低溫脅迫對(duì)番茄幼苗不同葉齡葉片葉綠素?zé)晒獬上裉匦缘挠绊?/h1>
2022-02-02 03:32:58胡雪華劉寧寧陶慧敏彭可佳夏曉劍胡文海
中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué) 2022年24期
胡雪華，劉寧寧，陶慧敏，彭可佳，夏曉劍，胡文海
低溫脅迫對(duì)番茄幼苗不同葉齡葉片葉綠素?zé)晒獬上裉匦缘挠绊?/p>
1井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西吉安 333009；2浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系，杭州 310058
研究番茄幼苗第2葉（成熟葉）和第4葉（新生葉）葉綠素?zé)晒獬上裉匦詫?duì)低溫脅迫的響應(yīng)，并分析低溫脅迫下番茄不同葉齡葉片光合活性區(qū)域相對(duì)面積及熒光參數(shù)值的變化，以探明番茄幼苗不同葉齡葉片對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制。以番茄品種‘中蔬4號(hào)’（L. cv Zhongshu No.4）4葉期幼苗為材料，對(duì)番茄幼苗進(jìn)行低溫（8℃、200 μmol·m-2·s-1）處理15 d后常溫（26℃白天/20℃夜晚，500 μmol·m-2·s-1）恢復(fù)1 d，于處理不同時(shí)期對(duì)幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上?，并比較第2葉和第4葉的葉綠素?zé)晒獬上裉匦?。低溫處理期間，第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積（RAP）僅在處理前期（5 d）有所下降，而全株和第2葉的RAP則隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，但常溫1 d即可完全恢復(fù)。低溫處理下PSII調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NPQ)）、PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NO)）和非光化學(xué)猝滅（NPQ）的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積（RAF）與RAP基本一致，但PSII實(shí)際光化學(xué)效率（Y(II)）和光化學(xué)猝滅（qP）的RAF則顯著低于RAP。低溫處理前期（5 d），番茄幼苗光合活性區(qū)域的PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、Y(NPQ)、NPQ急劇下降和Y(NO)急劇上升，隨后，F(xiàn)v/Fm保持不變，但Y(NPQ)和NPQ有所上升，Y(NO)則下降。但是，低溫處理1 d即導(dǎo)致光合活性區(qū)域Y(II)的急劇下降，隨后維持不變。另外，番茄全株和第4葉的光合活性區(qū)域qP僅表現(xiàn)在處理第1天時(shí)小幅下降，隨后則維持高于處理前的水平，而第2葉qP則在第5天有明顯上升后又迅速下降。總體上，第4葉光合活性區(qū)域的Fv/Fm、Y(II)、Y(NPQ)、NPQ和qP明顯高于第2葉，Y(NO)低于第2葉。番茄幼苗可通過(guò)主動(dòng)降低葉片光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而葉片熱耗散能力在低溫處理前期受到抑制，直到處理后期才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用；低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉，成熟葉主要通過(guò)可逆降低光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而新生葉則主要通過(guò)維持相對(duì)較高的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)和熱耗散能力防御低溫光抑制；低溫導(dǎo)致新生葉光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉的同時(shí)，刺激了剩余有活性PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高，這將有利于低溫脅迫解除后光合活性的恢復(fù)。
番茄；低溫脅迫；葉綠素?zé)晒獬上?；光抑制；葉齡
0 引言
【研究意義】番茄（L.）是我國(guó)冬春設(shè)施栽培面積最大的喜溫蔬菜之一[1]，低于10℃通常會(huì)造成番茄植株冷害的發(fā)生[2]。光合作用是低溫脅迫下受到抑制的主要生理代謝過(guò)程[3]。由于同一植株上不同葉片以及同一葉片不同部位的光合特性存在差異[4-5]，因此，對(duì)低溫脅迫后番茄幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上穹治觯⒈容^不同葉齡葉片間葉綠素?zé)晒獬上裉卣鞯牟町?，有助于從整體水平上探究番茄幼苗光合特性對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制，為番茄設(shè)施栽培提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】低溫脅迫抑制了番茄葉片SBPase、FBPase和Rubisco等光合酶活性[6-9]，降低了光系統(tǒng)II（PSII）光化學(xué)效率，阻礙了光合電子傳遞的順利進(jìn)行，從而造成光抑制甚至光合機(jī)構(gòu)的破壞[10-14]。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)作為研究植物光合特性的主要手段，具有快速無(wú)損傷、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)。然而，有關(guān)植物葉片葉綠素?zé)晒馓卣鞯难芯看蠖嗍峭ㄟ^(guò)測(cè)定或分析葉片局部某一點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，以葉片某一特定位置的葉綠素?zé)晒庑畔⒋媪巳~甚至全株的葉綠素?zé)晒馓卣?。由于植物葉片存在光合異質(zhì)性，因此，葉片局部的葉綠素?zé)晒庑畔⒉⒉蛔阋源砣~片整體的熒光特征，無(wú)法正確評(píng)估植物的光合特性[15-16]。葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)可以獲得植物全葉或全株葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，既能提供熒光參數(shù)數(shù)值，又可觀察熒光特性的空間異質(zhì)性，從而成為葉綠素?zé)晒庋芯康闹匾椒ㄖ籟17-18]。雖然葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的應(yīng)用為植物環(huán)境脅迫研究提供了巨大潛力，但是大多數(shù)文獻(xiàn)仍是采用葉片局部區(qū)域的熒光參數(shù)開(kāi)展研究，并不能代表全葉的熒光特性，該技術(shù)在植物逆境脅迫研究中的方法還需進(jìn)一步完善。而少數(shù)利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)作物整體熒光成像的研究主要側(cè)重于作物生理監(jiān)測(cè)，例如王恒[19]對(duì)應(yīng)用于植物生理檢測(cè)的高通量葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的研究，董貞芬[20]對(duì)低溫脅迫下番茄幼苗葉綠素?zé)晒獬上竦姆治黾把芯?，以及Bresson等[21]基于Fv/Fm熒光值分布來(lái)量化植株光合效率空間異質(zhì)性的動(dòng)態(tài)分析，這類方法在分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖的過(guò)程中需要采用圖像處理技術(shù)對(duì)植物區(qū)域的圖像進(jìn)行提取和分析，由于圖像處理技術(shù)的專業(yè)性而限制了大多數(shù)研究者的應(yīng)用。筆者前期預(yù)試驗(yàn)表明，8℃低溫處理導(dǎo)致番茄葉片熒光成像面積顯著縮小，但常溫下1 d即可恢復(fù)，這意味著番茄在低溫脅迫下會(huì)主動(dòng)抑制葉片部分區(qū)域的光合活性以減輕低溫傷害，并且還呈現(xiàn)不同葉片的熒光成像面積和同一葉片不同熒光參數(shù)的熒光成像面積縮小程度不一致等特征。王春萍等[5]研究也表明4℃低溫脅迫下水稻幼苗葉片的傷害程度隨著葉齡的增加而增大。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)低溫脅迫下的番茄幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上?，并分析不同葉片葉綠素?zé)晒獬上竦牟町愋?，避免以局部葉綠素?zé)晒馓卣鞔碇仓暾w對(duì)低溫脅迫響應(yīng)的局限；進(jìn)一步分析植株具有光合活性的區(qū)域的熒光參數(shù)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，以利于判斷植物保持有光合活性的部位如何防御低溫傷害。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)8℃低溫處理15 d后常溫恢復(fù)1 d的番茄幼苗，在處理的各個(gè)時(shí)期采用ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)對(duì)幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上瘢⒎治鋈?、?葉和第4葉葉綠素?zé)晒獬上裉卣鞯淖兓安町?，探明番茄幼苗不同葉齡葉片光合機(jī)構(gòu)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，從植株整體水平上探究番茄幼苗光合特性對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制，并完善葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在植物逆境脅迫研究中的應(yīng)用。
1 材料與方法
試驗(yàn)于2020年在井岡山大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。
1.1 試驗(yàn)材料與處理
供試番茄品種為‘中蔬4號(hào)’（L. cv Zhongshu No.4）。種子播種于裝有草炭土的塑料盆（長(zhǎng)20 cm、寬14 cm、高5 cm），幼苗2葉期移入裝有草炭土的圓形塑料盆（直徑10 cm、高15 cm），澆灌園試營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水肥管理，置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。人工氣候室設(shè)置晝夜溫度26℃/20℃（白天/夜晚），空氣相對(duì)濕度75%，采用LED植物生長(zhǎng)燈提供約500 μmol·m-2·s-1光照，晝夜光周期設(shè)置為10/14 h，8:00和18:00分別為晝夜起始時(shí)間。幼苗4葉期時(shí)，選取植株高度和冠幅較為一致且其全株葉綠素?zé)晒獬上裼贗magingPAM成像窗口中的5盆植株為試驗(yàn)材料。
于處理前（T0d）將5盆番茄試驗(yàn)植株分別編號(hào)1、2、3、4、5，并按編號(hào)順序于8:30開(kāi)始逐一開(kāi)展全株葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定，每一盆植株在測(cè)定結(jié)束后立即移入人工氣候箱中進(jìn)行8℃低溫處理，人工氣候箱空氣相對(duì)濕度75%，光照強(qiáng)度約200 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間8:00—18:00。于低溫處理第1、5、10、15天（分別記為T(mén)1d、T5d、T10d、T15d）于8:30開(kāi)始，按編號(hào)順序逐一進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。低溫處理15 d的植株結(jié)束熒光成像測(cè)定后立即移入人工氣候室，恢復(fù)1 d（R1d）后按編號(hào)順序?qū)Ω髦仓赀M(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。
