張嵐，姜淑泓，陳玉函，常樂，管俊翔，林強(qiáng)，于淼，喬志剛，王磊*

（1河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院/河南省水產(chǎn)動物養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心/水產(chǎn)動物疾病控制河南省工程實(shí)驗(yàn)室，河南新鄉(xiāng) 453007；2中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所，廣東廣州 510380）

0 引言

【研究意義】黃河鯉（Cyprinusy carpio）隸屬于鯉形目（Cypriniformes）鯉科（Cyprinidae），主產(chǎn)于黃河流域，是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，也是我國四大淡水名魚之一；因其適應(yīng)性廣，肉質(zhì)鮮嫩，營養(yǎng)價(jià)值高且寓意美好而受到廣大消費(fèi)者喜愛，目前已發(fā)展成為我國主要的淡水養(yǎng)殖品種之一。近年來，由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等引起的敗血病頻發(fā)導(dǎo)致黃河鯉大量死亡（Jiang et al.，2022），給黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失?？股氐人幬锏膹V泛使用極易造成細(xì)菌耐藥性增加及環(huán)境污染等問題（楊先樂和鄭宗林，2007）。因此，加快抗病品種培育對保障黃河鯉養(yǎng)殖業(yè)健康綠色發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】遺傳多樣性是一個(gè)物種群體生存適應(yīng)和發(fā)展進(jìn)化的前提。在遺傳相似性較高的宿主間，病原體傳播的可能性更高，而遺傳多樣性高的群體抵抗疾病暴發(fā)的能力更強(qiáng)（Altizer et al.，2003；King and Lively，2012；Gibson，2021；Pérez-González et al.，2021）。在羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）（朱其建等，2013；董丁健和戴習(xí)林，2020）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（張棟，2018）、凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）（方振朋，2019）、黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）（張佳佳，2019）中的研究均表明物種遺傳多樣性對其抗病性能、生長性狀、營養(yǎng)價(jià)值等方面具有積極作用。也有研究表明，近交過程中遺傳多樣性降低會從根本上影響種群抵御各種病原體的能力（Amills et al.，2004；Wang et al.，2020）。因此，抗病品種的選育通常伴隨著某些基因的雜合及群體遺傳多樣性的提高（董丁健和戴習(xí)林，2020）。目標(biāo)起始密碼子多態(tài)性（SCoT）作為一種新型的分子標(biāo)記（Collard and Mackill，2009），具有操作簡單、重復(fù)性好、可在物種中通用等優(yōu)點(diǎn)（Gorji et al.，2011；Korir et al.，2012），特別是作為一種目的基因分子標(biāo)記，不僅能獲得與性狀聯(lián)系緊密的目的基因，還能對性狀進(jìn)行跟蹤，非常有利于分子標(biāo)記輔助育種（Poczai et al.，2013）。目前，SCoT分子標(biāo)記廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物品種鑒定（Korir et al.，2012）、DNA指紋圖譜構(gòu) 建（Cabo et al.，2014；Hamidi et al.，2014）及遺傳多樣性分析（Etminan et al.，2016；歐景莉等，2019）等研究領(lǐng)域?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】SCoT分子標(biāo)記在水生生物中的研究主要集中在群體遺傳變異（Marie and Allam，2017；Abu Almaaty et al.，2020）及性別特異性分子標(biāo)記篩選（Mohamed et al.，2019；Mahgoub et al.，2021）等方面，但針對魚類抗病育種的研究鮮見報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】利用SCoT分子標(biāo)記對黃河鯉抗嗜水氣單胞菌不同群體的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，探討遺傳多樣性與其抗嗜水氣單胞菌能力的關(guān)系，為黃河鯉的抗病育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃河鯉（平均體質(zhì)量130 g）購自山東省東阿縣繡青水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社，暫養(yǎng)于室內(nèi)有效養(yǎng)殖水體1.7 m3的帆布池中，水溫控制在（28±2）℃，持續(xù)24 h增氧，確認(rèn)健康、無不良癥狀后用于后續(xù)試驗(yàn)。嗜水氣單胞菌由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所提供，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 感染處理方法

