王天宇，李繼東，張志誠，郭亞男

(1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2. 中國動物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032；3. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002)

牛支原體是柔膜體綱、支原體目、支原體科、支原體屬、革蘭氏染色呈陽性的原核生物，是一種能引起牛肺炎、乳房炎和關(guān)節(jié)炎等疾病的病原微生物[1]。牛支原體最早于1961年在美國發(fā)現(xiàn)，隨后在全球傳播、流行。在我國2008年辛九慶等[2]首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離出牛支原體；2017年在新西蘭奶牛群中暴發(fā)牛支原體病，造成多達(dá)15.8萬頭牛被撲殺，截止目前，挪威是唯一沒有被牛支原體感染的養(yǎng)牛國家。牛支原體常與多殺性巴氏桿菌和溶血曼海姆氏菌等混合感染，給養(yǎng)牛業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。牛支原體和無乳支原體、絲狀支原體絲狀亞種等的病原結(jié)構(gòu)以及其致病的臨床癥狀很相似，難以鑒別診斷及預(yù)防控制[3]。牛支原體基因組具有的可變脂蛋白家族基因及眾多的可插入序列導(dǎo)致牛支原體極易突變，能在不同的地理環(huán)境中獨(dú)立進(jìn)化，在國際上存在多種基因分型的菌株，表現(xiàn)出高度的多樣性[4]。

1 病原學(xué)與流行病學(xué)

1.1 病原學(xué)

牛支原體與其他支原體相似，具有多種形態(tài)，在顯微鏡下呈球形、橢圓形和棒形等；細(xì)胞膜由三層膜構(gòu)成，內(nèi)、外層由電子密度高的蛋白質(zhì)與糖類構(gòu)成，中間層主要由電子密度低的脂質(zhì)構(gòu)成，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有雙鏈DNA和核糖體，沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器[1]。牛支原體是能在無活細(xì)胞培養(yǎng)物中存活的最小微生物，其基因組大小僅為大腸桿菌基因組的1/5，能夠通過0.45 μm微孔濾膜，在加壓情況下能通過0.22 μm的微孔濾膜[1]。牛支原體的基因組大小為9.48～10.39 kb，C+G含量較低，僅占27.8%～32.9%。以牛支原體國際參考菌株P(guān)G45為例，其基因組包含826個(gè)開放閱讀框(ORF)，編碼密度為89%，能編碼眾多基因，包括6個(gè)rRNA、 34個(gè)tRNA基因和96個(gè)假定的脂蛋白基因(包括13個(gè)vsp基因簇)等。染色體上還含有54個(gè)插入序列(IS)和2個(gè)整合共軛元件(ICE)即ICEB-1和ICEB-2，大小分別為2.33 kb和3.74 kb，ICEB-1與無乳支原體PG2的ICEA非常相似，所以，牛支原體和無乳支原體被認(rèn)為是由同一個(gè)祖先進(jìn)化而來的[5]。牛支原體兼性厭氧，能在無活細(xì)胞的培養(yǎng)基上生長，適宜在5%～10%的CO2環(huán)境下生存，因?yàn)榛蚪M較小，缺乏完整的酶系統(tǒng)，代謝活性受到限制，因此不能分解葡萄糖和精氨酸，而是利用有機(jī)酸、乳酸和丙酮酸為其生長能源，生長的菌液通常透亮不渾濁，低倍鏡下菌落呈典型的煎蛋外觀[1, 6]。牛支原體對環(huán)境的抵抗力較強(qiáng)，4 ℃的海綿或牛奶中能存活2個(gè)月，-20 ℃下能存活半年，-70 ℃下能存活一年以上；對高溫敏感，65 ℃熱處理2 min或70 ℃熱處理1 min活性喪失。

1.2 流行病學(xué)