1.2 葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定
采用調(diào)制式IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒鈨x（Walz，德國(guó)）對(duì)番茄幼苗進(jìn)行全株葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。按照操作手冊(cè)，移除IMAGING-MAX/GS底部載物平臺(tái)并安裝4個(gè)金屬支架，將盆栽植株移入熒光儀中并使植株頂部位于18.5 cm的標(biāo)準(zhǔn)工作距離處（即LED陳列前端和植株頂部之間的距離，原安裝底部載物平臺(tái)處），以黑色絨布遮住植株根部培養(yǎng)基質(zhì)和花盆，并用黑布包裹熒光儀進(jìn)行遮光暗處理30 min。設(shè)置光化光（actinic light）強(qiáng)度為281 μmol·m-2·s-1，選擇Kinetics模式，進(jìn)行葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線（持續(xù)260 s）的測(cè)定，并導(dǎo)出熒光成像源文件。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像分析
1.3.1 全株、第2葉和第4葉AOI區(qū)域的選擇 ImaingWin v2.47軟件提供了Circle（圓形）、Rectangle（矩形）和Polygon（多邊形）3種AOI（area of interest）區(qū)域選擇方式。其中Polygon方式可通過(guò)連續(xù)設(shè)置多邊形點(diǎn)連接成任意形狀，為以全葉作為AOI區(qū)域開(kāi)展研究提供了方便。利用ImaingWin v2.47軟件打開(kāi)熒光成像源文件，在Image窗口下選擇NIR圖像類型，采用Polygon方式沿著植株外圍將全株納入AOI范圍，獲得全株AOI區(qū)域；采用Polygon方式，分別沿第2葉和第4葉邊緣連續(xù)設(shè)置多邊形點(diǎn)使之與葉片邊緣盡量重合，獲得第2葉和第4葉全葉AOI區(qū)域（圖1-A）。
1.3.2 全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域熒光參數(shù)平均值的讀取 利用ImaingWin v2.47軟件Report功能可導(dǎo)出各AOI范圍內(nèi)像素值（size）、PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSII實(shí)際光化學(xué)效率（Y(II)）、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NPQ)）、PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NO)）、非光化學(xué)猝滅（NPQ/4）和光化學(xué)猝滅（qP）等參數(shù)值。根據(jù)IMAGING-PAM操作手冊(cè)，當(dāng)光合活性區(qū)域（photosynthetically active regions，即Fv/Fm>0區(qū)域）為斑塊時(shí)，應(yīng)禁用軟件Options中“Mean over AOI”功能，此時(shí)僅對(duì)AOI范圍內(nèi)光合活性區(qū)域的熒光值進(jìn)行平均，所顯示的熒光圖像和熒光參數(shù)平均值僅對(duì)應(yīng)AOI的光合活性區(qū)域。以低溫處理5 d的植株1全株葉綠素?zé)晒獬上駡D為例，在NIR圖像類型下采用Polygon方式對(duì)第2葉和第4葉進(jìn)行全葉AOI選擇（圖1-A），在Fv/Fm圖像類型下（圖1-B）明顯可觀察到兩葉沿著葉片邊緣均有一定面積Fv/Fm=0的非光合活性區(qū)域（即AOI中呈現(xiàn)黑色的部位），其中第2葉光合活性區(qū)域面積占全葉總面積的比例明顯低于第4葉。
圖1 低溫處理5 d時(shí)番茄幼苗第2葉和第4葉AOI選擇（A）及其光合活性區(qū)域（B）（以植株1為例）
選擇好全株、第2葉和第4葉的AOI后，通過(guò)軟件的Report功能導(dǎo)出全株、第2葉和第4葉AOI區(qū)域的Size、Fv/Fm、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、NPQ/4和qP等熒光參數(shù)值。經(jīng)過(guò)260 s光化光誘導(dǎo)，植株熒光曲線已平滑，因此，選擇誘導(dǎo)曲線最后一次測(cè)得的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有熒光參數(shù)值均為AOI范圍內(nèi)光合活性區(qū)域的平均值。
1.3.3 植株全株的光合活性區(qū)域相對(duì)面積和各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積的計(jì)算 通過(guò)ImaingWin v2.47軟件，在Image窗口對(duì)最后一次熒光成像選擇Analysis功能，通過(guò)設(shè)置各熒光參數(shù)Low值為0.004，High值為1（其中，Y(NO)參數(shù)Low值設(shè)定為0，High值設(shè)定為0.996），讀取Red Pixel Assessment中的Number值，該值即為各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域面積（size of fluorescence active regions，SAF）。由于ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)定義Fv/Fm>0的部位為光合活性區(qū)域，因此，F(xiàn)v/Fm的熒光活性區(qū)域面積即為光合活性區(qū)域面積（size of photosynthetically active regions，SAP）。基于處理前（T0d）植株全株各部位的Fv/Fm均大于0且較為均勻，此時(shí)植株的光合活性區(qū)域面積與植株總面積一致，因此，采用此時(shí)各植株的光合活性區(qū)域面積作為該植株總面積（SAP(T0d)）。
處理各時(shí)期植株熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積（relative area of fluorescence active regions, RAF）采用該時(shí)期植株各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域面積（SAF(Treatment)，其中Treatment代表T0d、T1d、T5d、T10d、T15d、R1d）與SAP(T0d)比較而得，RAF(%) = SAF(Treatment)/SAP(T0d)×100。全株的光合活性區(qū)域相對(duì)面積（relative area of photosynthetically active regions，RAP）則為Fv/Fm的RAF。雖然番茄幼苗在低溫脅迫下葉片會(huì)發(fā)生輕微的卷曲和下垂，從而導(dǎo)致植株面積下降，使采用該方法估算植株光合活性區(qū)域相對(duì)面積和熒光參數(shù)活性區(qū)域相對(duì)面積會(huì)稍低于實(shí)際值，但不會(huì)改變低溫對(duì)其影響的整體趨勢(shì)，因此，本研究仍采用這種計(jì)算方式。
1.3.4 第2葉和第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積的計(jì)算 由ImaingWin v2.47軟件Report功能導(dǎo)出的Size值為AOI像素值，即AOI面積。配合Options菜單中啟用和禁用“Mean over AOI”功能，可獲得AOI總面積和AOI光合活性區(qū)域面積。啟用“Mean over AOI”，Size值為AOI總像素值，即AOI總面積（ST）；禁用“Mean over AOI”，Size值則是AOI中具有光合活性區(qū)域的像素值，即AOI的光合活性區(qū)域面積（SP）。第2葉和第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積RAP(%) = SP/ ST×100。
2 結(jié)果
2.1 低溫脅迫對(duì)光合活性區(qū)域相對(duì)面積和Fv/Fm的影響
隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm熒光成像呈現(xiàn)出由葉緣逐漸向主脈收縮變小的趨勢(shì)，以及葉片葉齡越大其熒光成像面積縮小越明顯的特征；低溫處理也導(dǎo)致Fv/Fm值的下降，表現(xiàn)為代表Fv/Fm值大小的顏色由深藍(lán)色向綠色和黃色轉(zhuǎn)變，且葉齡越大熒光值越小，同一葉片靠近莖和葉脈中心部分的熒光值越大。低溫處理后僅恢復(fù)1 d，F(xiàn)v/Fm熒光成像面積得以迅速恢復(fù)，并且新葉靠近莖中心的大部位區(qū)域也基本恢復(fù)至深藍(lán)色，但老葉則仍有較大面積呈現(xiàn)黃綠色（圖2）。這表明新葉對(duì)低溫脅迫的抵抗能力和恢復(fù)能力均高于老葉。由于ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)定義Fv/Fm>0部位為光合活性區(qū)域，因此，圖2也代表了光合活性區(qū)域的變化情況。
低溫處理對(duì)番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積的影響如圖3-A所示。第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積在低溫處理1 d時(shí)并未下降，處理5 d下降6.9%后就不再下降。但番茄全株和第2葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，低溫處理1 d即分別下降21.6%和14.2%，處理15 d時(shí)則分別下降了55.4%和40.8%。常溫下恢復(fù)1 d，番茄全株、第2葉和第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積均可完全恢復(fù)至處理前水平，說(shuō)明8℃低溫脅迫15 d并未引起番茄幼苗葉片壞死。
低溫處理對(duì)番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域Fv/Fm的影響如圖3-B所示。幼苗全株、第2葉和第4葉的Fv/Fm在處理前均約0.710，低溫處理1 d即引起Fv/Fm的迅速下降，處理5 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，分別為0.256、0.229和0.320；但隨后的低溫處理并未引起全株和第2葉Fv/Fm的下降，第4葉反而有所上升?；謴?fù)1 d，第4葉Fv/Fm可完全恢復(fù)至處理前水平，而全株和第2葉則恢復(fù)至0.620和0.580，仍低于處理前水平。
圖2 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗Fv/Fm的熒光成像（以植株1為例）
圖3 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域相對(duì)面積（RAP）和Fv/Fm的影響
2.2 低溫脅迫對(duì)Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的影響
由圖4和圖5-A可知，低溫處理可導(dǎo)致Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)熒光成像面積的下降，但對(duì)Y(II)的影響更為明顯。番茄幼苗Y(II)熒光成像面積隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇下降，至處理15 d時(shí)難以觀察到植株基本形態(tài)。低溫脅迫下Y(NPQ)和Y(NO)的成像面積雖然略有下降，但仍保持了植株基本形態(tài)。低溫處理期間Y(NPQ)和Y(NO)的熒光活性區(qū)域表現(xiàn)出與光合活性區(qū)域面積同步下降，在處理15 d時(shí)還稍高于光合活性區(qū)域面積，而Y(II)熒光活性區(qū)域面積則明顯低于光合活性區(qū)域面積。然而，恢復(fù)1 d時(shí)，Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)熒光成像面積均可恢復(fù)至處理前水平，且與植株光合活性區(qū)域面積相一致。
