鑒定的標(biāo)準(zhǔn)是種內(nèi)遺傳距離小于2%，且種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離（通常在10倍以上）。目前該標(biāo)準(zhǔn)在大量生物類群（甲殼類、兩爬類、魚類和哺乳類等）中已得到驗(yàn)證（Hebert et al.，2003b）。唐富江等（2020）通過比較分析烏蘇里江260個(gè)魚卵樣本的線粒體COI基因序列，發(fā)現(xiàn)其中有213條序列與Gen-Bank已知物種參考序列的相似性超過99%，能有效鑒定到種；7條序列與已知物種參考序列的相似度為95%~99%，能鑒定到屬；進(jìn)一步分析還發(fā)現(xiàn)烏蘇里江中下游漂流性卵魚類以銀鮈（Squalidus argentatus）、銀鲴（Xenocypris argentea）、貝氏（Hemiculter bleekeri）和花斑副沙鰍（Parabotia fasciatus）等小型魚類為主，資源量較大，而大中型魚類中以翹嘴鲌（Culter alburnus）的資源量最豐富，該結(jié)論為魚類資源開發(fā)和利用提供了便捷有效的分子參考。同樣的方法在長江口海域夏季魚卵、仔稚魚種類組成及多樣性分析中也得到廣泛應(yīng)用。張格等（2020）研究表生長、代謝過程及生物調(diào)節(jié)等功能條目上，而KEGG信息通路富集分析結(jié)果表明主要富集在過氧化物酶、RNA降解、軸突指導(dǎo)、神經(jīng)活性配體—受體相互作用等通路上。根據(jù)GO功能注釋及KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果，最終選定TOB2、CRAT、CCT6、KLF4共4個(gè)基因?yàn)榉布{濱對(duì)蝦生長相關(guān)候選基因，具體基因信息見表5。通過為期100 d的凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖試驗(yàn)，結(jié)果（表6）發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的終末體質(zhì)量、終末體長、日增重率、體長日增長率及特定生長率均顯著高于對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦（P＜0.05，下同），表明耐低鹽世代選育凡納濱對(duì)蝦群體的生長情況優(yōu)于常規(guī)的凡納濱對(duì)蝦群體。

我國溪蟹物種資源豐富，是全球多樣性最豐富的國家，很多種類還是我國的特有物種（楚克林等，2018）。但由于溪蟹研究起步相對(duì)較晚，長期以來溪蟹科分類及系統(tǒng)進(jìn)化一直存在較大爭議（石林波等，2012；鄒節(jié)新等，2013；Ma et al.，2019；Zhang et al.，2020）。本研究同時(shí)基于線粒體COI基因和線粒體基因組13個(gè)蛋白編碼基因序列構(gòu)建至今為止涵蓋物種最多的溪蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，基于2個(gè)數(shù)據(jù)集構(gòu)建得到的溪蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)具有一定差異，主要表現(xiàn)在基于蛋白編碼基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹支持率（Bootstrap valve）和后驗(yàn)概率（Posterior probability）普遍高于基于COI基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，表明前者具有更高的可信度。究其原因是單個(gè)基因攜帶的有效遺傳信息明顯少于多基因串聯(lián)序列，也是越來越多研究趨向于利用線粒體基因組全序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析的原因。雖然采用不同方法基于不同數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上有所不同，但所有樹型均顯示長安龍溪蟹與同屬的龍溪蟹未定種親緣關(guān)系最近，同時(shí)暗示龍溪蟹屬和近溪蟹屬為非單系群，今后可基于更多的物種數(shù)量及更多基因序列進(jìn)行重點(diǎn)驗(yàn)證。此外，本研究擴(kuò)增的COI基因序列包含有效信息位點(diǎn)太少，對(duì)于進(jìn)化地位尚有爭議的物種解析度略顯不足；同時(shí)比較分析的溪蟹代表種較少，某些屬（卷肢溪蟹屬Lophopotamon）僅包括1個(gè)物種，因此今后需進(jìn)一步擴(kuò)大取樣范圍，同時(shí)篩選更多的分子標(biāo)記以厘清溪蟹科系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系。

4 結(jié)論

20種溪蟹的線粒體COI基因序列平均種間遺傳距離為0.173，均具有區(qū)別于其他種類的特異位點(diǎn)，即線粒體COI基因序列可作為溪蟹科物種鑒定的分子標(biāo)記。