陳文文，楊夢瑞，王敏，劉權(quán)輝，周劍，王彤彤

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081）

氯吡脲又稱1-(2-氯-4-吡啶)-3-苯基脲，是一種新型高效植物生長調(diào)節(jié)劑，其細(xì)胞分裂活性是芐氨基嘌呤的10倍、4-吡啶脲的100倍，其主要作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂、擴大細(xì)胞體積，促進(jìn)器官形成和蛋白質(zhì)合成，在提高坐果率、增加產(chǎn)量方面有非常顯著的效果[1-4]。作為一種植物生長調(diào)節(jié)劑，氯吡脲在國內(nèi)外的應(yīng)用越來越廣泛，在我國屬于登記限量使用的農(nóng)藥品種，目前已在黃瓜、獼猴桃、西瓜、甜瓜、葡萄、臍橙和枇杷等果蔬上登記使用[5]。我國對不同水果蔬菜中的氯吡脲規(guī)定了最大殘留限量，但是仍有不少果蔬種植戶違規(guī)過量使用氯吡脲，使得果蔬中氯吡脲含量超標(biāo)，對人體健康造成潛在風(fēng)險[6-7]。農(nóng)產(chǎn)品中氯吡脲檢測方法報道較多，但是保證測量數(shù)據(jù)可靠、可比、可溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)較少，尤其作為量值溯源基礎(chǔ)的國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)尚未見報道。研制氯吡脲純度一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，對于保證檢測數(shù)據(jù)的量值溯源與準(zhǔn)確可靠非常有必要。

純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有準(zhǔn)確性、均勻性、穩(wěn)定性等主要特征，純度測量過程也是給標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的過程[8]，因此可以通過連續(xù)的溯源鏈，使測量結(jié)果直接與國際基本單位(SI 單位)聯(lián)系而具有可比性[9]。目前，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值方法主要有質(zhì)量平衡法、滴定法、示差量熱掃描法、定量核磁法等[10-11]。質(zhì)量平衡法也叫雜質(zhì)扣除法，是一種間接定值方法[12]。利用高效液相色譜儀、卡爾費休滴定儀、頂空氣相色譜儀、電感耦合等離子體質(zhì)譜儀等多種儀器進(jìn)行測定，可消除水分、揮發(fā)性有機雜質(zhì)以及無機雜質(zhì)對主成分含量測定結(jié)果的影響[13]，提高對主成分純度定值的準(zhǔn)確度[14]。楊嘉偉等[15]采用質(zhì)量平衡法對異辛烷純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)開展純度定值研究工作，純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.86%。黃彥捷等[16]采用質(zhì)量平衡法對堿性橙Ⅱ進(jìn)行了純度分析，結(jié)果表明，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))認(rèn)證值為99.2%，已被認(rèn)定為國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。近年來，核磁定量技術(shù)也被廣泛應(yīng)用于在純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值方面，作為一種直接定值方法，在分析混合物時，可以采用其各個組分的各自指定基團(tuán)上質(zhì)子產(chǎn)生的吸收峰強度進(jìn)行相對比較，然后求得相對含量，該方法快捷、簡便，可利用有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)，將測量結(jié)果直接溯源至SI 單位[14]。李雪嬌等[17]采用核磁共振氫譜建立了一種徐長卿中丹皮酚含量的快速、準(zhǔn)確、精密的檢測方法。

筆者選擇高純度純品原料，采用質(zhì)量平衡法與定量核磁技術(shù)兩種不同原理的方法對氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值，考察了氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性、穩(wěn)定性，并評估了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的不確定度。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

微量水分測定儀：DL32 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

分析天平：XS105 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氣相色譜儀：7890 A 型，配氫火焰離子化檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Agilent 7500a型，美國安捷倫科技有限公司。

核磁共振儀：Bruker AVANCE Ⅲ型，德國布魯克公司。

電子天平：UMX2 型，瑞士梅特勒-托利多公司。

氯吡脲：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為大于100.3%(非水滴定法)，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

肌酐標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：美國標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號為NIST914a，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(99.7±0.3)%，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院。

氘代乙酸：質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，北京百靈威科技有限公司。

氘代二甲基亞砜：質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.8%，北京百靈威科技有限公司。

其它有機溶劑：色譜純，德國默克公司。

1.2 實驗步驟

1.2.1 原材料選擇

選擇高純品氯吡脲作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物，經(jīng)過紅外光譜法、高分辨質(zhì)譜法以及核磁定性分析后分裝于4 mL 棕色玻璃瓶中，每瓶為100 mg，共200 個包裝單元，作為純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品，置于-20 ℃冷凍避光保存。

1.2.2 定值

參照“國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范”，通過前期文獻(xiàn)調(diào)研及預(yù)實驗結(jié)果，采用高效液相色譜質(zhì)量平衡法和定量核磁法兩種不同原理的方法對氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值。為保證測量結(jié)果的溯源性與準(zhǔn)確性，使用的儀器設(shè)備經(jīng)過計量檢定或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)。