低溫處理1 d即導(dǎo)致番茄幼苗光合活性區(qū)域Y(II)熒光值大幅下降，隨后則呈現(xiàn)小幅升高、降低、再升高的變化（圖5-B）。雖然番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域的Y(II)熒光值在低溫處理前高于第4葉，但低溫處理期間第4葉的Y(II)熒光值高于全株和第2葉。恢復(fù)1 d，全株和第2葉的Y(II)熒光值可恢復(fù)至處理前水平，而第4葉則明顯高于處理前水平。由圖4-A可知，靠近莖尖生長(zhǎng)中心的新葉表現(xiàn)綠色，老葉葉緣處仍表現(xiàn)為明顯的黃色，表明長(zhǎng)期低溫脅迫后番茄幼苗優(yōu)先恢復(fù)生長(zhǎng)中心葉片的Y(II)。
處理前番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域的Y(NPQ)明顯低于第4葉，低溫處理期間Y(NPQ)呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)（圖5-C）。其中，第4葉的Y(NPQ)在低溫處理5 d時(shí)下降至最低點(diǎn)后開(kāi)始上升；而全株和第2葉的Y(NPQ)分別在處理5 d和10 d時(shí)降到最低點(diǎn)，然后均從低溫處理10 d后開(kāi)始上升?；謴?fù)1 d后，第2葉的Y(NPQ)仍有小幅上升，而第4葉和全株的Y(NPQ)則與低溫處理15 d時(shí)沒(méi)有明顯變化，但均未恢復(fù)至處理前水平。
處理前番茄幼苗全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域Y(NO)未見(jiàn)差異，低溫處理則導(dǎo)致了Y(NO)的上升，且全株和第2葉的上升幅度大于第4葉（圖5-D）。全株和第2葉的Y(NO)在處理10 d時(shí)達(dá)到最大值，而第4葉則在低溫處理5 d時(shí)達(dá)到最大值，然后均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降?；謴?fù)1 d后，全株、第2葉和第4葉的Y(NO)均顯著下降，其中第4葉可恢復(fù)至處理前水平，但全株和第2葉的Y(NO)仍稍高于處理前水平。結(jié)合圖4-C番茄幼苗外圍部分Y(NO)熒光成像呈現(xiàn)藍(lán)色，而靠近莖尖生長(zhǎng)中心的葉片部分則呈黃綠色，說(shuō)明位于番茄內(nèi)側(cè)的莖尖和新葉的Y(NO)更易于恢復(fù)。
圖4 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的熒光成像（以植株1為例）
圖5 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的影響
2.3 低溫脅迫對(duì)NPQ和qP的影響
由圖6和圖7-A可知，低溫脅迫下番茄幼苗NPQ熒光成像面積雖然略有下降，但仍呈現(xiàn)出植株基本形態(tài)，且其熒光活性區(qū)域相對(duì)面積除了在低溫處理15 d時(shí)稍高于光合活性區(qū)域相對(duì)面積外，其他時(shí)間均與光合活性區(qū)域相對(duì)面積沒(méi)有明顯差異。而qP的熒光成像面積在低溫處理1 d時(shí)即大幅下降，且在低溫處理后期難以觀察到植株基本形態(tài)。但恢復(fù)1 d時(shí)，NPQ和qP的熒光成像面積均可恢復(fù)至處理前水平。
圖6 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗NPQ和qP的熒光成像（以植株1為例）
圖7 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域NPQ和qP的影響
處理前番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域NPQ明顯低于第4葉，低溫處理期間NPQ呈先下降后上升的變化。幼苗全株、第2葉和第4葉的Y(NPQ)均在低溫處理5 d時(shí)下降至最低點(diǎn)，隨后，第4葉在低溫處理5 d后即開(kāi)始恢復(fù)，全株和第2葉從10 d后開(kāi)始恢復(fù)?；謴?fù)1 d，全株、第2葉和第4葉的NPQ仍顯著上升，但均未恢復(fù)至處理前水平（圖7-B）。
低溫處理前番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域的qP沒(méi)有明顯差異，低溫處理1 d導(dǎo)致qP小幅下降，處理5 d時(shí)均明顯上升至高于處理前水平；隨后，低溫處理10 d時(shí)qP又有所下降，其中第4葉和全株仍保持在不低于處理前水平，而第2葉則下降至處理前的51.3%；低溫處理15 d時(shí)，全株和第4葉的qP又顯著上升至高于處理前水平，而第2葉則變化不大?；謴?fù)1 d時(shí)，第2葉qP迅速恢復(fù)至處理前水平，第4葉也略有上升并高于處理前，而全株qP則下降至處理前水平（圖7-C）。
3 討論
3.1 低溫脅迫影響番茄幼苗不同葉齡葉片光合活性區(qū)域面積及分布
葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在作物低溫脅迫研究中的應(yīng)用表明冷害并不是均勻發(fā)生在葉片各部分[18,22-23]，本研究結(jié)果也表明低溫處理引起了番茄幼苗所有葉片各熒光參數(shù)的異質(zhì)性增大并且對(duì)葉齡大的葉片影響更大。進(jìn)一步比較各時(shí)期不同葉齡葉片的熒光參數(shù)熒光成像和熒光活性相對(duì)面積，雖然低溫導(dǎo)致了幼苗全株和所有葉片的熒光活性區(qū)域縮小，但對(duì)第2葉的抑制作用更明顯，而靠近生長(zhǎng)中心的第4葉則顯著優(yōu)于第2葉和全株水平。而且第2葉也表現(xiàn)出光合活性區(qū)域主要分布于近莖端和葉脈處，幼苗植株的光合活性區(qū)域整體呈現(xiàn)以莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)為中心向外擴(kuò)散的分布趨勢(shì)。這些結(jié)果均表明低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉。王春萍等[5]的研究也表明低溫脅迫下水稻幼苗葉片的葉齡越大越容易受到傷害，葉齡越小則對(duì)低溫的抵抗能力越強(qiáng)。
與此同時(shí)，本研究觀察到低溫脅迫導(dǎo)致葉片光合活性區(qū)域的縮小在常溫恢復(fù)1 d時(shí)即可完全恢復(fù)至處理前水平，這意味著低溫導(dǎo)致的光合活性區(qū)域面積減少是保護(hù)性的可逆反應(yīng)。植物綠色葉片低溫光抑制是由于葉片吸收的光能超過(guò)碳同化所需，光能吸收與利用的失衡導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)中過(guò)剩激發(fā)能的積累，最終促進(jìn)了活性氧的產(chǎn)生和傷害的發(fā)生[24-26]。據(jù)此，推測(cè)低溫脅迫下（8℃、200 μmol·m-2·s-1）番茄可以主動(dòng)關(guān)閉葉片部分區(qū)域的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)活性，通過(guò)減少對(duì)光能的吸收來(lái)主動(dòng)防御低溫傷害，是番茄在低溫脅迫下的一種自適應(yīng)反應(yīng)。筆者課題組前期研究也表明，番茄葉片單位面積有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)目（RC/CS）在8℃低溫處理的第1天即顯著下降，并在低溫處理4 d后恢復(fù)的第1天即大幅上升，也從另一側(cè)面說(shuō)明低溫脅迫誘導(dǎo)了番茄葉片PSII反應(yīng)中心的可逆失活[14]。這一現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，因此，需要在更多的植物種類和不同光溫脅迫條件下進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證植物是否具有主動(dòng)關(guān)閉葉片部分區(qū)域PSII的光化學(xué)反應(yīng)活性以適應(yīng)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制。
3.2 低溫脅迫影響番茄幼苗不同葉齡葉片光合活性區(qū)域葉綠素?zé)晒鈪?shù)
葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映了植物葉片PSII的功能和吸收光能分配情況。低溫脅迫通常會(huì)抑制番茄幼苗葉片PSII光化學(xué)效率，從而減少葉片吸收光能分配給PSII光化學(xué)反應(yīng)的比例，導(dǎo)致吸收光能中PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散部分的增加和PSII光抑制的發(fā)生，表現(xiàn)為Fv/Fm、qP和Y(II)（或ΦPSII）的下降和Y(NO)的上升[27-29]。而低溫對(duì)番茄葉片熱耗散能力的影響則因低溫處理?xiàng)l件不同而異，4℃暗處理10 h誘導(dǎo)了番茄品種Micro-Tom葉片NPQ增強(qiáng)[30]，夜間5℃處理3 d也誘導(dǎo)了番茄品種‘L-404’葉片Y(NPQ)的增強(qiáng)[18]，而低溫弱光（15℃白天/7℃夜晚，180 μmol·m-2·s-1）處理15 d導(dǎo)致番茄品種‘合作903’葉片NPQ下降[28]。本研究發(fā)現(xiàn)8℃低溫處理前期（5 d）對(duì)番茄品種‘中蔬4號(hào)’葉片光合活性區(qū)域光抑制的影響較明顯，而處理后期（5—15 d）并未引起光抑制程度的加劇。低溫處理后期第2葉光合活性區(qū)域面積持續(xù)下降，這表明低溫處理后期番茄幼苗成熟葉可通過(guò)主動(dòng)縮小葉片光合活性區(qū)域來(lái)適應(yīng)低溫脅迫。然而，第4葉的光合活性區(qū)域面積在低溫處理后期并未下降，而其Fv/Fm反而有所上升，這意味著新生葉具有與成熟葉不同的低溫光抑制防御機(jī)制。
PSII天線色素吸收光能可分為PSII光化學(xué)反應(yīng)利用的能量Y(II)、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散Y(NPQ)和非調(diào)節(jié)性的能量耗散Y(NO)三部分[31]。高Y(NO)值意味著PSII反應(yīng)中心過(guò)量激發(fā)能的積累，并將成為光抑制發(fā)生的誘因[31-32]。本研究中所有葉片的Y(NO)在低溫處理的前5 d迅速上升，第10 天時(shí)第2葉并沒(méi)有明顯變化而第4葉開(kāi)始下降，第15 d時(shí)則全部呈明顯下調(diào)。該結(jié)果證明了低溫處理前期番茄葉片PSII反應(yīng)中心激發(fā)能的積累引起了光抑制的發(fā)生，而低溫處理后期PSII反應(yīng)中心激發(fā)能的積累不但沒(méi)有進(jìn)一步加劇反而有所緩解，從而使光合活性區(qū)域的光抑制程度并未加劇，新生葉光抑制程度反而有所緩解。低溫處理前期Y(NO)迅速上升的原因是由于Y(II)和Y(NPQ)同時(shí)大幅下降所致，而后期Y(NO)有所緩解的原因則主要是由于Y(NPQ)恢復(fù)上升所致。低溫處理1 d即導(dǎo)致Y(II)大幅下降53.7%，并在隨后的低溫處理中一直保持低水平。Y(II)的下降表明低溫降低了PSII反應(yīng)中心將光能轉(zhuǎn)化為電能進(jìn)行電子傳遞的能力[33]，這與筆者課題組利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果相一致，低溫處理降低了番茄葉片單位面積對(duì)光能的吸收（ABS/CS）、捕獲（TRo/CS）和進(jìn)行電子傳遞（ETo/CS）的能力[14]。Y(NPQ)則在處理的前5 d內(nèi)持續(xù)下降至處理前的48.0%，隨后第4葉隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯恢復(fù)上升，而第2葉和全株則在第10天后明顯恢復(fù)上升，處理期間NPQ也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。這些結(jié)果意味著低溫處理前期不但沒(méi)有誘導(dǎo)反而抑制了番茄光合機(jī)構(gòu)熱耗散的進(jìn)行，低溫處理后期熱耗散才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用。