將嗜水氣單胞菌菌液加入100 mL腦心浸液肉湯（BHI）培養(yǎng)基中，經(jīng)28℃搖床（180 r/min）過夜培養(yǎng)12~18 h后取1 mL菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，防止PCR擴(kuò)增過程中受污染；菌液8000 r/min離心10 min，收集菌體，以無菌PBS進(jìn)行重懸并稀釋至1.23×107CFU/mL。隨機(jī)挑選300尾黃河鯉放入試驗(yàn)池中，水溫保持在（28±2）℃，暫養(yǎng)2 d，禁食。然后按照2 μL/g的劑量對每尾黃河鯉進(jìn)行腹腔注射嗜水氣單胞懸液，腹腔注射后每2 h觀察1次，如遇魚體死亡及時(shí)撈出并記錄死亡時(shí)間，剪取鰭條保存于無水乙醇中。連續(xù)7 d無死亡后停止試驗(yàn)并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.3 DNA提取與檢測

根據(jù)死亡順序分別選取最先死亡（The first dead population，F(xiàn)P）、最后死亡（The last dead population，LP）及存活（Survival population，SP）的黃河鯉各30尾，按照編號選取相應(yīng)鰭條，取相同大?。s0.5 cm×0.5 cm）的鰭條剪碎，然后采用動物組織/細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（D2100-100T，北京索萊寶科技有限公司），按照試劑盒說明提取基因組DNA。以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，通過NanoDrop One/OneC微量核酸蛋白濃度測定儀測定DNA濃度，質(zhì)量合格的DNA置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SCoT引物篩選及PCR擴(kuò)增

隨機(jī)選取4份DNA樣品進(jìn)行SCoT引物初篩選，從80條SCoT引物中篩選多態(tài)性好、重復(fù)性高、條帶清晰的引物（表1）。SCoT-PCR反應(yīng)體系20.0 μL：2×TaqPCR Master Mix 10.0 μL，SCoT引物1.0 μL，DNA模板20 ng，ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性4 min；95℃40 s，50℃50 s，72℃90 s，進(jìn)行36個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4℃保存。取8.0 μL SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳后，以BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)檢測并拍照保存。

表1 80條SCoT引物的序列信息Table 1 80 SCoT primers and information of their sequences

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

SCoT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按同一遷移水平下有無條帶分別賦值，有條帶記為1，無條帶記為0，人工讀取和統(tǒng)計(jì)條帶。使用PopGene32對3個(gè)黃河鯉群體的所有個(gè)體及群體等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon's信息指數(shù)（I）進(jìn)行分析，采用Arlequin 3.5對黃河鯉3個(gè)群體進(jìn)行分子方差變異（AMOVA）分析，通過MEGA 7.0中的非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，并以Structure 2.3進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性群體的劃分結(jié)果

人工感染嗜水氣單胞菌后24 h即出現(xiàn)黃河鯉死亡現(xiàn)象，隨后黃河鯉死亡率增加，至感染后48 h達(dá)峰值，300尾黃河鯉的累積死亡率為40.0%。在人工感染試驗(yàn)過程中最先死亡的視為高感群體（FP），最后死亡的視為低感群體（LP），而人工感染嗜水氣單胞菌后1周仍存活的視為抗病群體（SP）。感染后死亡的黃河鯉腹部泛紅甚至潰爛，泄殖孔充血，鰓絲出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象；解剖發(fā)現(xiàn)其腹腔及內(nèi)臟有出血點(diǎn)，符合黃河鯉感染嗜水氣單胞菌的病理學(xué)特征。

