由玉婉，張雨，孫嘉毅，張蔚

‘月月粉’月季NAC家族全基因組鑒定及皮刺發(fā)育相關(guān)成員的篩選

由玉婉，張雨，孫嘉毅，張蔚

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院/園藝植物生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華中都市農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430070

從‘月月粉’月季全基因組中鑒定NAC家族成員，并進(jìn)行生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析，為研究‘月月粉’的潛在功能提供理論基礎(chǔ)，篩選可能參與皮刺發(fā)育的候選基因。以擬南芥NAC氨基酸序列為參考，利用雙向Blast及HMM結(jié)構(gòu)域檢索篩選RcNAC；對(duì)篩選成員進(jìn)行理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、序列特征、順式元件和系統(tǒng)進(jìn)化分析；基于已釋放轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析在不同組織器官，和不同逆境處理?xiàng)l件下的表達(dá)特性；同時(shí)通過‘月月粉’不同發(fā)育階段皮刺組織轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，篩選與皮刺發(fā)育可能相關(guān)的。共鑒定得到116個(gè)s，均含有完整典型的NAM保守結(jié)構(gòu)域，其編碼蛋白包含69—713個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)從4.43—9.54，分子質(zhì)量從7.87—79.99 kD，81個(gè)RcNACs被預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核內(nèi)；115個(gè)s在7條染色體上不均勻分布，1個(gè)未明確位置信息；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析將AtNACs、OsNACs和RcNACs聚為21類；在不同組織器官中，116個(gè)s表達(dá)模式各異，遭受水脅迫和感染灰霉病之后，31個(gè)s表達(dá)量發(fā)生變化；在衰老的花組織中，6個(gè)s表達(dá)量上升；皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中檢測(cè)到53個(gè)s，其中26個(gè)s為差異表達(dá)基因。基于已有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，s協(xié)同調(diào)控植物組織發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)；結(jié)合皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，部分成員可能參與皮刺細(xì)胞增殖、次生細(xì)胞壁生物合成及細(xì)胞程序性死亡等過程，可作為皮刺發(fā)育相關(guān)候選基因進(jìn)行深入研究。

‘月月粉’；NAC轉(zhuǎn)錄因子；轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；皮刺發(fā)育

