戴麗娜，陳泳君，楊 穎

連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，連云港222006

桑白皮為桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥根皮，又名桑皮、桑根白皮，始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有瀉肺平喘及利水消腫的功效[1]，是臨床常用的中藥材之一。近年來(lái)，有研究表明，桑白皮提取物具有美白功效，且因其毒性很低，相比于化學(xué)美白劑具有更高的安全性，同時(shí)桑樹(shù)在我國(guó)廣泛栽種，具有豐富的應(yīng)用資源，成本低廉，從而在化妝品美白領(lǐng)域得到越來(lái)越多的關(guān)注，具有廣闊的研發(fā)前景[2，3]。對(duì)于桑白皮中的有效美白成分，需要建立合適的提取方法，以達(dá)到既能有效地提取最大含量的活性組分，又不危害人員的身體健康、不污染環(huán)境的目的。通過(guò)查閱桑白皮的研究文獻(xiàn)[4，5]，主要通過(guò)水、甲醇和乙醇進(jìn)行不同程度的萃取。甲醇屬于《化妝品安全技術(shù)規(guī)范（2015 年版）》中的禁用物質(zhì)，即不得添加使用，但其可能作為其它化妝品原料的雜質(zhì)被帶入，故該規(guī)范規(guī)定化妝品中甲醇含量不得超過(guò)2000 mg·kg-1。乙醇作為一種有機(jī)溶劑，它會(huì)溶解皮脂膜甚至細(xì)胞間脂質(zhì)中的油脂，造成皮膚屏障功能被破壞，對(duì)于含有乙醇的護(hù)膚品，一向存在爭(zhēng)議。綜合上述情況，本研究選取水作為提取溶劑。研究發(fā)現(xiàn)，桑白皮化學(xué)成分主要為黃酮、苷以及其他類型化合物[6]。2020 年版《中國(guó)藥典》未對(duì)桑白皮成分含量測(cè)定項(xiàng)作出規(guī)定。本研究建立同時(shí)測(cè)定桑白皮水提物中6個(gè)主要成分（桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C）含量的方法，以期為桑白皮水提物中的成分進(jìn)行測(cè)定提供依據(jù)。

1 儀器與藥品、試劑

1.1 儀器

Thermo U3000 高效液相色譜儀，二極管陣列檢測(cè)器（賽默飛世爾科技有限公司）；BT125D 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ-300DE 型超聲波清洗器（昆山超聲波儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

對(duì)照品：綠原酸（批號(hào)：110753-202018，純度：96.1%，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院）；單寧酸（批號(hào)：040106-202203，純度：98.46%，上海鴻永生物科技有限公司）；桑皮苷A（批號(hào)：JOT-11177，純度：99.22%）、桑根酮C（批號(hào)：JOT-11145，純度：90.90%）、桑根酮D（批號(hào)：JOT-11146，純度：94.62%）、桑酮G（批號(hào)：JOT-11265，純度：99.11%，自成都普菲德生物技術(shù)有限公司）。

乙腈（色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司）；甲酸為色譜級(jí)；水為超純水。

桑白皮藥材（來(lái)源：江蘇仟草堂藥業(yè)有限公司，產(chǎn)地：安徽，批號(hào)：211001、211003、211206、220510、220602、220603），經(jīng)連云港市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心馬冬云主任中藥師鑒定為?？浦参锷＃∕orus alba L.）的干燥根皮。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 分別取桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 對(duì)照品適量，精密稱定，置于同一50 mL 量瓶中，加甲醇適量，經(jīng)超聲振蕩（頻率：50 kHz，功率：200 W）溶解后，用甲醇稀釋成桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 的質(zhì)量濃度依次為1618、1609、1252、1642、1593、1549 μg·mL-1的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取該儲(chǔ)備溶液1 mL，置于10 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取經(jīng)干燥后粉碎的桑白皮粉末約2.0 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加入超純水約50 mL，回流提取2 h，過(guò)濾，濾渣繼續(xù)提取2 h，合并濾液，濃縮至10 mL，用0.45 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A 相為乙腈，B 相為0.2%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～10.0 min，5.0%A→35.0%A；10.0～20.0 min，35.0%A →50.0%A；20.0～30.0 min，50.0%A；30.0～40.0 min，50.0%A →70.0%A；40.0～42.0 min，70.0%A→5.0%A；42.0～50.0 min，5.0%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm（用于單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C）、320 nm（用于桑皮苷A、綠原酸）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

結(jié)果表明，理論板數(shù)按桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 計(jì)均大于8000，各待測(cè)成分峰與相鄰峰之間的分離度均大于1.5。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品和樣品的HPLC 色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0.1、0.2、0.5、1、1、1、2mL，分別置于50、50、25、25、10、5、5 mL 量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以各成分的質(zhì)量濃度（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 6 個(gè)成分回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)（n=7）

2.3.2 檢測(cè)限和定量限 將“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，用50%甲醇逐步稀釋至低濃度，以信噪比（S/N）3 作為檢測(cè)限（LOD），信噪比（S/N）10 作為定量限（LOQ），得出桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 的檢測(cè)限分別為0.13、0.33、0.32、0.15、0.17、0.30 μg·mL-1，定量限分別為0.43、1.10、1.07、0.50、0.57、1.00 μg·mL-1。

