劉 婷，劉師卜，鄭濟凡，張露勇*，張斗勝

中國食品藥品檢定研究院 1 食品檢定所；2 化學藥品檢定所，北京102629

人類腸道菌群由大量與人體生長發(fā)育密切相關、寄生在胃腸道表面的微生物菌群構成，包括數(shù)百個菌種，數(shù)量以百萬億計[1]。其中既包括對人體有益的有益菌，如乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌等，也有對人體有害的條件致病菌，如腸桿菌、腸球菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。有益菌可以促進營養(yǎng)物質的消化吸收，提高機體免疫力，緩解炎癥，防止病原體的入侵等；而條件致病菌則可能導致炎癥、腹瀉等疾病的發(fā)生。腸道菌群失調表現(xiàn)為腸道內優(yōu)勢菌屬的大幅度改變超出正常范圍，特別是有益菌的減少和條件致病菌的增加。越來越多證據(jù)表明，腸道菌群失調不但可引發(fā)多種消化道疾病[2]，而且與免疫系統(tǒng)疾病[3]、呼吸系統(tǒng)疾病[4，5]、心血管疾病[6，7]、阿爾茨海默病[8]、2型糖尿病[9]、腫瘤[10]甚至精神類疾病[11，12]密切相關。

近年來，研究采用多種方式調節(jié)人體腸道菌群及代謝物組成，從而實現(xiàn)功能治愈或改善，達到疾病治療或輔助治療目的，成為研究熱點之一[13]。其中，中藥材多數(shù)為天然產(chǎn)物，具有多種活性，可通過復雜的機制發(fā)揮調節(jié)腸道功能的作用[14]，為開展此項研究提供了豐富的資源。有研究表明，人參可以使雙歧桿菌、乳酸桿菌、異葉桿菌、梭狀芽胞桿菌等益生菌顯著增加[15]；白術能夠增加雙歧桿菌和乳桿菌的數(shù)量[16]，茯苓、白術可以有效抑制大腸埃希菌、糞腸球菌[17]；山藥中的山藥多糖既可增加腸道中雙歧桿菌、乳桿菌的數(shù)量，又能減少腸桿菌、腸球菌的數(shù)量[18]。將以上幾種中藥材與其他藥材配伍制成組方如四君子湯等，可發(fā)揮調節(jié)小鼠或人腸道菌群的作用[19]，為調節(jié)腸道菌群功效研究提供了新的思路和手段。

伴服牌腸道菌定植飲（以下簡稱“DZY”）是綜合多種單方藥性而開發(fā)的中藥組方，由人參、白術、茯苓、山藥經(jīng)粉碎混合制成。本研究以DZY 為研究對象，除采用標準方法——小鼠模型外，還采用近年新發(fā)展的斑馬魚作為動物模型，通過兩種方法對比分析，研究并驗證DZY 對腸道菌群的調節(jié)作用。實驗表明，DZY 能夠在抑制條件致病菌的同時，還可增加有益菌的數(shù)量，具有較好的調節(jié)腸道菌群的作用。

1 材 料

1.1 實驗動物和菌株

SPF 級C57BL/6 種小鼠40只，雄性，體重18～20 g，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2017-0005。動物室飼養(yǎng)環(huán)境為屏障環(huán)境，全密閉狀態(tài)，三級過濾送風，溫度22℃～24℃，相對濕度40%～70%，日光燈12 h照明，許可證號：SYXK（京）2016-0004。SPF 級小鼠生長繁殖飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司生產(chǎn)，許可證號：京飼證（2018）06073。

野生型AB 品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。斑馬魚飼養(yǎng)于28℃的養(yǎng)魚用水中（水質：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導率為450～550 μS·cm-1；pH 為6.5～8.5；硬度為50～100 mg·L-1CaCO3），由杭州環(huán)特生物科技公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為：SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC 認證（認證編號：001458）的要求。