0 引言

【研究意義】月季（sp.）是薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（L.）的一個(gè)重要類群，因其色彩絢麗、花型優(yōu)美、花香馥郁，且連續(xù)開花，在世界各地被廣泛種植和栽培，具有極高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。然而，月季莖桿多著生皮刺，對(duì)月季的田間管理、采后運(yùn)輸及園林應(yīng)用等造成了極大不便，并帶來了安全隱患。因此，培育無刺或軟刺品種是月季育種的重要目標(biāo)之一。對(duì)中國古老月季品種‘月月粉’（Old Blush）NAC家族基因進(jìn)行全面的生物信息學(xué)分析和表達(dá)特性研究，有利于深入了解NAC家族基因的功能，并對(duì)月季品種的遺傳改良具有重要的參考意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已有研究表明，薔薇屬植物皮刺起源于表皮下的原分生組織，分為腺體型皮刺與非腺體型皮刺，依據(jù)皮刺是否有毛附著及是否分叉可進(jìn)一步劃分為5種亞類[1]，‘月月粉’皮刺為典型的非腺體型皮刺。轉(zhuǎn)錄因子（transcription factor）在基因表達(dá)過程中起著重要的作用，其中最常見的一類轉(zhuǎn)錄因子就是轉(zhuǎn)錄激活子和轉(zhuǎn)錄抑制子，這類轉(zhuǎn)錄因子與特定的DNA序列結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控基因的相關(guān)表達(dá)[2]。ZHANG等[3]利用高通量測(cè)序手段，分析了有刺野薔薇及無刺突變體間的差異表達(dá)基因，從而確定了可能與皮刺形成有關(guān)的關(guān)鍵基因和代謝途徑。在這些差異表達(dá)基因中，一些與發(fā)育和次生代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子基因，包括、、和等，在著生皮刺的節(jié)間部位表達(dá)明顯上調(diào)。其中，NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，命名由（no apical meristem）、（transcription activation factor）、（cup-shaped cotyledon）3個(gè)基因的首字母縮寫組成[4]，這3個(gè)基因在N端編碼高度保守的蛋白序列，與DNA的結(jié)合能力相關(guān)，包含A—E五個(gè)亞域，蛋白C端具有多樣性，其富含酸性氨基酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸等簡單重復(fù)序列，與轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)[5-6]。隨著植物各基因組數(shù)據(jù)的釋放，在擬南芥（）、水稻（）、棉花（spp.）等物種中都已鑒定出大量的[7-9]。研究表明，廣泛參與植物生長發(fā)育進(jìn)程，在植物種子發(fā)育、分生組織生長、次生壁和木質(zhì)部的形成、根的生長以及植物的衰老過程中都起著重要的作用[10-15]，在黃瓜（L.）中，NAC轉(zhuǎn)錄因子還與黃瓜刺的形成及刺密度相關(guān)[16]。同時(shí)，在植物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。的沉默增強(qiáng)了萵苣（）對(duì)假單胞菌的抗性，并且降低了植株在干旱脅迫下的萎蔫效應(yīng)[17]；在煙草中表達(dá)歐洲葡萄‘粉紅亞都蜜’（Yatomo Rose），植株對(duì)干旱的耐受性降低[18]；桃（L.）在低溫脅迫處理下，16個(gè)表達(dá)量顯著上調(diào)[19]；番茄（）在響應(yīng)鋁脅迫時(shí)發(fā)揮重要作用[20]。以上研究表明，NAC家族成員廣泛參與植物生長發(fā)育及各種防御反應(yīng)。【本研究切入點(diǎn)】已在多個(gè)物種中被鑒定，并發(fā)現(xiàn)其發(fā)生不同程度的功能分化，但在‘月月粉’中尚未有NAC家族相關(guān)研究報(bào)道。目前，高質(zhì)量的‘月月粉’雙單倍體基因組信息已經(jīng)公布[21-22]，為研究相關(guān)基因的功能及關(guān)系奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究利用生物信息學(xué)手段，鑒定‘月月粉’NAC基因家族，并系統(tǒng)分析‘月月粉’NAC家族的理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、染色體定位及系統(tǒng)進(jìn)化等，結(jié)合組織表達(dá)特異性、脅迫表達(dá)模式以及不同發(fā)育階段皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究的生物學(xué)功能，尋找可能與皮刺發(fā)育相關(guān)的，并應(yīng)用于月季品種的遺傳改良提供理論參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2021年7至2022年3月在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.1 ‘月月粉’NAC家族成員鑒定及理化性質(zhì)分析

在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）以及薔薇科基因組數(shù)據(jù)庫（https://www.rosaceae.org）中分別下載獲得擬南芥和‘月月粉’基因組序列及基因結(jié)構(gòu)注釋文件。在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫（http:// planttfdb.gao-lab.org/）[23]中下載擬南芥NAC蛋白ID，結(jié)合擬南芥基因組序列獲得擬南芥NAC家族成員基因序列，使用TBtools[24]和NCBI中的Blast工具進(jìn)行雙向blast比對(duì)篩選，結(jié)合HMM結(jié)構(gòu)域檢索，初步得到候選s，利用在線網(wǎng)站NCBI-Batch-CDD（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）對(duì)候選RcNACs序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，得到最終NAC家族成員。利用ExPASy（https://web. expasy.org/compute_pi/）分析RcNACs等電點(diǎn)和蛋白分子量等理化性質(zhì)，使用WoLF PSORT（http：//www.genscript.com/wolf-psort.html）對(duì)RcNACs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)。

1.2 ‘月月粉’NAC家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析

在PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中下載水稻（subsp.）NAC氨基酸序列，使用MEGA X[25]對(duì)擬南芥、水稻和‘月月粉’中鑒定出的NAC蛋白的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建進(jìn)化樹（bootstrap=1000）。利用iTOL[26]在線網(wǎng)站（https://itol.embl.de/）進(jìn)行進(jìn)化樹美化。