(1)質(zhì)量平衡法[9]。高效液相色譜儀：島津LC-20A 系統(tǒng)；色譜柱：Agilent Plus C18柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)；流動相：水-乙腈(體積比為55∶45)，流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL；分析波長：260 nm。利用色譜峰面積歸一化法對氯吡脲進(jìn)行定量。

卡爾費休法測定水分含量：利用水分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)儀器后，稱取10 mg 樣品，待滴定結(jié)束，記錄水分含量。模擬加樣過程、質(zhì)量及時間，不加樣進(jìn)行測定，計算空氣中的水分空白值，扣除空白后得到最終結(jié)果。

(2)核磁共振定量法。采用氫譜核磁共振技術(shù)，選擇肌酐作內(nèi)標(biāo)物，氘代二甲基亞砜作為定值的氘代溶劑。參照文獻(xiàn)[18]計算氯吡脲的純度。

1.2.3 均勻性檢驗

隨機抽取15個包裝單元，每個單元取3個子樣，稱樣量為3 mg，配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的甲醇溶液，采用質(zhì)量平衡法優(yōu)化的高效液相色譜方法對主成分純度進(jìn)行均勻性檢驗。測定結(jié)果扣除水分含量，揮發(fā)性雜質(zhì)以及無機元素的含量，采用單因素方差分析法和F檢驗進(jìn)行分析。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

長期穩(wěn)定性：在分裝儲藏后的0、1、3、6、12個月抽樣測定。每次抽取2個單元，采用質(zhì)量平衡法，每個單元取樣3次配制成1 000 mg/L的溶液。以每次測得的液相色譜峰面積歸一化結(jié)果扣除隨時間測定的水分含量的平均值(n=6)，以及定值實驗時測定的揮發(fā)性雜質(zhì)和無機元素含量平均值作為長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

短期穩(wěn)定性：模擬運輸過程溫度變化，將樣品置于20 ℃和60 ℃恒溫箱中保存，分別在第0、1、3、5、7天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測。測定方法與長期穩(wěn)定性監(jiān)測相同。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料核驗結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值

根據(jù)JJF 1343 等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求，采用質(zhì)量平衡法與定量核磁法兩種不同原理的方法對氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品進(jìn)行純度核驗，對主成分與有機雜質(zhì)含量進(jìn)行高效液相色譜法分析。

采用高效液相色譜法-二極管陣列(DAD)檢測器，對待分析的氯吡脲樣品進(jìn)行了光譜掃描，以確定其可能的最大吸收波長?；谖墨I(xiàn)報道，采用水和乙腈作為流動相，并比較了不同色譜柱、不同流動相比例對于雜質(zhì)及其主成分分離效果的影響。結(jié)果表明，Agilent Plus C18色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)雜質(zhì)與主成分的基線分離。在此基礎(chǔ)上，改變水-乙腈體積比為55∶45，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)均能洗脫出來，且主成分以及雜質(zhì)之間達(dá)到較好的分離效果，滿足分析要求。圖1為該色譜條件下氯吡脲的高效液相色譜圖。

圖1 氯吡脲高效液相色譜圖

采用卡爾費休水分滴定法測定了氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含水量約為0.153%。同時，分別采用頂空氣相色譜法和ICP-MS法分析了有機揮發(fā)性雜質(zhì)和無機非揮發(fā)性雜質(zhì)，結(jié)果均小于0.1%。根據(jù)質(zhì)量平衡法，氯吡脲質(zhì)量平衡法純度定值結(jié)果為99.44%，見表1。

表1 氯吡脲質(zhì)量分?jǐn)?shù)的質(zhì)量平衡法定值結(jié)果 %

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求，同一家實驗室應(yīng)采用不少于兩種的不同原理定值方法定值。首先考察了氘代溶劑，氘代溶劑的選擇要求氯吡脲和內(nèi)標(biāo)同時在該氘代溶劑中具有良好的溶解度，且相互之間不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。通過溶解度測試實驗發(fā)現(xiàn)，氘代二甲基亞砜能夠同時溶解氯吡脲和常見的內(nèi)標(biāo)物肌酐、苯甲酸，因此選擇氘代二甲基亞砜作為定值的氘代溶劑。其次，重點考察了兩種內(nèi)標(biāo)。針對定量核磁的內(nèi)標(biāo)要求：一是有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，能夠進(jìn)行量值傳遞；二是不與被測物發(fā)生反應(yīng)；三是用于定量的核磁峰相互之前不重疊。圖2為苯甲酸、肌酐、肌酐與氯吡脲混合樣品的1H-NMR 譜圖。由圖2 可以看出，苯甲酸的氫峰與氯吡脲氫峰重合，不適用于定量，而肌酐化學(xué)位移3.67×10-6處氫峰與氯吡脲7.05×10-6處氫峰無相互干擾，峰形尖銳，滿足定量要求。

圖21H-NMR譜圖

對隨機抽取的7瓶氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行平行測定，結(jié)果見表2。由定量核磁法測定的氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.51%。