腸桿菌（Enterobacter sp.，CICC10626，CICC）、腸球菌（Enterococcus faecalis，CICC23658，CICC）、產(chǎn)氣莢膜梭菌（Clostridium perfringens，CICC22949，CICC）、乳桿菌（Lactobacillus plantarum subsp.plantarum，CICC10481，CICC）、雙歧桿菌（Bifidobacterium longum subsp.infantis，BNCC185971，BNCC）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis，CGMCC1.2028，CGMCC）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis，BNCC134301，中國科學院上海生命科學研究院），由中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 材料與儀器

DZY（20210714QZ，北京乾兆信業(yè)生物科技有限公司），淡黃色粉末，于陰涼、避風、干燥處保存。無菌番茄浸出液（批號200314）、檸檬酸鐵銨（批號191220）、D-環(huán)絲氨酸（批號191220）、伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基（批號190827）、疊氮鈉-結晶紫-七葉苷培養(yǎng)基（批號190730）、TSC 培養(yǎng)基（批號190910）、LBS 瓊脂（批號190409）、雙歧桿菌瓊脂基礎培養(yǎng)基（批號200421）、革蘭氏染液（批號200508），均購于北京陸橋技術公司；磷酸二氫鈉（批號20191223）、磷酸氫二鈉（批號20170306）、磷酸鹽緩沖液（批號20200416），均購于國藥集團化學試劑公司；卵黃瓊脂平板（批號20200509）、乳糖發(fā)酵管（批號20200420）、動力-硝酸鹽培養(yǎng)基（批號20200403）、液體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基（批號20190522）、含鐵牛乳培養(yǎng)基（批號20200425），均購于海博生物技術公司；過氧化氫（批號20181009，上海滬試）；硝酸鹽還原試劑（批號200529，北京三藥科技開發(fā)公司）。

常欣衛(wèi)口服液（批號19127ACA01，無極限中國公司）；PBS 緩沖液（批號70115000，Biosharp）；甲基纖維素（批號B2006074，上海阿拉丁生化科技公司）；BBL 液體培養(yǎng)基（批號20200304，青島海博生物技術公司）；MRS 肉湯培養(yǎng)基（批號1109H031，北京索萊寶科技公司）；CM-DiI 細胞標記溶液（批號2174897），DiO 細胞標記溶液（批號2174897）賽默飛世爾科技中國公司。

解剖顯微鏡（SZX7，Olympus，Japan）；精密電子天平（CP214，Ohaus，USA）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon，Japan）；CCD 相機（VertA1，上海土森視覺科技公司）；恒溫振蕩器（HZ-9211K，太倉市華利達實驗設備公司）；臺式大容量低速離心機（TD5A，長沙英泰儀器公司）；垂直層流潔凈工作臺（CA-1390-1，上海上凈凈化設備公司）；高壓蒸汽滅菌鍋（IMJ-54A，STIK，USA）；生物安全柜（NU-437-600S，NuAire，USA）。

2 方 法

2.1 DZY 對調節(jié)小鼠腸道菌群功能的影響

2.1.1 劑量設置 將小鼠隨機分成4組，陰性對照組，低、中、高DZY 劑量組，每組10 只。低、中、高3組劑量分別為0.41、0.82、2.46 g·kg-1，即相當于人擬用量的5 倍、10 倍、30 倍。實驗前取DZY 6.15 g，邊研磨邊加入蒸餾水至50 mL，配制成0.123 g·mL-1作為高劑量組，并依次稀釋至0.041、0.020 g·mL-1作為中、低劑量組。各組動物按0.2 mL/10 g 灌胃，每次灌胃前搖勻。陰性對照組，給予等體積滅菌蒸餾水。每日一次，連續(xù)給予30 天后測定各項指標。