1.3 ‘月月粉’NAC家族染色體定位、共線性分析、基因結(jié)構(gòu)及保守基序分析

利用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suit.org/index. html）對(duì)‘月月粉’NAC蛋白進(jìn)行保守基序序列預(yù)測(cè)[27]。利用TBtools工具，基于‘月月粉’、擬南芥基因組序列進(jìn)行共線性分析，并結(jié)合‘月月粉’基因組注釋文件信息以及NCBI-Batch-CDD保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果，對(duì)s染色體定位、共線性結(jié)果、基因結(jié)構(gòu)以及保守基序進(jìn)行可視化展示。

1.4 ‘月月粉’NAC家族啟動(dòng)子順式元件分析

結(jié)合‘月月粉’基因組注釋文件，使用在線分析網(wǎng)站PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/）對(duì)s順式作用元件進(jìn)行分析，并利用TBtools進(jìn)行可視化展示。

1.5 ‘月月粉’NAC家族成員表達(dá)分析

1.5.1 組織及誘導(dǎo)表達(dá)分析 利用RcNAC成員的氨

基酸序列在‘月月粉’參考轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫（https://lipm- browsers.toulouse.inra.fr/pub/RchiOBHm-V2/）進(jìn)行blast比對(duì)，獲取并下載部分成員在幼葉和幼莖（FTN），水脅迫的植株葉片（FTS），感染灰霉病LR18的葉片（FTB），白色幼根（RAC），休眠的腋芽即營養(yǎng)分生組織（NDB），萌發(fā)的腋芽即營養(yǎng)分生組織（DBO），花分生組織轉(zhuǎn)變時(shí)期的花芽（IFL），花分生組織和早期花器官包括萼片、花瓣、雄蕊和心皮（IMO），閉合的花（BFL），開放的花（OFT），衰老的花（SEN），雄蕊（DET），從授粉到色素積累早期的果實(shí)（CYN）組織中的表達(dá)數(shù)據(jù)[28]。利用TBtools工具繪制不同組織表達(dá)熱圖。

1.5.2 皮刺相關(guān)的篩選及qRT-PCR分析 以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)薔薇科植物種質(zhì)資源圃內(nèi)保存的中國古老月季品種‘月月粉’為試材，采集其植株莖桿上4個(gè)不同發(fā)育階段的皮刺。Stage I為柔軟幼嫩、尚未木質(zhì)化的皮刺，Stage Ⅱ?yàn)橐欢ǔ潭饶举|(zhì)化、尖端開始向基部彎曲的皮刺，Stage Ⅲ為木質(zhì)化較完全、形態(tài)基本成熟的皮刺，Stage IV為發(fā)育成熟、并初步開始衰老的皮刺（圖1）。每個(gè)階段的樣本設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品送至武漢博越致和生物科技有限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，建立皮刺不同發(fā)育時(shí)期基因數(shù)字表達(dá)譜，并根據(jù)TPM法計(jì)算基因表達(dá)量的結(jié)果。使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（RN0902，艾德萊生物）提取4個(gè)階段樣本RNA，使用PrimeScript? RT Reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（RR047A，TaKaRa）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成，供熒光定量使用。從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中選取10個(gè)基因，使用Primer-BLAST（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ tools/primer-blast/）設(shè)計(jì)定量引物，內(nèi)參基因?yàn)椤略路邸?，在QuantStudio? 6 Flex熒光定量PCR儀（Thermo）上進(jìn)行分析，每個(gè)階段設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，擴(kuò)增體系共10 μL，含1 μL cDNA，上、下游引物各0.4 μL，TB GreenII（RR820A，TaKaRa）5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，ddH2O 3 μL。反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎ?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火/延伸34 s，40個(gè)循環(huán)。用參照基因的ΔCt法計(jì)算10個(gè)基因的表達(dá)量。

基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過差異倍數(shù)（|log2(Fold change)|≥1）和顯著水平（-value＜0.05）兩個(gè)水平挑選出樣品間的差異表達(dá)基因[29]，并對(duì)其中的進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，利用TBtools軟件繪制NAC家族基因表達(dá)熱圖，對(duì)在皮刺4個(gè)階段轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中高表達(dá)的進(jìn)行qRT-PCR分析（引物信息見表1）。

Stage I：柔軟幼嫩、尚未木質(zhì)化的皮刺；Stage II：一定程度木質(zhì)化、尖端開始向基部彎曲的皮刺；Stage III：木質(zhì)化較完全、形態(tài)基本成熟的皮刺；Stage IV：發(fā)育成熟、并初步開始衰老的皮刺