表2 氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)核磁測量結(jié)果 %

對兩種方法所得兩組結(jié)果采用F檢驗進(jìn)行等精度檢驗，得：

經(jīng)查臨界值F0.95(6，6)=4.28，1/F0.95(6，6)＜F＜F0.95(6，6)，表明兩組數(shù)據(jù)等精度。

對兩組結(jié)果采用t檢驗進(jìn)行結(jié)果一致性檢驗：

式中：P——氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果，%；

PMB——氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)質(zhì)量平衡法定值結(jié)果，%；

PqNMR——氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量核磁法測量結(jié)果，%。

綜上所述，氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值結(jié)果為99.5%。

2.2 均勻性檢驗

均勻性檢驗采用高效液相色譜峰面積歸一化法，按照整個封裝過程的前、中、后時間階段，從已分裝的氯吡脲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中隨機抽取15 個包裝單位進(jìn)行均勻性檢，每個單元配制三個子樣，稱樣質(zhì)量為3 mg，分別配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L 的甲醇溶液，對隨機抽取的樣品編號為1#～15#。圖3 為氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果。采用單因素方差分析法(ANOVA)和F檢驗對測量結(jié)果進(jìn)行均勻性檢驗，由數(shù)據(jù)計算得：組間方差s12=0.000 355 8，組內(nèi)方差s22=0.000 186 1，F(xiàn)=s12s12=1.91，查表得臨界值F0.05(14，30)=2.04，F(xiàn)＜F0.05(14，30)，表明該標(biāo)準(zhǔn)樣品均勻性良好，符合技術(shù)規(guī)范要求。

圖3 氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性考察

按照J(rèn)JF 1343—2012《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》穩(wěn)定性評估的方案可以為經(jīng)典穩(wěn)定性評估和同步穩(wěn)定性評估，所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中長期穩(wěn)定性評估采用的是經(jīng)典穩(wěn)定性評估方案，短期穩(wěn)定性評估采用的是同步穩(wěn)定性評估方案。根據(jù)JJG 1006—1994《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》中的要求，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性考察按照先密后疏的原則，從2020年3 月到2021 年3 月，分別在第0、1、3、6、12 個月進(jìn)行了穩(wěn)定性考察。采用重量-容量法配制溶液，每次抽取2 個單元，以每次測得的液相色譜峰面積歸一化結(jié)果扣除隨時間測定的水分含量的平均值(n=6)，以及定值實驗時測定的揮發(fā)性雜質(zhì)和無機元素含量平均值作為長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。圖4為氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果。以監(jiān)測時間和測定結(jié)果擬合直線，采用趨勢分析法[17]進(jìn)行穩(wěn)定性檢驗，說明12個月內(nèi)氯吡脲純度及其包裝單元內(nèi)的水分含量沒有明顯的變化趨勢，穩(wěn)定性檢驗合格。

圖4 氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)長期穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果

將樣品置于20 ℃和60 ℃恒溫箱中(模擬運輸條件)保存，分別在第0、1、3、5、7 天進(jìn)行穩(wěn)定性監(jiān)測，測定方法與長期穩(wěn)定性監(jiān)測相同。以每次測得的液相色譜面積歸一化結(jié)果扣除定值實驗時測定的水分、揮發(fā)性雜質(zhì)和無機元素含量平均值作為長期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析，采用趨勢分析對監(jiān)測數(shù)據(jù)進(jìn)行考察。圖5為氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果。由圖5可見，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在60 ℃及以下的運輸條件下7天內(nèi)可保證純度量值穩(wěn)定。

圖5 氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)短期穩(wěn)定性監(jiān)測結(jié)果

綜上所述，氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)12個月長期穩(wěn)定性良好，雖然60 ℃模擬運輸溫度、7 天的運輸時間條件下特性量值通過了穩(wěn)定性檢驗，但是從數(shù)據(jù)分析，量值存在波動，因此該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)應(yīng)采取干冰或冰袋運輸，運輸溫度控制在20 ℃以下。

2.4 不確定度評定

氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度由三部分組成：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引入的不確定度、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引入的不確定度(短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性)以及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值過程引入的不確定度(質(zhì)量平衡法和定量核磁法)?；谇捌谘芯繄蟮赖牟淮_定度評估與計算方法[19]，系統(tǒng)分析與評估了氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制過程中的不確定度，評估結(jié)果見表3。氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度值(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.5%，擴展不確定度為0.4%(k=2)。

表3 氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定結(jié)果

3 結(jié)語

研究結(jié)果表明，兩種不同原理定值方法準(zhǔn)確可靠，結(jié)果一致性良好；氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))定值結(jié)果為99.5%，擴展不確定度為0.4% (k=2)；量值均勻性良好、穩(wěn)定性可靠，符合國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范的要求，并獲得國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)編號GBW 09290。氯吡脲純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的成功研制，為相關(guān)基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制建立起完整的SI單位計量溯源鏈，保證了氯吡脲相關(guān)檢測結(jié)果的計量溯源性。