2.1.2 腸道菌群檢測 實驗前無菌取小鼠糞便0.01～0.05 g，置已稱重的干燥滅菌的離心管內，準確稱重并計算小鼠糞便重量。加入無菌生理鹽水10倍系列稀釋，選擇適宜的稀釋度分別接種于相應的培養(yǎng)基上，并按條件培養(yǎng)。培養(yǎng)后，以菌落形態(tài)、革蘭氏染色鏡檢測、鑒定并計數(shù)菌落，計算每克濕便中的菌落數(shù)，取對數(shù)后進行統(tǒng)計處理。最后一次給予受試樣品后24 h，與實驗前同樣方式取糞便，檢測腸道菌群。各腸道菌群所用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件見表1[20]。

表1 腸道菌群用培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

2.2 DZY 對調節(jié)斑馬魚腸道菌群功能的影響

2.2.1 最小中毒濃度（MTC）測定 短乳桿菌于37℃MRS 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，青春雙歧桿菌于37℃BBL 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。使用CM-DiI 紅色熒光標記青春雙歧桿菌，DiO 綠色熒光標記短乳桿菌，均以1×108cfu·mL-1濃度短乳桿菌和青春雙歧桿菌同時飼喂受精后5 天（5 dpf）野生型AB 品系斑馬魚，建立斑馬魚腸道菌群模型[21]。將模型斑馬魚放置35℃培養(yǎng)至6 dpf，將其取出，用干凈的養(yǎng)魚用水沖洗后，隨機分配至6 孔板中，實驗組每孔均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予DZY，同時設置模型對照組和正常對照組，每孔容量為3 mL。DZY 處理期間，統(tǒng)計各實驗組的斑馬魚死亡數(shù)量并及時移除。35℃處理24 h后，測定DZY 對模型斑馬魚的MTC。

2.2.2 調節(jié)腸道菌群功效評價 以調節(jié)腸道菌群益生元保健食品常欣衛(wèi)口服液作為陽性對照，配制成8.30 μL·mL-1。使用CM-DiI 紅色熒光標記青春雙歧桿菌，DiO 綠色熒光標記短乳桿菌，均以1×108cfu·mL-1濃度短乳桿菌和青春雙歧桿菌同時飼喂5 dpf野生型AB 品系斑馬魚，建立斑馬魚腸道菌群模型。將模型斑馬魚放置35℃培養(yǎng)至6 dpf，取出斑馬魚，用干凈的養(yǎng)魚用水沖洗后，隨機分配至6 孔板中，每孔（實驗組）均處理30 尾斑馬魚。分別水溶給予DZY（相當于擬人用量的2.03×10-4、4.06×10-4、8.12×10-4倍）、常欣衛(wèi)口服液（8.30 μL·mL-1，相當于推薦人用量的4.15×10-4倍），同時設置模型對照組，每孔容量為3 mL。35℃繼續(xù)處理24 h后，每個實驗組隨機選取10 尾斑馬魚置于熒光顯微鏡下拍照，使用NIS-Elements D 3.20 高級圖像處理軟件采集數(shù)據(jù)，分析腸道短乳桿菌和青春雙歧桿菌的熒光強度，以上述指標的統(tǒng)計學分析結果評價DZY 調節(jié)腸道菌群功效。

2.3 結果統(tǒng)計

用SPSS 26.0 軟件（IBM，USA）進行單因素方差分析。P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 DZY 對調節(jié)小鼠腸道菌群功能的影響

3.1.1 DZY 對小鼠體重的影響 按照“2.1.1”方法實驗，結果見表2。

由表2 可知，實驗開始前（0 周），陰性對照組與低、中、高劑量組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。經(jīng)口給予不同劑量受試物30 d（4 周）后，4 組小鼠體重增重顯示差異也無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明給予DZY 對小鼠進食、生長發(fā)育無不良影響。