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 RcNAC家族成員鑒定及進(jìn)化分析

基于擬南芥基因組序列，從PlantTFDB數(shù)據(jù)庫中獲取138個(gè)擬南芥NAC家族成員氨基酸序列。根據(jù)‘月月粉’基因組序列文件以及基因結(jié)構(gòu)注釋文件，利用TBtools工具，對(duì)擬南芥和‘月月粉’基因組進(jìn)行雙向blast，并利用Pfam NAC家族結(jié)構(gòu)域索取號(hào)進(jìn)行HMM結(jié)構(gòu)域檢索。經(jīng)過保守結(jié)構(gòu)域分析，最終鑒定得到116個(gè)s，依據(jù)其在染色體上的位置，命名為—。為了獲取RcNAC家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，進(jìn)一步探討NAC家族的進(jìn)化歷史，利用MEGA X使用鄰接法對(duì)116個(gè)RcNACs與138個(gè)AtNACs、170個(gè)OsNACs氨基酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹（圖2）。依據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，將這424個(gè)NACs劃分為21個(gè)分支，依次命名為組A—U。AtNACs、OsNACs與RcNACs不均勻分布于進(jìn)化樹各分支中，在B分支中，只含有AtNACs，C分支中，只含有RcNACs，但兩個(gè)分支親緣關(guān)系較近，推測(cè)這兩支NAC在擬南芥和‘月月粉’中可能參與調(diào)控不同的生物學(xué)進(jìn)程。

圖2 ‘月月粉’（紅）、擬南芥（黑）、水稻（黑）NAC蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.2 RcNAC家族基本信息

各進(jìn)化樹分支包含NAC數(shù)量差距較大，為1—25個(gè)。對(duì)116個(gè)NAC家族基因蛋白序列進(jìn)行基本信息分析，其蛋白長度為69—713個(gè)氨基酸，等電點(diǎn)為4.43—9.78，分子質(zhì)量為7.87—79.99 kD。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，多數(shù)RcNACs定位于細(xì)胞核中，還有部分定位于葉綠體、過氧化物酶體、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、液泡以及細(xì)胞膜上（表2）。

表2 ‘月月粉’NAC家族成員基本信息

2.3 RcNAC家族染色體定位、共線性分析與基因結(jié)構(gòu)分析

‘月月粉’的116個(gè)s成員在7條染色體上不均勻分布（圖3），1號(hào)染色體上最多，有31個(gè)s；4號(hào)染色體上最少，僅有7個(gè)成員；未注釋到‘月月粉’7條染色體上，暫用Chr0表示。在116個(gè)s成員中，有6對(duì)串聯(lián)重復(fù)基因，其中有3對(duì)分布在1號(hào)染色體上，2對(duì)分布在6號(hào)染色體上，1對(duì)分布在3號(hào)染色體上。對(duì)擬南芥和‘月月粉’基因組進(jìn)行共線性分析（圖4），結(jié)果表明，54個(gè)s與36個(gè)s存在共線性關(guān)系，其中，與、存在共線性關(guān)系，其余都只與一個(gè)存在共線性關(guān)系。整體上看，擬南芥5號(hào)染色體和‘月月粉’2號(hào)染色體含有最多數(shù)量的共線性基因，共有7組。

對(duì)s進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析（圖5），同一亞群成員內(nèi)含子外顯子模式大致相同，s成員內(nèi)含子0—8個(gè)，所有的s成員都含有保守結(jié)構(gòu)域NAM，分布在其蛋白序列N端。

研究表明，擬南芥中的NAC家族成員保守結(jié)構(gòu)域中共包含A、B、C、D、E 5個(gè)亞域[5]。對(duì)鑒定出的RcNACs蛋白序列進(jìn)行保守基序預(yù)測(cè)，分析并保留10個(gè)motif。同組RcNACs成員的motif在分布類型和分布順序上基本相同。其中，motif 1（GFRFHPTDEELVSYY）與亞域A，motif 4（IIPEIDLYKYEPWDLPEKAKI）與亞域C，motif 6（EWYFFTPRDRK）以及motif3（YPNGTRTNRATGSGYWKA）與亞域B，motif 5（ISGSKKVIGMKKTLVFYKGRA）以及motif2（PKGQKTBWVMHEYRL）與亞域D，motif 7（DDWVLCRLFKK）與亞域E序列相似，有62個(gè)RcNACs包含這全部7個(gè)motif，且在RcNAC050中有重復(fù)的NAC完整基序。motif 9與motif 10分布在序列C端，猜測(cè)與RcNAC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能相關(guān)。