然而，本研究還發(fā)現(xiàn)，番茄全株和第4葉光合活性區(qū)域qP僅表現(xiàn)為在處理第1 天時(shí)分別小幅下降20.1%和17.1%，隨后維持在不低于或高于處理前水平。qP反映了PSII反應(yīng)中心的開(kāi)放程度[33]，取決于QA的氧化還原程度，決定了PSII的激發(fā)能捕獲速率[34]。這意味著在長(zhǎng)達(dá)15 d的低溫處理期間，番茄新生葉光合活性區(qū)域的PSII反應(yīng)中心只在第1天有較小程度的關(guān)閉，隨后一直維持著較高開(kāi)放程度，對(duì)激發(fā)能的捕獲能力增強(qiáng)。多數(shù)文獻(xiàn)中低溫導(dǎo)致植物qP下降，這主要與熒光參數(shù)測(cè)量采用光纖式熒光儀有關(guān)，在這種情況下測(cè)得的qP是測(cè)量區(qū)域內(nèi)（包括光合活性區(qū)域和非光合活性區(qū)域）的qP平均值。事實(shí)上，如果以番茄全株或第4葉全葉面積（包括光合活性區(qū)域和非活性區(qū)域）所讀取的qP平均值也隨著低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降（數(shù)據(jù)未列出）。結(jié)合番茄全株和各葉片光合活性區(qū)域面積隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，而Y(II)和qP熒光活性相對(duì)面積顯著低于光合活性區(qū)域相對(duì)面積這一結(jié)果，是否意味著低溫脅迫除了誘導(dǎo)番茄葉片部分區(qū)域PSII反應(yīng)中心的可逆失活，還導(dǎo)致光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉，但刺激了新生葉剩余有活性的PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高。有研究表明，低溫脅迫在降低作物葉片單位面積有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)目（RC/CS）時(shí)會(huì)迫使作物剩余有活性的反應(yīng)中心效率的提高[14,35]。而番茄新生葉對(duì)低溫的這種響應(yīng)是否有利于脅迫解除后葉片光合能力的恢復(fù)？本研究觀察到低溫處理后恢復(fù)1 d，第4葉的qP即可恢復(fù)至處理前的119.8%，熒光成像圖也顯示此時(shí)番茄幼苗絕大部分葉片區(qū)域呈現(xiàn)比處理前qP數(shù)值更高的藍(lán)紫色，似乎佐證了這種設(shè)想。但是，與處理前相比，第2葉在低溫處理后期（10、15 d）相比處理前約下降了50%，這意味著長(zhǎng)期低溫脅迫對(duì)番茄成熟葉有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)量和開(kāi)放程度均有明顯的抑制作用。王春萍等[5]的研究也表明，與對(duì)照相比，低溫脅迫下水稻葉齡最小的第3葉qP有明顯上升，而葉齡最大的第1葉qP則顯著下降。雖然有關(guān)植物低溫馴化提高抗寒性有較多研究，例如辣椒在14℃亞適溫馴化5 d可促進(jìn)依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散能力的增強(qiáng)[36]，番茄在12℃/10℃低溫馴化3 d后可通過(guò)激發(fā)H2O2以誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)與活性的上調(diào)[37]，并對(duì)光合機(jī)構(gòu)起保護(hù)作用。而本研究中8℃低溫處理后期新生葉光合活性區(qū)域維持較高的PSII開(kāi)放程度這一自適應(yīng)現(xiàn)象在以往研究中鮮見(jiàn)討論，值得深入研究。
4 結(jié)論
8℃低溫處理下，番茄幼苗可通過(guò)主動(dòng)降低葉片光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，處理前期對(duì)光合活性區(qū)域光抑制影響顯著，而處理后期光抑制程度沒(méi)有加??；葉片熱耗散能力在低溫處理前期受到抑制，直到處理后期才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用；低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉，成熟葉主要通過(guò)可逆降低光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而新生葉則主要通過(guò)維持相對(duì)較高的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)和熱耗散能力防御低溫光抑制；低溫導(dǎo)致新生葉光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉的同時(shí)，刺激了剩余有活性PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高，有利于低溫脅迫解除后恢復(fù)期光合活性的恢復(fù)。
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[37] ZHOU J, WANG J, SHI K, XIA X J, ZHOU Y H, YU J Q. Hydrogen peroxide is involved in the cold acclimation-induced chilling tolerance of tomato plants. Plant Physiology and Biochemistry, 2012, 60: 141-149.
Effects of Chilling on Chlorophyll Fluorescence Imaging Characteristics of Leaves with Different Leaf Ages in Tomato Seedlings
1School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an 343009, Jiangxi;2College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058
This study analyzed the characteristics of chlorophyll fluorescence imaging of the 2nd (mature) and 4th (newly born) leaves of tomato seedlings in response to chilling stress, aiming to probe the mechanism of leaves with different ages adapted to chilling stress in tomato seedlings.In this study,L. cv Zhongshu No. 4 was used as the research material. The tomato seedlings in the 4-leaf stage were treated at chilling (8℃, 200 μmol·m-2·s-1) for 15 d and then recovered at normal temperature (26℃ day/20℃ night, 500 μmol·m-2·s-1) for 1 d. The Chlorophyll fluorescence imagings of the whole seedlings were measured at different stages under different treatments, and the characteristics of chlorophyll fluorescence imaging of the 2nd and 4th leaves were compared.The results showed that the relative area of photosynthetically active regions (RAP) on the 4th leaves decreased slowly during the first 5 d of the chilling stress, while the RAPon the 2nd leaves and the whole plants decreased steadily during the whole chilling treatment. The RAPrecovered completely after 1 d of recovery. Under chilling treatment, the relative area of fluorescence active regions (RAF) for quantum yield of regulatory energy dissipation (Y(NPQ)), quantum yield of nonregulatory energy dissipation (Y(NO)), and nonphotochemical quenching (NPQ) showed similar changes as that of RAP. However, the RAFof effective PSII quantum yield (Y(II)) and coefficient of photochemical quenching (qP) were significantly lower than that of RAP. The maximum PSII quantum yield (Fv/Fm), Y(NPQ), and NPQ decreased while Y(NO) increased sharply in the photosynthetically active region in tomato seedlings during the first 5 d of the chilling treatment. In the following days, the Fv/Fm remained unchanged, whereas Y(NPQ) and NPQ increased and Y(NO) decreased. However, Y(II) declined sharply 1 d after chilling stress and then remained unchanged. Interestingly, qP in the photosynthetic active region of the 4th leaves decreased only slightly after 1 d of chilling treatment, and then maintained higher than that before treatment. However, qP of the 2nd leaves increased significantly on the 5th day and then decreased rapidly. Overall, the Fv/Fm, Y(II), Y(NPQ) and qP in the 4th leaves were higher than those in the 2nd leaves, whereas the Y(NO) were relatively lower in the 4th leaves.The study found that tomato seedlings responded to chilling stress by decreasing the area of photosynthetically active regions. The regulatory nonphotochemical quenching, which played a central role in photoprotection, was inhibited in the early stage, but gradually increased during the later stage under chilling treatment. The mature leaves adapted to chilling stress likely by decreasing the size of photosynthetically active regions, while higher capacities of PSII photochemistry and thermal dissipation were maintained in the newly born leaves in response to chilling stress. The protection of shoot apex and newly born leaves might be the priority of tomato seedlings in response to chilling stress. For newly born leaves, the chilling induced the closure of some active PSII reaction centers, but improved the operating efficiency of the remaining active PSII reaction centers, which was potentially beneficial for the recovery of photosynthetic activity.