表2 DZY 對小鼠體重的影響（±s）（n=10）

表2 DZY 對小鼠體重的影響（±s）（n=10）

3.1.2 DZY 對小鼠腸道菌群數(shù)量的影響 按照“2.1.2”方法實驗。

如表3 所示，實驗前各組小鼠糞便中腸桿菌差異無統(tǒng)計學意義；實驗后各組差異也未見統(tǒng)計學顯著意義（P ＞0.05）。

表3 DZY 對小鼠腸桿菌數(shù)量的影響（n=10）

如表4 所示，實驗前4 組小鼠腸球菌菌數(shù)差異無統(tǒng)計學意義；實驗后各組菌數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明DZY 對小鼠腸道中的條件致病菌腸桿菌和腸球菌數(shù)量無明顯影響。

表4 DZY 對小鼠腸球菌數(shù)量的影響（n=10）

如表5 所示，隨著小鼠的生長，陰性對照組小鼠腸道內產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量由（7.21±0.55）cfu·g-1增加至（7.64±0.48）cfu·g-1，這種趨勢與文獻報道一致[22]。而給予DZY后，低、中、高劑量組小鼠產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量分別顯著降低至（7.19±0.57）cfu·g-1、（7.05±0.55）cfu·g-1、（6.92±0.60）cfu·g-1（P<0.01）；同時，實驗后較實驗前陰性對照組產(chǎn)氣莢膜梭菌的數(shù)量顯著增加，中劑量組顯著降低，低、高劑量組差異無統(tǒng)計學意義。說明各劑量DZY 均可以顯著促進小鼠腸道內產(chǎn)氣莢膜梭菌的生長。

表5 DZY 對小鼠產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量的影響（n=10）

如表6 所示，給予DZY后，各組小鼠乳桿菌比較差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表6 DZY 對小鼠乳桿菌數(shù)量的影響（n=10）

如表7 所示，陰性對照組腸道內雙歧桿菌數(shù)量由（10.09±0.61）cfu·g-1減少至（9.50±0.63）cfu·g-1。給予DZY后，低、中、高劑量組雙歧桿菌分別為（9.90 ± 0.27）cfu·g-1、（9.94 ± 0.39）cfu·g-1、（10.30 ±0.29）cfu·g-1，較陰性對照組的（9.50±0.63）cfu·g-1顯著增加（P<0.05 或P<0.01）；同時，實驗后較實驗前陰性對照組、低劑量組、中劑量組雙歧桿菌數(shù)量均顯著降低（P<0.05 或P<0.01），而高劑量組則顯著增加（P<0.01）。表明DZY 對小鼠腸道中乳桿菌數(shù)量無明顯影響，但可顯著增加雙歧桿菌的數(shù)量。

表7 DZY 對小鼠雙歧桿菌數(shù)量的影響（n=10）

DZY 在調節(jié)小鼠腸道菌群試驗中，以0.41、0.82、2.46 g·kg-1的DZY 對小鼠經(jīng)口灌胃30天，實驗前后各劑量組小鼠體重、腸球菌、腸桿菌、乳桿菌與陰性對照組比較，實驗前后自身比較，均無差異（P>0.05）。實驗后低、中、高劑量組雙歧桿菌數(shù)量均顯著高于陰性對照組；3 個劑量組的產(chǎn)氣莢膜梭菌均極顯著低于陰性對照組（P<0.05，P<0.01）。參照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范（2003 版）》，判定DZY對正常小鼠具有調節(jié)腸道菌群的作用。

3.2 DZY 對調節(jié)斑馬魚腸道菌群功能的影響

DZY 對模型斑馬魚的MTC 測定結果見表8。當DZY 濃度為2000、4000μg·mL-1時，均未見死亡，對斑馬魚死亡率的影響與對照組、模型組無顯著差別；當DZY 濃度為6000μg·mL-1時，斑馬魚雖未見死亡，但狀態(tài)明顯變差；當DZY 濃度＞8000 μg·mL-1時，斑馬魚死亡率高達100%，表明DZY 濃度＜4000 μg·mL-1時，對斑馬魚生長發(fā)育影響較小，故以其作為進一步功效研究的界限濃度。