2.4 RcNAC啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用PlantCARE對(duì)s上游2 000 bp序列中的順式元件進(jìn)行分析預(yù)測(cè)（圖6），結(jié)果表明，除了啟動(dòng)子和增強(qiáng)子區(qū)域常見的順式作用元件外，s啟動(dòng)子上還具有不同數(shù)量的光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、干旱響應(yīng)元件、低溫應(yīng)答元件、分生組織調(diào)控元件，以及響應(yīng)不同植物激素（脫落酸、赤霉素、生長素、茉莉酸甲酯、水楊酸）等多種特異性順式作用元件。

圖3 RcNACs在染色體上的分布

圖4 RcNACs 與AtNACs共線性分析

圖5 ‘月月粉’NAC蛋白保守基序預(yù)測(cè)及保守結(jié)構(gòu)域分析

圖6 RcNACs啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.5 RcNAC家族成員組織及誘導(dǎo)表達(dá)分析

使用RcNACs氨基酸序列在月季轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫[28]中進(jìn)行比對(duì)，得到其中42個(gè)成員在‘月月粉’13個(gè)不同組織樣本中的轉(zhuǎn)錄組RPKM數(shù)據(jù)，繪制熱圖并進(jìn)行分析（圖7）。結(jié)果顯示，除外，其余40個(gè)成員均在一個(gè)或多個(gè)樣本中表達(dá)。

葉片經(jīng)脅迫處理（FTS、FTB）后，相比于對(duì)照組（FTN），有31個(gè)NAC成員的表達(dá)量有明顯變化，且14個(gè)成員在FTS中的表達(dá)量高于它們?cè)谄渌?2個(gè)組織中的表達(dá)量。其中，在FTS、FTB組織中表達(dá)量上調(diào)變化最為顯著，在感染灰霉病的植株葉片中表達(dá)量下降明顯。

Rosa-FTS：水脅迫的植株葉片；Rosa-FTB：感染灰霉病LR18的葉片；Rosa-FTN：幼葉和幼莖；Rosa-RAC：白色幼根；Rosa-NDB：休眠的腋芽即營養(yǎng)分生組織；Rosa-DBO：萌發(fā)的腋芽即營養(yǎng)分生組織；Rosa-IFL：花分生組織轉(zhuǎn)變時(shí)期的花芽；Rosa-IMO：花分生組織和早期花器官包括萼片，花瓣，雄蕊和心皮；Rosa-BFL：閉合的花；Rosa-OFT：開放的花；Rosa-SEN：衰老的花；Rosa-DET：雄蕊；Rosa-CYN：從授粉到色素積累早期的果實(shí)

在不同組織和器官中，不同成員的表達(dá)水平有明顯差異。在FTN，在NDB、SEN、CYN，在RAC、IFL、BFL、OFT、DET，在DBO、IMO組織中相對(duì)于其他NAC成員高表達(dá)，其中，在FTN中表達(dá)量較高，其他成員表達(dá)量略低；在花器官的不同發(fā)育階段組織（IFL、IMO、BFL、OFT、SEN）中，檢測(cè)到35個(gè)NAC成員在一至多個(gè)階段表達(dá)，、、、、、在花器官發(fā)育后期高表達(dá)，整體表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)，在花發(fā)育5個(gè)組織中持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)，這些成員可能參與調(diào)控花器官的生長發(fā)育進(jìn)程；、只在早期花器官中表達(dá)，、只在閉合的花中表達(dá)，猜測(cè)其在花器官發(fā)育特定階段行使功能。