tomato (L.); chilling stress; chlorophyll fluorescence imaging; photoinhibition; leaf age
2022-04-13；
2022-06-16
江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2019ACB20017）
胡雪華，E-mail：huxuehua1210@126.com。通信作者胡文海，E-mail：huwenhai@jgsu.edu.cn
（責(zé)任編輯 趙伶俐）
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胡雪華，劉寧寧，陶慧敏，彭可佳，夏曉劍，胡文海
低溫脅迫對(duì)番茄幼苗不同葉齡葉片葉綠素?zé)晒獬上裉匦缘挠绊?/p>
1井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西吉安 333009；2浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝系，杭州 310058
研究番茄幼苗第2葉（成熟葉）和第4葉（新生葉）葉綠素?zé)晒獬上裉匦詫?duì)低溫脅迫的響應(yīng)，并分析低溫脅迫下番茄不同葉齡葉片光合活性區(qū)域相對(duì)面積及熒光參數(shù)值的變化，以探明番茄幼苗不同葉齡葉片對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制。以番茄品種‘中蔬4號(hào)’（L. cv Zhongshu No.4）4葉期幼苗為材料，對(duì)番茄幼苗進(jìn)行低溫（8℃、200 μmol·m-2·s-1）處理15 d后常溫（26℃白天/20℃夜晚，500 μmol·m-2·s-1）恢復(fù)1 d，于處理不同時(shí)期對(duì)幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上?，并比較第2葉和第4葉的葉綠素?zé)晒獬上裉匦?。低溫處理期間，第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積（RAP）僅在處理前期（5 d）有所下降，而全株和第2葉的RAP則隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)持續(xù)下降，但常溫1 d即可完全恢復(fù)。低溫處理下PSII調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NPQ)）、PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NO)）和非光化學(xué)猝滅（NPQ）的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積（RAF）與RAP基本一致，但PSII實(shí)際光化學(xué)效率（Y(II)）和光化學(xué)猝滅（qP）的RAF則顯著低于RAP。低溫處理前期（5 d），番茄幼苗光合活性區(qū)域的PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、Y(NPQ)、NPQ急劇下降和Y(NO)急劇上升，隨后，F(xiàn)v/Fm保持不變，但Y(NPQ)和NPQ有所上升，Y(NO)則下降。但是，低溫處理1 d即導(dǎo)致光合活性區(qū)域Y(II)的急劇下降，隨后維持不變。另外，番茄全株和第4葉的光合活性區(qū)域qP僅表現(xiàn)在處理第1天時(shí)小幅下降，隨后則維持高于處理前的水平，而第2葉qP則在第5天有明顯上升后又迅速下降。總體上，第4葉光合活性區(qū)域的Fv/Fm、Y(II)、Y(NPQ)、NPQ和qP明顯高于第2葉，Y(NO)低于第2葉。番茄幼苗可通過(guò)主動(dòng)降低葉片光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而葉片熱耗散能力在低溫處理前期受到抑制，直到處理后期才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用；低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉，成熟葉主要通過(guò)可逆降低光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而新生葉則主要通過(guò)維持相對(duì)較高的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)和熱耗散能力防御低溫光抑制；低溫導(dǎo)致新生葉光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉的同時(shí)，刺激了剩余有活性PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高，這將有利于低溫脅迫解除后光合活性的恢復(fù)。
番茄；低溫脅迫；葉綠素?zé)晒獬上?；光抑制；葉齡
0 引言
【研究意義】番茄（L.）是我國(guó)冬春設(shè)施栽培面積最大的喜溫蔬菜之一[1]，低于10℃通常會(huì)造成番茄植株冷害的發(fā)生[2]。光合作用是低溫脅迫下受到抑制的主要生理代謝過(guò)程[3]。由于同一植株上不同葉片以及同一葉片不同部位的光合特性存在差異[4-5]，因此，對(duì)低溫脅迫后番茄幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上穹治觯⒈容^不同葉齡葉片間葉綠素?zé)晒獬上裉卣鞯牟町?，有助于從整體水平上探究番茄幼苗光合特性對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制，為番茄設(shè)施栽培提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】低溫脅迫抑制了番茄葉片SBPase、FBPase和Rubisco等光合酶活性[6-9]，降低了光系統(tǒng)II（PSII）光化學(xué)效率，阻礙了光合電子傳遞的順利進(jìn)行，從而造成光抑制甚至光合機(jī)構(gòu)的破壞[10-14]。葉綠素?zé)晒夥治黾夹g(shù)作為研究植物光合特性的主要手段，具有快速無(wú)損傷、高靈敏度等優(yōu)勢(shì)。然而，有關(guān)植物葉片葉綠素?zé)晒馓卣鞯难芯看蠖嗍峭ㄟ^(guò)測(cè)定或分析葉片局部某一點(diǎn)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)，以葉片某一特定位置的葉綠素?zé)晒庑畔⒋媪巳~甚至全株的葉綠素?zé)晒馓卣?。由于植物葉片存在光合異質(zhì)性，因此，葉片局部的葉綠素?zé)晒庑畔⒉⒉蛔阋源砣~片整體的熒光特征，無(wú)法正確評(píng)估植物的光合特性[15-16]。葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)可以獲得植物全葉或全株葉綠素?zé)晒庑盘?hào)，既能提供熒光參數(shù)數(shù)值，又可觀察熒光特性的空間異質(zhì)性，從而成為葉綠素?zé)晒庋芯康闹匾椒ㄖ籟17-18]。雖然葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)的應(yīng)用為植物環(huán)境脅迫研究提供了巨大潛力，但是大多數(shù)文獻(xiàn)仍是采用葉片局部區(qū)域的熒光參數(shù)開(kāi)展研究，并不能代表全葉的熒光特性，該技術(shù)在植物逆境脅迫研究中的方法還需進(jìn)一步完善。而少數(shù)利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)作物整體熒光成像的研究主要側(cè)重于作物生理監(jiān)測(cè)，例如王恒[19]對(duì)應(yīng)用于植物生理檢測(cè)的高通量葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的研究，董貞芬[20]對(duì)低溫脅迫下番茄幼苗葉綠素?zé)晒獬上竦姆治黾把芯?，以及Bresson等[21]基于Fv/Fm熒光值分布來(lái)量化植株光合效率空間異質(zhì)性的動(dòng)態(tài)分析，這類方法在分析葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖的過(guò)程中需要采用圖像處理技術(shù)對(duì)植物區(qū)域的圖像進(jìn)行提取和分析，由于圖像處理技術(shù)的專業(yè)性而限制了大多數(shù)研究者的應(yīng)用。筆者前期預(yù)試驗(yàn)表明，8℃低溫處理導(dǎo)致番茄葉片熒光成像面積顯著縮小，但常溫下1 d即可恢復(fù)，這意味著番茄在低溫脅迫下會(huì)主動(dòng)抑制葉片部分區(qū)域的光合活性以減輕低溫傷害，并且還呈現(xiàn)不同葉片的熒光成像面積和同一葉片不同熒光參數(shù)的熒光成像面積縮小程度不一致等特征。王春萍等[5]研究也表明4℃低溫脅迫下水稻幼苗葉片的傷害程度隨著葉齡的增加而增大。【本研究切入點(diǎn)】對(duì)低溫脅迫下的番茄幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上?，并分析不同葉片葉綠素?zé)晒獬上竦牟町愋?，避免以局部葉綠素?zé)晒馓卣鞔碇仓暾w對(duì)低溫脅迫響應(yīng)的局限；進(jìn)一步分析植株具有光合活性的區(qū)域的熒光參數(shù)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，以利于判斷植物保持有光合活性的部位如何防御低溫傷害。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究對(duì)8℃低溫處理15 d后常溫恢復(fù)1 d的番茄幼苗，在處理的各個(gè)時(shí)期采用ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)對(duì)幼苗全株進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上瘢⒎治鋈?、?葉和第4葉葉綠素?zé)晒獬上裉卣鞯淖兓安町?，探明番茄幼苗不同葉齡葉片光合機(jī)構(gòu)對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)，從植株整體水平上探究番茄幼苗光合特性對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)機(jī)制，并完善葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在植物逆境脅迫研究中的應(yīng)用。
1 材料與方法
試驗(yàn)于2020年在井岡山大學(xué)人工氣候室進(jìn)行。
1.1 試驗(yàn)材料與處理
供試番茄品種為‘中蔬4號(hào)’（L. cv Zhongshu No.4）。種子播種于裝有草炭土的塑料盆（長(zhǎng)20 cm、寬14 cm、高5 cm），幼苗2葉期移入裝有草炭土的圓形塑料盆（直徑10 cm、高15 cm），澆灌園試營(yíng)養(yǎng)液進(jìn)行水肥管理，置于人工氣候室內(nèi)培養(yǎng)。人工氣候室設(shè)置晝夜溫度26℃/20℃（白天/夜晚），空氣相對(duì)濕度75%，采用LED植物生長(zhǎng)燈提供約500 μmol·m-2·s-1光照，晝夜光周期設(shè)置為10/14 h，8:00和18:00分別為晝夜起始時(shí)間。幼苗4葉期時(shí)，選取植株高度和冠幅較為一致且其全株葉綠素?zé)晒獬上裼贗magingPAM成像窗口中的5盆植株為試驗(yàn)材料。
于處理前（T0d）將5盆番茄試驗(yàn)植株分別編號(hào)1、2、3、4、5，并按編號(hào)順序于8:30開(kāi)始逐一開(kāi)展全株葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定，每一盆植株在測(cè)定結(jié)束后立即移入人工氣候箱中進(jìn)行8℃低溫處理，人工氣候箱空氣相對(duì)濕度75%，光照強(qiáng)度約200 μmol·m-2·s-1，光照時(shí)間8:00—18:00。于低溫處理第1、5、10、15天（分別記為T(mén)1d、T5d、T10d、T15d）于8:30開(kāi)始，按編號(hào)順序逐一進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。低溫處理15 d的植株結(jié)束熒光成像測(cè)定后立即移入人工氣候室，恢復(fù)1 d（R1d）后按編號(hào)順序?qū)Ω髦仓赀M(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。