1961年，Hale等從美國一例嚴(yán)重的牛乳腺炎病例中首次分離出牛支原體，由于血清學(xué)、生化特性與無乳支原體相似，最初命名為無乳支原體牛變種，被認(rèn)為是造成牛乳腺炎的病原體之一。這種支原體自發(fā)現(xiàn)以來，在世界范圍內(nèi)廣泛傳播。20世紀(jì)60年代在亞洲的以色列和歐洲的西班牙發(fā)現(xiàn)了該支原體，隨后在20世紀(jì)70年代擴(kuò)展到大洋洲的澳大利亞以及法國等歐洲國家[3]。1975年，Thomas等在英國率先從患有肺炎癥狀的3～5月齡的荷斯坦小牛中分離出無乳支原體牛變種，動物接種試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該支原體可以導(dǎo)致牛發(fā)生肺炎，1976年該支原體被正式命名為牛支原體。隨后，由牛支原體引起的肺炎與乳腺炎相繼在世界各國暴發(fā)并報(bào)道，包括丹麥(1981)、日本(1982)、瑞士(1983)、摩洛哥(1985)、韓國(1989)、巴西(1989)、愛爾蘭(1994)、智利(1997)、南非(2005)、捷克共和國(2007)等。我國于2008年由辛九慶等[2]首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到牛支原體，現(xiàn)除海南省未發(fā)現(xiàn)牛支原體肺炎疫情外，各地相繼出現(xiàn)牛支原體感染病例[7-8]。目前，牛支原體呈全球傳播，之前沒有牛支原體感染的芬蘭(2012)和新西蘭(2017)也確診暴發(fā)了牛支原體疫病[9-10]。

1.3 流行菌株

1961年美國首次分離出的牛支原體菌株P(guān)G45已于2011年完成了全基因組測序，成為牛支原體國際參考株[5]。Rosales等[11]對全球的多個(gè)牛支原體分離株進(jìn)行VNTR分析，發(fā)現(xiàn)存在兩個(gè)主要種群即A和B組，各組包含的分離株與其地理起源高度相關(guān)。應(yīng)用MLST分析發(fā)現(xiàn)，源自歐洲的牛支原體分離株主要為CC1組，以色列、澳大利亞和中國的牛支原體分離株主要為CC2組。在CC1組中鑒定出兩個(gè)常見祖先菌株序列型(ST2和ST19型)，ST2型是代表性牛支原體中最常見的ST型，ST19型是僅來自歐洲大陸(西班牙、德國、法國和立陶宛)的代表性分離株，后者被證明與美國的PG45菌株具有極大的相似性，這一發(fā)現(xiàn)支持了牛支原體PG45與歐洲分離株之間存在共同祖先的假說，可能與過去兩大洲之間的活牛及其產(chǎn)品貿(mào)易有直接關(guān)系。CC2組包括了所有中國分離株以及大多數(shù)來自以色列和澳大利亞的分離株ST10、ST33和ST34型，該組分離株在地理起源方面表現(xiàn)出高度的多樣性，與大多數(shù)歐洲分離株分開，支持了牛支原體分離株在地理上獨(dú)立進(jìn)化的理論。Yair等[12]和Menghwar等[13]研究發(fā)現(xiàn)，中國、以色列和澳大利亞的流行分離株主要為ST10型，提出了中國與以色列的分離株可能來源于澳大利亞的結(jié)論，這與中國和以色列從澳大利亞大量進(jìn)口牛只有關(guān)。