2.6 皮刺相關(guān)RcNAC篩選及表達(dá)分析

根據(jù)月月粉不同發(fā)育階段皮刺轉(zhuǎn)錄組中表達(dá)量繪制熱圖，其中63個(gè)成員因其表達(dá)量過低未納入分析，基于剩余53個(gè)成員在皮刺中的表達(dá)量的TPM值繪制熱圖（圖8-a），對(duì)各表達(dá)模式進(jìn)行聚類分析，共聚為4組七7個(gè)亞組。其中，組只包含，其在Stage Ⅰ中高表達(dá)；組在各階段相對(duì)平穩(wěn)表達(dá)，-1成員在各階段表達(dá)量在50—110，-2成員在各階段表達(dá)量在0—50，其中有少數(shù)基因在Stage Ⅰ或Stage Ⅳ中表達(dá)量相對(duì)Stage Ⅱ和Ⅲ較高；組成員在Stage Ⅳ中高表達(dá)，-1成員表達(dá)量高于200.00，-2表達(dá)量約100.00；組成員在皮刺多個(gè)發(fā)育階段高表達(dá)。

從中篩選不同發(fā)育階段皮刺差異表達(dá)，共有26個(gè)。Stage I—Ⅱ有11個(gè)基因差異表達(dá)，10個(gè)在Stage Ⅱ下調(diào)，1個(gè)上調(diào)；Stage Ⅱ—Ⅲ中有5個(gè)基因差異表達(dá)，全為上調(diào)；Stage Ⅲ—IV中有18個(gè)基因差異表達(dá)，全為上調(diào)（圖9），此18個(gè)上調(diào)基因包含Stage Ⅱ—Ⅲ中的5個(gè)差異基因。分析各差異基因在不同皮刺發(fā)育階段表達(dá)量趨勢(shì)變化（圖8-b），、、、整體呈上升趨勢(shì)，在Stage Ⅲ—Ⅳ階段上調(diào)趨勢(shì)最為明顯，猜測(cè)這些基因與皮刺的硬化與木質(zhì)化程度可能息息相關(guān)；、、、、在4個(gè)階段表達(dá)較穩(wěn)定，在Stage Ⅰ和Stage Ⅳ略高，各階段表達(dá)量未超過5.00；在Stage Ⅰ—Ⅱ呈下調(diào)趨勢(shì)，可能與Stage Ⅰ中皮刺細(xì)胞的增殖有關(guān)，在Stage Ⅱ—Ⅳ呈上升趨勢(shì)，猜測(cè)其也參與了皮刺后期木質(zhì)化階段；、、、變化趨勢(shì)相同，在Stage Ⅰ高表達(dá)，Stage Ⅱ表達(dá)下降，之后穩(wěn)定表達(dá)，其中在Stage Ⅰ表達(dá)量為126.82，在Stage Ⅱ下降為23.34，其在皮刺前期細(xì)胞增殖過程中可能行使一定功能；其余12個(gè)差異表達(dá)基因在Stage Ⅰ—Ⅲ表達(dá)較為平穩(wěn)，在Stage Ⅲ—Ⅳ呈上調(diào)趨勢(shì)，推測(cè)這些基因可能參與調(diào)控皮刺木質(zhì)化及細(xì)胞程序性死亡。

2.7 皮刺轉(zhuǎn)錄組相關(guān)基因的qRT-PCR驗(yàn)證

在皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)隨機(jī)選取8個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，其中包含3個(gè)NAC家族基因，1個(gè)三酰甘油脂肪酶基因，1個(gè)谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶基因，以及WRKY、bHLH、Expansin家族基因各1個(gè)。結(jié)果顯示，各基因qRT-PCR結(jié)果與皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果相符，說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)較準(zhǔn)確可靠（圖10-a）。此外，選取皮刺轉(zhuǎn)錄組中NAC家族及-1組中7個(gè)s進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果如圖10-b所示，其中的qRT-PCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)差異較大，其余6個(gè)s qRT-PCR分析結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相符。

3 討論

3.1 NAC家族基因在不同物種間具有一定保守性

本研究基于s對(duì)月月粉基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，共鑒定出116個(gè)s，與蘋果（）中鑒定得到的180個(gè)[30]，沙梨（）中185個(gè)[31]，海濱木槿（Sieb. et Zucc）中182個(gè)[32]s相比，基因數(shù)目較少；與杉木（）中鑒定得到的45個(gè)[33]，毛竹（）中94個(gè)[34]s相比，基因數(shù)目略多；與桃中119個(gè)[19]s數(shù)量相近。由此可見，在不同的物種之間的數(shù)量有明顯差異，同科物種數(shù)量差異也較大，推測(cè)這與物種進(jìn)化和基因組復(fù)制相關(guān)。對(duì)RcNAC蛋白序列進(jìn)行分析，有62個(gè)RcNACs蛋白包含完整的5個(gè)亞域（A—E），說明NAC在不同物種中的序列保守性較高。