1.2 葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定
采用調(diào)制式IMAGING-PAM葉綠素?zé)晒鈨x（Walz，德國(guó)）對(duì)番茄幼苗進(jìn)行全株葉綠素?zé)晒獬上駵y(cè)定。按照操作手冊(cè)，移除IMAGING-MAX/GS底部載物平臺(tái)并安裝4個(gè)金屬支架，將盆栽植株移入熒光儀中并使植株頂部位于18.5 cm的標(biāo)準(zhǔn)工作距離處（即LED陳列前端和植株頂部之間的距離，原安裝底部載物平臺(tái)處），以黑色絨布遮住植株根部培養(yǎng)基質(zhì)和花盆，并用黑布包裹熒光儀進(jìn)行遮光暗處理30 min。設(shè)置光化光（actinic light）強(qiáng)度為281 μmol·m-2·s-1，選擇Kinetics模式，進(jìn)行葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)曲線（持續(xù)260 s）的測(cè)定，并導(dǎo)出熒光成像源文件。
1.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)圖像分析
1.3.1 全株、第2葉和第4葉AOI區(qū)域的選擇 ImaingWin v2.47軟件提供了Circle（圓形）、Rectangle（矩形）和Polygon（多邊形）3種AOI（area of interest）區(qū)域選擇方式。其中Polygon方式可通過(guò)連續(xù)設(shè)置多邊形點(diǎn)連接成任意形狀，為以全葉作為AOI區(qū)域開(kāi)展研究提供了方便。利用ImaingWin v2.47軟件打開(kāi)熒光成像源文件，在Image窗口下選擇NIR圖像類型，采用Polygon方式沿著植株外圍將全株納入AOI范圍，獲得全株AOI區(qū)域；采用Polygon方式，分別沿第2葉和第4葉邊緣連續(xù)設(shè)置多邊形點(diǎn)使之與葉片邊緣盡量重合，獲得第2葉和第4葉全葉AOI區(qū)域（圖1-A）。
1.3.2 全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域熒光參數(shù)平均值的讀取 利用ImaingWin v2.47軟件Report功能可導(dǎo)出各AOI范圍內(nèi)像素值（size）、PSII最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）、PSII實(shí)際光化學(xué)效率（Y(II)）、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NPQ)）、PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量（Y(NO)）、非光化學(xué)猝滅（NPQ/4）和光化學(xué)猝滅（qP）等參數(shù)值。根據(jù)IMAGING-PAM操作手冊(cè)，當(dāng)光合活性區(qū)域（photosynthetically active regions，即Fv/Fm>0區(qū)域）為斑塊時(shí)，應(yīng)禁用軟件Options中“Mean over AOI”功能，此時(shí)僅對(duì)AOI范圍內(nèi)光合活性區(qū)域的熒光值進(jìn)行平均，所顯示的熒光圖像和熒光參數(shù)平均值僅對(duì)應(yīng)AOI的光合活性區(qū)域。以低溫處理5 d的植株1全株葉綠素?zé)晒獬上駡D為例，在NIR圖像類型下采用Polygon方式對(duì)第2葉和第4葉進(jìn)行全葉AOI選擇（圖1-A），在Fv/Fm圖像類型下（圖1-B）明顯可觀察到兩葉沿著葉片邊緣均有一定面積Fv/Fm=0的非光合活性區(qū)域（即AOI中呈現(xiàn)黑色的部位），其中第2葉光合活性區(qū)域面積占全葉總面積的比例明顯低于第4葉。
圖1 低溫處理5 d時(shí)番茄幼苗第2葉和第4葉AOI選擇（A）及其光合活性區(qū)域（B）（以植株1為例）
選擇好全株、第2葉和第4葉的AOI后，通過(guò)軟件的Report功能導(dǎo)出全株、第2葉和第4葉AOI區(qū)域的Size、Fv/Fm、Y(II)、Y(NPQ)、Y(NO)、NPQ/4和qP等熒光參數(shù)值。經(jīng)過(guò)260 s光化光誘導(dǎo)，植株熒光曲線已平滑，因此，選擇誘導(dǎo)曲線最后一次測(cè)得的熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，所有熒光參數(shù)值均為AOI范圍內(nèi)光合活性區(qū)域的平均值。
1.3.3 植株全株的光合活性區(qū)域相對(duì)面積和各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積的計(jì)算 通過(guò)ImaingWin v2.47軟件，在Image窗口對(duì)最后一次熒光成像選擇Analysis功能，通過(guò)設(shè)置各熒光參數(shù)Low值為0.004，High值為1（其中，Y(NO)參數(shù)Low值設(shè)定為0，High值設(shè)定為0.996），讀取Red Pixel Assessment中的Number值，該值即為各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域面積（size of fluorescence active regions，SAF）。由于ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)定義Fv/Fm>0的部位為光合活性區(qū)域，因此，F(xiàn)v/Fm的熒光活性區(qū)域面積即為光合活性區(qū)域面積（size of photosynthetically active regions，SAP）。基于處理前（T0d）植株全株各部位的Fv/Fm均大于0且較為均勻，此時(shí)植株的光合活性區(qū)域面積與植株總面積一致，因此，采用此時(shí)各植株的光合活性區(qū)域面積作為該植株總面積（SAP(T0d)）。
處理各時(shí)期植株熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域相對(duì)面積（relative area of fluorescence active regions, RAF）采用該時(shí)期植株各熒光參數(shù)的熒光活性區(qū)域面積（SAF(Treatment)，其中Treatment代表T0d、T1d、T5d、T10d、T15d、R1d）與SAP(T0d)比較而得，RAF(%) = SAF(Treatment)/SAP(T0d)×100。全株的光合活性區(qū)域相對(duì)面積（relative area of photosynthetically active regions，RAP）則為Fv/Fm的RAF。雖然番茄幼苗在低溫脅迫下葉片會(huì)發(fā)生輕微的卷曲和下垂，從而導(dǎo)致植株面積下降，使采用該方法估算植株光合活性區(qū)域相對(duì)面積和熒光參數(shù)活性區(qū)域相對(duì)面積會(huì)稍低于實(shí)際值，但不會(huì)改變低溫對(duì)其影響的整體趨勢(shì)，因此，本研究仍采用這種計(jì)算方式。
1.3.4 第2葉和第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積的計(jì)算 由ImaingWin v2.47軟件Report功能導(dǎo)出的Size值為AOI像素值，即AOI面積。配合Options菜單中啟用和禁用“Mean over AOI”功能，可獲得AOI總面積和AOI光合活性區(qū)域面積。啟用“Mean over AOI”，Size值為AOI總像素值，即AOI總面積（ST）；禁用“Mean over AOI”，Size值則是AOI中具有光合活性區(qū)域的像素值，即AOI的光合活性區(qū)域面積（SP）。第2葉和第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積RAP(%) = SP/ ST×100。
2 結(jié)果
2.1 低溫脅迫對(duì)光合活性區(qū)域相對(duì)面積和Fv/Fm的影響
隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)v/Fm熒光成像呈現(xiàn)出由葉緣逐漸向主脈收縮變小的趨勢(shì)，以及葉片葉齡越大其熒光成像面積縮小越明顯的特征；低溫處理也導(dǎo)致Fv/Fm值的下降，表現(xiàn)為代表Fv/Fm值大小的顏色由深藍(lán)色向綠色和黃色轉(zhuǎn)變，且葉齡越大熒光值越小，同一葉片靠近莖和葉脈中心部分的熒光值越大。低溫處理后僅恢復(fù)1 d，F(xiàn)v/Fm熒光成像面積得以迅速恢復(fù)，并且新葉靠近莖中心的大部位區(qū)域也基本恢復(fù)至深藍(lán)色，但老葉則仍有較大面積呈現(xiàn)黃綠色（圖2）。這表明新葉對(duì)低溫脅迫的抵抗能力和恢復(fù)能力均高于老葉。由于ImagingPAM熒光成像系統(tǒng)定義Fv/Fm>0部位為光合活性區(qū)域，因此，圖2也代表了光合活性區(qū)域的變化情況。
低溫處理對(duì)番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積的影響如圖3-A所示。第4葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積在低溫處理1 d時(shí)并未下降，處理5 d下降6.9%后就不再下降。但番茄全株和第2葉光合活性區(qū)域相對(duì)面積隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，低溫處理1 d即分別下降21.6%和14.2%，處理15 d時(shí)則分別下降了55.4%和40.8%。常溫下恢復(fù)1 d，番茄全株、第2葉和第4葉的光合活性區(qū)域相對(duì)面積均可完全恢復(fù)至處理前水平，說(shuō)明8℃低溫脅迫15 d并未引起番茄幼苗葉片壞死。
低溫處理對(duì)番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域Fv/Fm的影響如圖3-B所示。幼苗全株、第2葉和第4葉的Fv/Fm在處理前均約0.710，低溫處理1 d即引起Fv/Fm的迅速下降，處理5 d時(shí)達(dá)到最低點(diǎn)，分別為0.256、0.229和0.320；但隨后的低溫處理并未引起全株和第2葉Fv/Fm的下降，第4葉反而有所上升?；謴?fù)1 d，第4葉Fv/Fm可完全恢復(fù)至處理前水平，而全株和第2葉則恢復(fù)至0.620和0.580，仍低于處理前水平。
圖2 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗Fv/Fm的熒光成像（以植株1為例）
圖3 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域相對(duì)面積（RAP）和Fv/Fm的影響
2.2 低溫脅迫對(duì)Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的影響
由圖4和圖5-A可知，低溫處理可導(dǎo)致Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)熒光成像面積的下降，但對(duì)Y(II)的影響更為明顯。番茄幼苗Y(II)熒光成像面積隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而急劇下降，至處理15 d時(shí)難以觀察到植株基本形態(tài)。低溫脅迫下Y(NPQ)和Y(NO)的成像面積雖然略有下降，但仍保持了植株基本形態(tài)。低溫處理期間Y(NPQ)和Y(NO)的熒光活性區(qū)域表現(xiàn)出與光合活性區(qū)域面積同步下降，在處理15 d時(shí)還稍高于光合活性區(qū)域面積，而Y(II)熒光活性區(qū)域面積則明顯低于光合活性區(qū)域面積。然而，恢復(fù)1 d時(shí)，Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)熒光成像面積均可恢復(fù)至處理前水平，且與植株光合活性區(qū)域面積相一致。