2.3.3 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下制得的混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄結(jié)果，計(jì)算得出桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 峰面積的RSD（n=6）分別為0.41%、0.55%、0.83%、0.44%、0.25%、0.56%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)（211001）的桑白皮樣品，分別按“2.1.2”項(xiàng)下的方法配制6 份供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件平行測(cè)定6次，記錄色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算得出樣品中桑皮苷A、綠原酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 含量的RSD（n=6）分別為0.44%、0.70%、1.46%、1.39%、0.55%，結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的桑白皮樣品（批號(hào)：211001）約2.0 g，共9份，精密稱定，分為3組，每組分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液（桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C的質(zhì)量濃度依次為1618、1609、1252、1642、1593、1549 μg·mL-1）0.8、1.6、2.4 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下的方法制得供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算回收率和RSD，結(jié)果上述6 個(gè)成分平均加樣回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為99.18%（0.45%）、99.06%（0.33%）、98.96%（0.59%）、98.76%（0.36%）、98.99%（0.47%）、98.90%（0.49%）。

2.3.6 耐用性試驗(yàn) 選取3 種不同型號(hào)的色譜柱：Phenomenex Gemini C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Eclipse Plus C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters Supelco Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定并記錄結(jié)果。通過(guò)分析高效液相色譜圖，桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 在3 種色譜柱上均能與其他組分得到滿意的分離度，樣品色譜圖中指標(biāo)成分的色譜峰與對(duì)照品中相應(yīng)峰在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)的UV 吸收光譜一致，表明方法耐用性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液（批號(hào)：211001）適量，在室溫下放置0、2、4、8、12、24、48、72 h后，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果24 h內(nèi)桑皮苷A、綠原酸、單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C 峰面積的RSD 分別為0.39%、0.68%（n=6），24 h 之后6 個(gè)成分的峰面積均減小30%以上，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，超過(guò)24 h 供試品溶液中6 個(gè)成分均有較大程度降解，提示應(yīng)在24 h內(nèi)進(jìn)樣，以保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確。

2.4 含量測(cè)定

取收集到的6 批桑白皮樣品，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備3份，分別將混合對(duì)照品溶液和供試品溶液按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。按外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 桑白皮水提物中6 個(gè)成分的含量測(cè)定結(jié)果（μg·g-1，n=3）

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

本試驗(yàn)參考相關(guān)文獻(xiàn)[7，8]，分別考察了甲醇、乙腈作為有機(jī)相，水、甲酸水溶液、磷酸鹽水溶液作為水相時(shí)桑皮苷A 等6 個(gè)指標(biāo)成分的色譜峰分離情況，發(fā)現(xiàn)當(dāng)選用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，6 個(gè)成分的色譜峰對(duì)稱性差，理論塔板數(shù)低，且基線不平穩(wěn)，影響檢測(cè)結(jié)果。當(dāng)有機(jī)相改為乙腈時(shí)，雖然各峰之間分離度達(dá)到要求，但仍有有不同程度的拖尾現(xiàn)象。比較甲醇-0.2%甲酸、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%磷酸氫二鉀水溶液，各成分色譜峰峰型均有所改善，但乙腈作為有機(jī)相時(shí)色譜峰對(duì)稱因子更小，而且為使各成分色譜峰分離度符合要求，選擇洗脫能力強(qiáng)的乙腈更有優(yōu)勢(shì)。在乙腈-磷酸鹽體系下，各成分色譜峰均有良好的峰型；但從環(huán)保的角度考慮，還是選用0.2%甲酸水作為水相。由于各指標(biāo)成分極性有較大差異，故選擇梯度洗脫方式，從而縮短分析時(shí)間，提高分離效果。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

按照上述確定的流動(dòng)相，將混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣測(cè)定，采用二極管陣列檢測(cè)器，在波長(zhǎng)200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)待測(cè)分析物進(jìn)行全掃描，結(jié)果如圖2 所示，桑皮苷A、綠原酸在波長(zhǎng)216、325 nm 處有最大吸收，單寧酸在波長(zhǎng)216、278 nm 處有最大吸收，桑根酮C、桑根酮D 在波長(zhǎng)282、310 nm 處有最大吸收，桑酮G 在波長(zhǎng)262、317 nm 處有最大吸收，綜合考慮末端吸收、檢測(cè)靈敏度和其他干擾因素，最終確定采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)法，在波長(zhǎng)270 nm 處檢測(cè)單寧酸、桑根酮D、桑酮G、桑根酮C，在波長(zhǎng)320 nm 處檢測(cè)桑皮苷A、綠原酸。

圖2 6 個(gè)成分的光譜圖

4 小結(jié)

建立的HPLC 雙波長(zhǎng)法可同時(shí)測(cè)定桑白皮水提物中桑皮苷A 等6 個(gè)成分的含量，分析時(shí)間在40min內(nèi)，方法準(zhǔn)確度、進(jìn)樣精密度、重復(fù)性及耐用性均符合分析方法驗(yàn)證要求，為定量分析桑白皮水提物中的主要成分提供了可靠的依據(jù)。同時(shí)對(duì)桑白皮水提物進(jìn)行了穩(wěn)定性研究，表明桑白皮水提物在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好，在超過(guò)24 h 供試品中6 個(gè)成分均有較大程度降解，為桑白皮水提物在化妝品領(lǐng)域的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供了一定參考。