2.2 SCoT位點(diǎn)多態(tài)性及群體遺傳多樣性分析結(jié)果

選取部分DNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果從80條SCoT引物中篩選出18條擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性好的引物（表2）。圖1為引物SCoT34在3個(gè)黃河鯉群體中的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。篩選出的18條SCoT引物共擴(kuò)增出103條條帶，范圍為3~11條，其中多態(tài)性條帶97條，平均每條SCoT引物擴(kuò)增出5.4條多態(tài)性片段，范圍為2~11條，多態(tài)性比率為94.17%。在3個(gè)黃河鯉群體中，SP群體的多態(tài)性比率最高，為83.50%；其余2個(gè)群體的多態(tài)性比率分別為79.61%（FP）和81.55%（LP）。3個(gè)黃河鯉群體的Na范圍為1.7961~1.8155，Ne范圍為1.3828~1.4029，H范圍為0.2258~0.2467，I范圍為0.3453~0.3804。在FP、LP和SP群體中，Na、Ne、H和I均依次遞增（表3）。群體間的遺傳分化指數(shù)（Gst）為0.0972，即90.28%的遺傳多樣性分布在群體內(nèi)部，表明黃河鯉群體間的遺傳變異小于群體內(nèi)的遺傳變異。

表3 3個(gè)黃河鯉群體的遺傳多樣性水平Table 3 Genetic diversity of 3 C.carpio populations

圖1 引物SCoT34在3個(gè)黃河鯉群體中的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果Fig.1 PCR amplification electrophoresis of primer SCoT34 in 3 C.carpio populations

表2 18條SCoT引物的擴(kuò)增結(jié)果Table 2 Amplification results of 18 SCoT primers

2.3 黃河鯉群體遺傳分化分析結(jié)果

3個(gè)黃河鯉群體的AMOVA分析結(jié)果顯示，群體間和群體內(nèi)的方差貢獻(xiàn)率分別為12.99%和87.01%（表4），表明群體內(nèi)的遺傳變異大于群體間。遺傳分化指數(shù)（Fst）是衡量群體間遺傳分化程度的重要參數(shù)（黃小芳等，2020；徐煜等，2021），F(xiàn)st為0~0.05時(shí)表示群體間無遺傳分化，F(xiàn)st為0.05~0.15時(shí)表示群體間存在輕度遺傳分化，F(xiàn)st為0.15~0.25表示群體間存在中度遺傳分化，F(xiàn)st大于0.25時(shí)表示群體間存在高度遺傳分化。3個(gè)黃河鯉群體的Fst為0.1299（表4），屬于輕度遺傳分化；群體間的Nei's遺傳距離（Ds）分布在0.0248~0.0835（表5），其中FP群體與SP群體的遺傳距離最大。

表4 3個(gè)黃河鯉群體的AMOVA分析結(jié)果Table 4 AMOVA analysis result of 3 C.carpio populations

表5 3個(gè)黃河鯉群體的Nei's遺傳距離（對角線下）及遺傳相似性（對角線上）Table 5 Nei’s genetic distance（below diagonal）and genetic similarity（above diagonal）of 3 C.carpio populations

2.4 黃河鯉群體遺傳結(jié)構(gòu)聚類分析結(jié)果

基于Ds的UPGMA聚類分析結(jié)果（圖2）表明，F(xiàn)P群體和LP群體聚為一支，SP群體單獨(dú)聚為一支。黃河鯉群體遺傳結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，Mean lnP（K）、ΔK隨著亞群數(shù)K的增加而變動，K=2.0時(shí)，Mean lnP（K）出現(xiàn)最大拐點(diǎn)和ΔK最大值（圖3），因此認(rèn)為K=2.0是最可能的模型，推測3個(gè)黃河鯉群體可分為2個(gè)亞群（FP和SP）。其中，LP群體由FP群體和SP群體集合而成（圖3）。

圖2 基于Ds構(gòu)建的3個(gè)黃河鯉群體UPGMA聚類樹Fig.2 UPGMA clustering tree of 3 C.carpio populations based on Ds

圖3 3個(gè)黃河鯉群體的遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果Fig.3 Genetic component analysis of 3 C.carpio populations