3.2 RcNAC參與調(diào)控‘月月粉’脅迫應(yīng)答及生長發(fā)育

有研究表明，在經(jīng)過鹽、干旱和脫落酸處理后，表達(dá)量顯著上調(diào)[35]；敲除后，降低了水稻對(duì)脫落酸的敏感性，但是提高了水稻對(duì)鹽脅迫的敏感性[36]；在干旱脅迫和復(fù)水后，部分基因的表達(dá)量出現(xiàn)變化[37]。本研究對(duì)‘月月粉’不同組織中s表達(dá)量進(jìn)行分析，在FTS組織中，14個(gè)s表達(dá)量上調(diào)，推測(cè)這些基因在‘月月粉’響應(yīng)水分脅迫過程中發(fā)揮作用，這與前期的研究結(jié)果一致。以往研究顯示，NAC轉(zhuǎn)錄因子在花器官發(fā)育及開花調(diào)控中發(fā)揮重要作用[38]，本研究中多個(gè)s在花器官的不同發(fā)育階段表達(dá)量發(fā)生顯著變化，推測(cè)這些基因在‘月月粉’花器官發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。另外，牛早柱等[39]研究發(fā)現(xiàn)，4個(gè)s在葡萄果實(shí)成熟過程中發(fā)揮重要作用；Martín-Pizarro等[40]研究表明，草莓NAC轉(zhuǎn)錄因子FaRIF是草莓果實(shí)成熟早期的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在‘月月粉’CYN組織中，和高表達(dá)，推測(cè)這些基因在‘月月粉’果實(shí)成熟過程中行使一定功能。

圖8 ‘月月粉’NAC基因在不同發(fā)育階段皮刺中的表達(dá)量熱圖

圖9 ‘月月粉’不同發(fā)育階段皮刺差異表達(dá)NAC數(shù)量

3.3 RcNAC參與調(diào)控‘月月粉’皮刺發(fā)育

在月季[41]和野薔薇[3]中，皮刺的發(fā)育伴隨著木質(zhì)素、花青素、類黃酮等物質(zhì)的積累。‘月月粉’在Stage Ⅱ—Ⅲ中木質(zhì)素不斷積累至完全，結(jié)合進(jìn)化樹與4個(gè)階段皮刺轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在‘月月粉’皮刺轉(zhuǎn)錄組Stage Ⅰ—Ⅲ階段高表達(dá)，qRT-PCR分析其在Stage Ⅰ和Stage Ⅳ相對(duì)表達(dá)量較高。與（）的進(jìn)化距離較近，通過負(fù)調(diào)節(jié)次生細(xì)胞壁纖維合成和細(xì)胞程序性死亡來影響管狀分子和木質(zhì)部發(fā)育。過表達(dá)導(dǎo)致木質(zhì)部導(dǎo)管缺失和管狀分子標(biāo)記基因表達(dá)很少或不表達(dá)[42]，推測(cè)在‘月月粉’皮刺發(fā)育過程中調(diào)節(jié)木質(zhì)化的進(jìn)程，在皮刺發(fā)育初期是否也發(fā)揮一定作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。與旁系同源的在皮刺轉(zhuǎn)錄組中未檢測(cè)到表達(dá)，其是否在皮刺發(fā)育中發(fā)揮作用有待進(jìn)一步研究。在Stage Ⅳ中表達(dá)上調(diào)，與（）為同源基因，在擬南芥次生細(xì)胞壁合成中發(fā)揮作用[43]，且在毛果楊中的同源基因通過調(diào)節(jié)木質(zhì)素、纖維素合成的關(guān)鍵基因來調(diào)控次生壁組織合成[44]，是否在皮刺細(xì)胞的次生壁合成過程中發(fā)揮作用需要進(jìn)一步驗(yàn)證。在Stage Ⅰ—Ⅳ中整體表達(dá)呈上升趨勢(shì)，研究表明，其同源基因（）在花瓣和雄蕊發(fā)育后期表達(dá)，在葉片衰老期間上調(diào)[45]，且調(diào)控?cái)M南芥角果衰老[46]，這與‘月月粉’皮刺發(fā)育階段和SEN組織中的表達(dá)模式相同，猜測(cè)與皮刺衰老進(jìn)程相關(guān)。在Stage Ⅰ高表達(dá)，為中極少數(shù)在皮刺發(fā)育前期高表達(dá)的基因，qRT-PCR分析進(jìn)一步證實(shí)其在Stage Ⅰ相對(duì)表達(dá)量較高，其是否在皮刺發(fā)育早期行使重要功能？、、和在皮刺發(fā)育各個(gè)階段的表達(dá)量均較高，其相似的表達(dá)模式是否暗示其功能的冗余，這些問題還有待深入研究。