低溫處理1 d即導(dǎo)致番茄幼苗光合活性區(qū)域Y(II)熒光值大幅下降，隨后則呈現(xiàn)小幅升高、降低、再升高的變化（圖5-B）。雖然番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域的Y(II)熒光值在低溫處理前高于第4葉，但低溫處理期間第4葉的Y(II)熒光值高于全株和第2葉。恢復(fù)1 d，全株和第2葉的Y(II)熒光值可恢復(fù)至處理前水平，而第4葉則明顯高于處理前水平。由圖4-A可知，靠近莖尖生長(zhǎng)中心的新葉表現(xiàn)綠色，老葉葉緣處仍表現(xiàn)為明顯的黃色，表明長(zhǎng)期低溫脅迫后番茄幼苗優(yōu)先恢復(fù)生長(zhǎng)中心葉片的Y(II)。
處理前番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域的Y(NPQ)明顯低于第4葉，低溫處理期間Y(NPQ)呈現(xiàn)先下降后上升的變化趨勢(shì)（圖5-C）。其中，第4葉的Y(NPQ)在低溫處理5 d時(shí)下降至最低點(diǎn)后開(kāi)始上升；而全株和第2葉的Y(NPQ)分別在處理5 d和10 d時(shí)降到最低點(diǎn)，然后均從低溫處理10 d后開(kāi)始上升?；謴?fù)1 d后，第2葉的Y(NPQ)仍有小幅上升，而第4葉和全株的Y(NPQ)則與低溫處理15 d時(shí)沒(méi)有明顯變化，但均未恢復(fù)至處理前水平。
處理前番茄幼苗全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域Y(NO)未見(jiàn)差異，低溫處理則導(dǎo)致了Y(NO)的上升，且全株和第2葉的上升幅度大于第4葉（圖5-D）。全株和第2葉的Y(NO)在處理10 d時(shí)達(dá)到最大值，而第4葉則在低溫處理5 d時(shí)達(dá)到最大值，然后均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯下降?；謴?fù)1 d后，全株、第2葉和第4葉的Y(NO)均顯著下降，其中第4葉可恢復(fù)至處理前水平，但全株和第2葉的Y(NO)仍稍高于處理前水平。結(jié)合圖4-C番茄幼苗外圍部分Y(NO)熒光成像呈現(xiàn)藍(lán)色，而靠近莖尖生長(zhǎng)中心的葉片部分則呈黃綠色，說(shuō)明位于番茄內(nèi)側(cè)的莖尖和新葉的Y(NO)更易于恢復(fù)。
圖4 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的熒光成像（以植株1為例）
圖5 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域Y(II)、Y(NPQ)和Y(NO)的影響
2.3 低溫脅迫對(duì)NPQ和qP的影響
由圖6和圖7-A可知，低溫脅迫下番茄幼苗NPQ熒光成像面積雖然略有下降，但仍呈現(xiàn)出植株基本形態(tài)，且其熒光活性區(qū)域相對(duì)面積除了在低溫處理15 d時(shí)稍高于光合活性區(qū)域相對(duì)面積外，其他時(shí)間均與光合活性區(qū)域相對(duì)面積沒(méi)有明顯差異。而qP的熒光成像面積在低溫處理1 d時(shí)即大幅下降，且在低溫處理后期難以觀察到植株基本形態(tài)。但恢復(fù)1 d時(shí)，NPQ和qP的熒光成像面積均可恢復(fù)至處理前水平。
圖6 低溫脅迫15 d和恢復(fù)1 d期間番茄幼苗NPQ和qP的熒光成像（以植株1為例）
圖7 低溫脅迫對(duì)番茄幼苗光合活性區(qū)域NPQ和qP的影響
處理前番茄幼苗全株和第2葉光合活性區(qū)域NPQ明顯低于第4葉，低溫處理期間NPQ呈先下降后上升的變化。幼苗全株、第2葉和第4葉的Y(NPQ)均在低溫處理5 d時(shí)下降至最低點(diǎn)，隨后，第4葉在低溫處理5 d后即開(kāi)始恢復(fù)，全株和第2葉從10 d后開(kāi)始恢復(fù)?；謴?fù)1 d，全株、第2葉和第4葉的NPQ仍顯著上升，但均未恢復(fù)至處理前水平（圖7-B）。
低溫處理前番茄全株、第2葉和第4葉光合活性區(qū)域的qP沒(méi)有明顯差異，低溫處理1 d導(dǎo)致qP小幅下降，處理5 d時(shí)均明顯上升至高于處理前水平；隨后，低溫處理10 d時(shí)qP又有所下降，其中第4葉和全株仍保持在不低于處理前水平，而第2葉則下降至處理前的51.3%；低溫處理15 d時(shí)，全株和第4葉的qP又顯著上升至高于處理前水平，而第2葉則變化不大?；謴?fù)1 d時(shí)，第2葉qP迅速恢復(fù)至處理前水平，第4葉也略有上升并高于處理前，而全株qP則下降至處理前水平（圖7-C）。
3 討論
3.1 低溫脅迫影響番茄幼苗不同葉齡葉片光合活性區(qū)域面積及分布
葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在作物低溫脅迫研究中的應(yīng)用表明冷害并不是均勻發(fā)生在葉片各部分[18,22-23]，本研究結(jié)果也表明低溫處理引起了番茄幼苗所有葉片各熒光參數(shù)的異質(zhì)性增大并且對(duì)葉齡大的葉片影響更大。進(jìn)一步比較各時(shí)期不同葉齡葉片的熒光參數(shù)熒光成像和熒光活性相對(duì)面積，雖然低溫導(dǎo)致了幼苗全株和所有葉片的熒光活性區(qū)域縮小，但對(duì)第2葉的抑制作用更明顯，而靠近生長(zhǎng)中心的第4葉則顯著優(yōu)于第2葉和全株水平。而且第2葉也表現(xiàn)出光合活性區(qū)域主要分布于近莖端和葉脈處，幼苗植株的光合活性區(qū)域整體呈現(xiàn)以莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)為中心向外擴(kuò)散的分布趨勢(shì)。這些結(jié)果均表明低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉。王春萍等[5]的研究也表明低溫脅迫下水稻幼苗葉片的葉齡越大越容易受到傷害，葉齡越小則對(duì)低溫的抵抗能力越強(qiáng)。
與此同時(shí)，本研究觀察到低溫脅迫導(dǎo)致葉片光合活性區(qū)域的縮小在常溫恢復(fù)1 d時(shí)即可完全恢復(fù)至處理前水平，這意味著低溫導(dǎo)致的光合活性區(qū)域面積減少是保護(hù)性的可逆反應(yīng)。植物綠色葉片低溫光抑制是由于葉片吸收的光能超過(guò)碳同化所需，光能吸收與利用的失衡導(dǎo)致光合機(jī)構(gòu)中過(guò)剩激發(fā)能的積累，最終促進(jìn)了活性氧的產(chǎn)生和傷害的發(fā)生[24-26]。據(jù)此，推測(cè)低溫脅迫下（8℃、200 μmol·m-2·s-1）番茄可以主動(dòng)關(guān)閉葉片部分區(qū)域的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)活性，通過(guò)減少對(duì)光能的吸收來(lái)主動(dòng)防御低溫傷害，是番茄在低溫脅迫下的一種自適應(yīng)反應(yīng)。筆者課題組前期研究也表明，番茄葉片單位面積有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)目（RC/CS）在8℃低溫處理的第1天即顯著下降，并在低溫處理4 d后恢復(fù)的第1天即大幅上升，也從另一側(cè)面說(shuō)明低溫脅迫誘導(dǎo)了番茄葉片PSII反應(yīng)中心的可逆失活[14]。這一現(xiàn)象在其他文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道，因此，需要在更多的植物種類和不同光溫脅迫條件下進(jìn)行研究，進(jìn)一步驗(yàn)證植物是否具有主動(dòng)關(guān)閉葉片部分區(qū)域PSII的光化學(xué)反應(yīng)活性以適應(yīng)低溫脅迫的響應(yīng)機(jī)制。
3.2 低溫脅迫影響番茄幼苗不同葉齡葉片光合活性區(qū)域葉綠素?zé)晒鈪?shù)
葉綠素?zé)晒鈪?shù)反映了植物葉片PSII的功能和吸收光能分配情況。低溫脅迫通常會(huì)抑制番茄幼苗葉片PSII光化學(xué)效率，從而減少葉片吸收光能分配給PSII光化學(xué)反應(yīng)的比例，導(dǎo)致吸收光能中PSII非調(diào)節(jié)性能量耗散部分的增加和PSII光抑制的發(fā)生，表現(xiàn)為Fv/Fm、qP和Y(II)（或ΦPSII）的下降和Y(NO)的上升[27-29]。而低溫對(duì)番茄葉片熱耗散能力的影響則因低溫處理?xiàng)l件不同而異，4℃暗處理10 h誘導(dǎo)了番茄品種Micro-Tom葉片NPQ增強(qiáng)[30]，夜間5℃處理3 d也誘導(dǎo)了番茄品種‘L-404’葉片Y(NPQ)的增強(qiáng)[18]，而低溫弱光（15℃白天/7℃夜晚，180 μmol·m-2·s-1）處理15 d導(dǎo)致番茄品種‘合作903’葉片NPQ下降[28]。本研究發(fā)現(xiàn)8℃低溫處理前期（5 d）對(duì)番茄品種‘中蔬4號(hào)’葉片光合活性區(qū)域光抑制的影響較明顯，而處理后期（5—15 d）并未引起光抑制程度的加劇。低溫處理后期第2葉光合活性區(qū)域面積持續(xù)下降，這表明低溫處理后期番茄幼苗成熟葉可通過(guò)主動(dòng)縮小葉片光合活性區(qū)域來(lái)適應(yīng)低溫脅迫。然而，第4葉的光合活性區(qū)域面積在低溫處理后期并未下降，而其Fv/Fm反而有所上升，這意味著新生葉具有與成熟葉不同的低溫光抑制防御機(jī)制。
PSII天線色素吸收光能可分為PSII光化學(xué)反應(yīng)利用的能量Y(II)、PSII調(diào)節(jié)性能量耗散Y(NPQ)和非調(diào)節(jié)性的能量耗散Y(NO)三部分[31]。高Y(NO)值意味著PSII反應(yīng)中心過(guò)量激發(fā)能的積累，并將成為光抑制發(fā)生的誘因[31-32]。本研究中所有葉片的Y(NO)在低溫處理的前5 d迅速上升，第10 天時(shí)第2葉并沒(méi)有明顯變化而第4葉開(kāi)始下降，第15 d時(shí)則全部呈明顯下調(diào)。該結(jié)果證明了低溫處理前期番茄葉片PSII反應(yīng)中心激發(fā)能的積累引起了光抑制的發(fā)生，而低溫處理后期PSII反應(yīng)中心激發(fā)能的積累不但沒(méi)有進(jìn)一步加劇反而有所緩解，從而使光合活性區(qū)域的光抑制程度并未加劇，新生葉光抑制程度反而有所緩解。低溫處理前期Y(NO)迅速上升的原因是由于Y(II)和Y(NPQ)同時(shí)大幅下降所致，而后期Y(NO)有所緩解的原因則主要是由于Y(NPQ)恢復(fù)上升所致。低溫處理1 d即導(dǎo)致Y(II)大幅下降53.7%，并在隨后的低溫處理中一直保持低水平。Y(II)的下降表明低溫降低了PSII反應(yīng)中心將光能轉(zhuǎn)化為電能進(jìn)行電子傳遞的能力[33]，這與筆者課題組利用快速葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)分析的結(jié)果相一致，低溫處理降低了番茄葉片單位面積對(duì)光能的吸收（ABS/CS）、捕獲（TRo/CS）和進(jìn)行電子傳遞（ETo/CS）的能力[14]。Y(NPQ)則在處理的前5 d內(nèi)持續(xù)下降至處理前的48.0%，隨后第4葉隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯恢復(fù)上升，而第2葉和全株則在第10天后明顯恢復(fù)上升，處理期間NPQ也呈現(xiàn)出相同的變化趨勢(shì)。這些結(jié)果意味著低溫處理前期不但沒(méi)有誘導(dǎo)反而抑制了番茄光合機(jī)構(gòu)熱耗散的進(jìn)行，低溫處理后期熱耗散才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用。