3 討論

物種的進(jìn)化潛力及抵御不良因素的能力取決于種內(nèi)遺傳變異程度（Gibson，2021）。雜合度及群體多態(tài)性信息含量越高的生物對環(huán)境的適應(yīng)能力越強(qiáng)，在生長、繁殖和抗逆等方面更具優(yōu)勢。Na和Ne是分析群體遺傳多樣性的重要指標(biāo)（任建功等，2021）。本研究中，SP群體的Ne均高于FP群體和LP群體，說明相對于存活群體，死亡群體的遺傳多樣性有所下降。多態(tài)性比率能直觀反映群體的多樣性程度。3個(gè)黃河鯉群體的平均多態(tài)性比率為94.17%，具有較高的遺傳多態(tài)性，尚未受到高強(qiáng)度的人工選擇。FP群體、LP群體的多態(tài)性比率分別為79.61%和81.55%，SP群體的多態(tài)性比率為83.50%，表明存活群體較死亡群體具有更高的遺傳多態(tài)性。在本研究中，多態(tài)性比率、Ne及I等遺傳參數(shù)均隨著黃河鯉群體抗病性的提高而增大，故推測黃河鯉抗嗜水氣單胞菌的能力與其遺傳多樣性呈正相關(guān)。朱其建等（2013）基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記對羅氏沼蝦抗病選育群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示抗病能力較強(qiáng)的4個(gè)群體遺傳多樣性最豐富。有關(guān)螞蟻（Formica selysi）（Reber et al.，2008）、小麥（Triticum aestivum）（Zhan et al.，2013）等生物群體遺傳多樣性的研究也表明遺傳多樣性高的群體抗病力更強(qiáng)。還有研究表明，種群遺傳多樣性能增強(qiáng)群體遭受疾病或其他自然災(zāi)害后的恢復(fù)力（Hajjar et al.，2008；Grettenberger and Tooker，2015；Yang et al.，2019）。可見，在面對同樣的疾病脅迫時(shí)遺傳多樣性高的群體有望獲得更高的產(chǎn)量和收益。

遺傳距離能有效反映物種間的遺傳變異（梁業(yè)松等，2022）。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)P群體與SP群體間的Ds最大（0.0835），而FP群體與LP群體間的Ds最?。?.0248），說明2個(gè)死亡群體間的遺傳分化程度相對較低。AMOVA分析結(jié)果與群體間的Gst相一致，均表明黃河鯉的遺傳變異主要存在于群體內(nèi)，群體間無明顯的遺傳分化?；贒s的UPGMA聚類分析結(jié)果顯示，F(xiàn)P群體和LP群體聚為一支，SP群體單獨(dú)聚為一支，也表明2個(gè)死亡群體間的親緣關(guān)系較近，其抵抗嗜水氣單胞菌的能力相對較弱。利用Structure 2.3對黃河鯉群體的種群遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測，認(rèn)為K=2.0是最可能的模型，即3個(gè)黃河鯉群體可分為2個(gè)亞群，即抗病群體（SP）和易感群體（FP和LP）。其中，LP群體由SP群體和FP群體集合而成，表明通過黃河鯉死亡時(shí)間劃分的群體與通過聚類分析及遺傳結(jié)構(gòu)分析得出的群體基本一致。

目前，因嗜水氣單胞菌感染引起的敗血病在黃河鯉群體中頻繁暴發(fā)，已成為黃河鯉養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的主要病害之一（Jiang et al.，2016）。遺傳同質(zhì)化群體較遺傳多樣化群體更易受到病原體感染，即保持群體遺傳多樣性可減緩疾病對種群造成的危害（King and Lively，2012）。與野生種群相比，養(yǎng)殖魚類的遺傳多樣性通常較低，是由于近交或針對某些重要的經(jīng)濟(jì)性狀進(jìn)行人工選擇所造成。因此，開展黃河鯉抗病育種時(shí)應(yīng)加強(qiáng)對其抗病基因的研究，提高抗病育種親本選配的目標(biāo)性，更好地利用抗病基因資源培育抗病新品種（系）。

4 結(jié)論

黃河鯉抗嗜水氣單胞菌的能力隨著群體遺傳多樣性的增大而增強(qiáng)。因此，在黃河鯉抗病品種（系）選育過程中應(yīng)保證足夠的群體數(shù)量，在提高生長、營養(yǎng)等經(jīng)濟(jì)性狀的同時(shí)保證一定的基因雜合度。