4 結(jié)論

本研究在‘月月粉’全基因組中鑒定出116個(gè)s，不均勻分布在7條染色體上，均具有NAM保守結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進(jìn)化樹將RcNACs分為21類。多數(shù)s在遭受水分脅迫或灰霉病感染的葉片組織中表達(dá)量發(fā)生顯著變化；在皮刺發(fā)育進(jìn)程中，絕大多數(shù)成員中后期表達(dá)顯著，這些基因可能主要參與皮刺木質(zhì)化及細(xì)胞程序性死亡等相關(guān)進(jìn)程。、、和在皮刺發(fā)育多個(gè)階段高表達(dá)，在皮刺StageⅠ中高表達(dá)，可作為皮刺形態(tài)發(fā)生和發(fā)育相關(guān)重點(diǎn)候選基因。

a：轉(zhuǎn)錄組隨機(jī)挑選基因的qRT-PCR分析；b：NAC家族δ及γ-1組中7個(gè)RcNAC的qRT-PCR分析

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Genome-Wide Identification of NAC Family and Screening of Its Members Related to Prickle Development inOld Blush

YOU YuWan, ZHANG Yu, SUN JiaYi, ZHANG Wei

College of Horticulture & Forestry Sciences, Huazhong Agricultural University/Key Laboratory of Horticultural Plant Biology, Ministry of Education/Key Laboratory of Urban Agriculture in Central China, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Wuhan 430070

This study was designed to identify thegene family inOld Blush and to analyze the sequences characteristics and expression pattern ofs to reveal the biological functions ofs, which also provided an important foundation to explore the role ofs in prickles.The BLATP and HMMER search were conducted to identify NAC proteins inOld Blush using the sequences of NAC proteins of. Physical and chemical properties, subcellular location, structure and phylogenetic relationship of each gene were further analyzed. Based on the released transcriptome data, the expression characteristics ofs in different tissues and organs under different stress conditions were analyzed. What’s more, the technology of RNA-seq was used to screengenes that might be related to the prickle development.In this study, 116genes fromOld Blush genome were identified and characterized. Theses genes encoded proteins containing 69 to 713 amino acids, with the theoretical isoelectric points ranging from 4.43 to 9.54 and the molecular weight ranging from 7.87 to 79.99 kD. The prediction of subcellular localization showed that 81s were located in the nucleus. Moreover,s were unevenly distributed on 7 chromosomes. According to phylogenetic relationships, AtNACs, OsNACs and RcNACs were clustered into 21 groups. These 116s were differentially expressed in various tissues and organs, and the expression levels of 31 members changed in response to abiotic and biotic stresses. Furthermore, in the RNA-seq data of prickles, 53s were detected, among which 26 members were differentially expressed genes.This study demonstrated thats were involved in the regulation of plant development and stress responses. Some members might be involved in the processes of prickle cell proliferation, secondary cell wall biosynthesis, and programmed cell death, which could be selected as candidate genes related with prickle development for further study.

‘Old Blush’; NAC transcription factor; transcriptome sequencing; prickle development

2022-03-04；

2022-04-24

國家自然科學(xué)基金（32072617）

由玉婉，E-mail：1797435616@qq.com。通信作者張蔚，E-mail：zhangw@mail.hzau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）