表8 DZY 對模型斑馬魚的MTC 測定結果（n=30）

3.3 DZY 對斑馬魚調節(jié)腸道菌群功效評價

統(tǒng)計與熒光成像分析DZY 對短乳桿菌和青春雙歧桿菌的影響見圖1～3。由圖1 顯示，隨著菌群數(shù)量的增加，檢測到的熒光強度值也隨之增強，且與喂飼濃度相關。與模型對照組相比，給予1000、2000、4000 μg·mL-1DZY 能都顯著增加斑馬魚腸道中短乳桿菌、青春雙歧桿菌的數(shù)量（P<0.05，P<0.01 或P<0.001）；而當給予4000 μg·mL-1DZY時，對斑馬魚腸道中青春雙歧桿菌數(shù)量的增加與陽性對照常欣衛(wèi)口服液相當。

圖1 DZY 對斑馬魚中短乳桿菌（A）、青春雙歧桿菌（B）熒光強度的影響（n=10），*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

熒光成像表征出DZY 不同喂飼濃度對短乳桿菌和青春雙歧桿菌的影響變化趨勢。如圖2、圖3 所示，與模型對照組相比，在DYZ 3 種濃度的斑馬魚腸道中，短乳桿菌、青春雙歧桿菌熒光成像更清晰、飽滿；在DYZ 高劑量組的斑馬魚腸道中，青春雙歧桿菌熒光圖與陽性對照常欣衛(wèi)口服液的熒光圖相似。統(tǒng)計與熒光成像結果表明，DZY 具有調節(jié)腸道菌群的功效，其與小鼠模型實驗結果一致。

圖2 DZY 處理后斑馬魚腸道短乳桿菌熒光典型圖

圖3 DZY 處理后斑馬魚腸道青春雙歧桿菌熒光典型圖

4 討論

通過培養(yǎng)小鼠糞便中的細菌，采用計數(shù)的方式，考察目標物對腸道菌群的影響是我國保健食品調節(jié)腸道菌群功能的規(guī)定方法。其值得注意的是，小鼠腸道菌群的組成和數(shù)量往往隨著小鼠的生長有較大變化，且該變化有正向也有反向的，例如產(chǎn)氣莢膜桿菌陰性對照組實驗前后明顯升高，其余則有降低趨勢。因此，建議使用18～22 g、9～10 周齡成熟小鼠試驗，此時小鼠體內腸道菌群處于較穩(wěn)定的狀態(tài)。

斑馬魚由于其成長周期短、易于觀察等優(yōu)勢，已作為脊椎動物模型廣泛應用于多種實驗研究中。由于斑馬魚在發(fā)育和功能上與哺乳動物胃腸道高度同源[23]，因此將其應用范圍擴展至哺乳動物腸道菌群的研究具有可行性。乳桿菌和雙歧桿菌是常見且研究應用較為成熟的益生菌。乳桿菌中的短乳桿菌在斑馬魚黏液和黏膜中均有分布，是雜交型的菌株，相較于黏膜型的植物乳桿菌以及粘液型的鼠李糖等，具有更強的減輕腸道炎癥和抗氧化等益生作用[24]。同時，短乳桿菌還可以顯著增加乳酸桿菌等益生菌的豐度，降低梭狀芽孢桿菌等致病菌的豐度[25]。青春雙歧桿菌是人體腸道中最豐富的雙歧桿菌之一，能顯著改善人群健康狀況，近年來已成為新的研究熱點。因此，本研究重點考察了DZY 對斑馬魚中短乳桿菌和青春雙歧桿菌數(shù)量的影響。

DZY 在小鼠和斑馬魚體內均表現(xiàn)出了增加有益菌數(shù)量的效果，并能在一定程度上抑制條件致病菌的生長，表明DZY 具有調節(jié)腸道菌群的作用。斑馬魚模型結合熒光檢測，具有指標客觀、分析可視化等優(yōu)點，應用于調節(jié)腸道菌群功效研究具有良好潛力。