然而，本研究還發(fā)現(xiàn)，番茄全株和第4葉光合活性區(qū)域qP僅表現(xiàn)為在處理第1 天時(shí)分別小幅下降20.1%和17.1%，隨后維持在不低于或高于處理前水平。qP反映了PSII反應(yīng)中心的開(kāi)放程度[33]，取決于QA的氧化還原程度，決定了PSII的激發(fā)能捕獲速率[34]。這意味著在長(zhǎng)達(dá)15 d的低溫處理期間，番茄新生葉光合活性區(qū)域的PSII反應(yīng)中心只在第1天有較小程度的關(guān)閉，隨后一直維持著較高開(kāi)放程度，對(duì)激發(fā)能的捕獲能力增強(qiáng)。多數(shù)文獻(xiàn)中低溫導(dǎo)致植物qP下降，這主要與熒光參數(shù)測(cè)量采用光纖式熒光儀有關(guān)，在這種情況下測(cè)得的qP是測(cè)量區(qū)域內(nèi)（包括光合活性區(qū)域和非光合活性區(qū)域）的qP平均值。事實(shí)上，如果以番茄全株或第4葉全葉面積（包括光合活性區(qū)域和非活性區(qū)域）所讀取的qP平均值也隨著低溫處理時(shí)間延長(zhǎng)而下降（數(shù)據(jù)未列出）。結(jié)合番茄全株和各葉片光合活性區(qū)域面積隨著低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)而持續(xù)下降，而Y(II)和qP熒光活性相對(duì)面積顯著低于光合活性區(qū)域相對(duì)面積這一結(jié)果，是否意味著低溫脅迫除了誘導(dǎo)番茄葉片部分區(qū)域PSII反應(yīng)中心的可逆失活，還導(dǎo)致光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉，但刺激了新生葉剩余有活性的PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高。有研究表明，低溫脅迫在降低作物葉片單位面積有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)目（RC/CS）時(shí)會(huì)迫使作物剩余有活性的反應(yīng)中心效率的提高[14,35]。而番茄新生葉對(duì)低溫的這種響應(yīng)是否有利于脅迫解除后葉片光合能力的恢復(fù)？本研究觀察到低溫處理后恢復(fù)1 d，第4葉的qP即可恢復(fù)至處理前的119.8%，熒光成像圖也顯示此時(shí)番茄幼苗絕大部分葉片區(qū)域呈現(xiàn)比處理前qP數(shù)值更高的藍(lán)紫色，似乎佐證了這種設(shè)想。但是，與處理前相比，第2葉在低溫處理后期（10、15 d）相比處理前約下降了50%，這意味著長(zhǎng)期低溫脅迫對(duì)番茄成熟葉有活性的PSII反應(yīng)中心數(shù)量和開(kāi)放程度均有明顯的抑制作用。王春萍等[5]的研究也表明，與對(duì)照相比，低溫脅迫下水稻葉齡最小的第3葉qP有明顯上升，而葉齡最大的第1葉qP則顯著下降。雖然有關(guān)植物低溫馴化提高抗寒性有較多研究，例如辣椒在14℃亞適溫馴化5 d可促進(jìn)依賴于葉黃素循環(huán)的熱耗散能力的增強(qiáng)[36]，番茄在12℃/10℃低溫馴化3 d后可通過(guò)激發(fā)H2O2以誘導(dǎo)抗氧化酶的表達(dá)與活性的上調(diào)[37]，并對(duì)光合機(jī)構(gòu)起保護(hù)作用。而本研究中8℃低溫處理后期新生葉光合活性區(qū)域維持較高的PSII開(kāi)放程度這一自適應(yīng)現(xiàn)象在以往研究中鮮見(jiàn)討論，值得深入研究。
4 結(jié)論
8℃低溫處理下，番茄幼苗可通過(guò)主動(dòng)降低葉片光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，處理前期對(duì)光合活性區(qū)域光抑制影響顯著，而處理后期光抑制程度沒(méi)有加??；葉片熱耗散能力在低溫處理前期受到抑制，直到處理后期才逐漸發(fā)揮其光保護(hù)作用；低溫脅迫下番茄幼苗優(yōu)先保護(hù)生長(zhǎng)點(diǎn)和新生葉，成熟葉主要通過(guò)可逆降低光合活性區(qū)域面積來(lái)適應(yīng)低溫脅迫，而新生葉則主要通過(guò)維持相對(duì)較高的PSII反應(yīng)中心光化學(xué)和熱耗散能力防御低溫光抑制；低溫導(dǎo)致新生葉光合活性區(qū)域中部分有活性的PSII反應(yīng)中心關(guān)閉的同時(shí)，刺激了剩余有活性PSII反應(yīng)中心開(kāi)放程度的提高，有利于低溫脅迫解除后恢復(fù)期光合活性的恢復(fù)。
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Effects of Chilling on Chlorophyll Fluorescence Imaging Characteristics of Leaves with Different Leaf Ages in Tomato Seedlings
1School of Life Sciences, Jinggangshan University, Ji’an 343009, Jiangxi;2College of Agriculture and Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310058
This study analyzed the characteristics of chlorophyll fluorescence imaging of the 2nd (mature) and 4th (newly born) leaves of tomato seedlings in response to chilling stress, aiming to probe the mechanism of leaves with different ages adapted to chilling stress in tomato seedlings.In this study,L. cv Zhongshu No. 4 was used as the research material. The tomato seedlings in the 4-leaf stage were treated at chilling (8℃, 200 μmol·m-2·s-1) for 15 d and then recovered at normal temperature (26℃ day/20℃ night, 500 μmol·m-2·s-1) for 1 d. The Chlorophyll fluorescence imagings of the whole seedlings were measured at different stages under different treatments, and the characteristics of chlorophyll fluorescence imaging of the 2nd and 4th leaves were compared.The results showed that the relative area of photosynthetically active regions (RAP) on the 4th leaves decreased slowly during the first 5 d of the chilling stress, while the RAPon the 2nd leaves and the whole plants decreased steadily during the whole chilling treatment. The RAPrecovered completely after 1 d of recovery. Under chilling treatment, the relative area of fluorescence active regions (RAF) for quantum yield of regulatory energy dissipation (Y(NPQ)), quantum yield of nonregulatory energy dissipation (Y(NO)), and nonphotochemical quenching (NPQ) showed similar changes as that of RAP. However, the RAFof effective PSII quantum yield (Y(II)) and coefficient of photochemical quenching (qP) were significantly lower than that of RAP. The maximum PSII quantum yield (Fv/Fm), Y(NPQ), and NPQ decreased while Y(NO) increased sharply in the photosynthetically active region in tomato seedlings during the first 5 d of the chilling treatment. In the following days, the Fv/Fm remained unchanged, whereas Y(NPQ) and NPQ increased and Y(NO) decreased. However, Y(II) declined sharply 1 d after chilling stress and then remained unchanged. Interestingly, qP in the photosynthetic active region of the 4th leaves decreased only slightly after 1 d of chilling treatment, and then maintained higher than that before treatment. However, qP of the 2nd leaves increased significantly on the 5th day and then decreased rapidly. Overall, the Fv/Fm, Y(II), Y(NPQ) and qP in the 4th leaves were higher than those in the 2nd leaves, whereas the Y(NO) were relatively lower in the 4th leaves.The study found that tomato seedlings responded to chilling stress by decreasing the area of photosynthetically active regions. The regulatory nonphotochemical quenching, which played a central role in photoprotection, was inhibited in the early stage, but gradually increased during the later stage under chilling treatment. The mature leaves adapted to chilling stress likely by decreasing the size of photosynthetically active regions, while higher capacities of PSII photochemistry and thermal dissipation were maintained in the newly born leaves in response to chilling stress. The protection of shoot apex and newly born leaves might be the priority of tomato seedlings in response to chilling stress. For newly born leaves, the chilling induced the closure of some active PSII reaction centers, but improved the operating efficiency of the remaining active PSII reaction centers, which was potentially beneficial for the recovery of photosynthetic activity.
tomato (L.); chilling stress; chlorophyll fluorescence imaging; photoinhibition; leaf age
2022-04-13；
2022-06-16
江西省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2019ACB20017）
胡雪華，E-mail：huxuehua1210@126.com。通信作者胡文海，E-mail：huwenhai@jgsu.edu.cn
（責(zé)任編輯 趙伶俐）
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