1.4 傳播途徑

牛支原體能在牛群中廣泛傳播，包括水牛、肉牛、奶牛、野牛在內(nèi)的所有種類，以及所有年齡段的牛都易感[14]。牛支原體病在牛群中暴發(fā)主要是由輸入牛只與運(yùn)輸工具攜帶病原體傳播導(dǎo)致的，患病牛和病原攜帶牛是主要的傳染源，被感染的?？赡艹蔀闊o癥狀的攜帶者，持續(xù)排出病原體長達(dá)數(shù)年之久[7]。氣溶膠傳播是最主要的傳播方式，牛支原體通過呼吸道排出，能在氣溶膠內(nèi)存活數(shù)月甚至長達(dá)幾年之久，牛之間的直接接觸、排出的分泌液、唾液和糞便都能攜帶病原造成健康牛的感染。牛支原體也可以發(fā)生垂直傳播，懷孕母牛能通過胎盤傳播給胎兒，還可以通過初乳傳播給新生犢牛，在公牛的精液中也檢測到了牛支原體的存在[15-16]。牛支原體具有黏附性，寄生于黏膜、纖毛等部位的細(xì)胞，可隨部分脫落的細(xì)胞排出體外，這個(gè)排泄過程呈周期性，一般在感染后一周脫落，最快能在24 h后脫落，氣候變化、過度擁擠或運(yùn)輸?shù)葢?yīng)激因素可能會加速這一過程使牛更容易受到感染，并引起疾病暴發(fā)。除了直接傳播，牛支原體還能通過環(huán)境因素進(jìn)行傳播，能通過運(yùn)輸車輛、飼料、圍墻欄桿、飼喂用具和墊料等傳播。有研究表明，牛支原體能在4 ℃的牛奶中存活2個(gè)月，在肥料中存活37 d，棉花上存活18 d，稻草上存活13 d，木材和不銹鋼上存活1～2 d[3]。除牛之外的一些其他動物也是牛支原體的攜帶者，如綿羊、山羊、豬、雞和鹿等都是牛支原體的儲存宿主，牛支原體跨物種感染其他動物后又反過來感染牛，造成疾病的循環(huán)往復(fù)[17-20]。牛支原體通常是不感染人的，但由于長期接觸感染牛的牛奶、糞便，農(nóng)場員工體內(nèi)檢測到了牛支原體[21]。

2 診斷方法

由于牛支原體能與多種病原混合感染，因此對于牛支原體病的鑒別診斷顯得尤為重要。目前主要的實(shí)驗(yàn)室診斷方法有：病原的分離鑒定、分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法。其中分子生物學(xué)方法主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)、DNA微陣列技術(shù)、遺傳鑒定；免疫學(xué)方法主要包括免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。

2.1 分離鑒定

由于支原體結(jié)構(gòu)簡單，因此無法合成氨基酸，并且無法完全或部分合成脂肪酸。為了滿足這種高營養(yǎng)需求，支原體培養(yǎng)基通常富含牛心浸出液、血清、酵母提取物和蛋白胨等，培養(yǎng)基pH值為7.3～7.8[1]。接種后的培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下，孵育7～10 d，光學(xué)顯微鏡下可見牛支原體菌落出現(xiàn)“煎蛋”樣形態(tài)。牛支原體革蘭氏染色呈陽性，因?yàn)闆]有細(xì)胞壁，革蘭氏染色困難，吖啶橙染色效果更好，染色后菌體呈亮紅色或橘紅色[22]。雖然通過分離培養(yǎng)法鑒定牛支原體相對簡單且成本低廉，但存在局限性。如在采集樣品時(shí)動物必須有活菌排出，這和牛支原體的排泄模式有關(guān)。在慢性和亞臨床支原體乳腺炎病例中，常有牛支原體呈間歇性排出的情況，其間隔時(shí)間甚至能長達(dá)56 d，這可能導(dǎo)致單個(gè)樣本的診斷失敗，因此建議應(yīng)至少采集3份樣品并間隔3～4 d，收集后進(jìn)行培養(yǎng)鑒定[23]。牛支原體的儲存對環(huán)境要求較高，采集的病料需冷藏并在24 h內(nèi)送往實(shí)驗(yàn)室，也可以凍存運(yùn)輸，但凍存會導(dǎo)致活菌數(shù)量降低1或2個(gè)數(shù)量級。此外，牛支原體的培養(yǎng)經(jīng)常受到其他柔膜體綱病原的污染，分離難度大、分離周期長，不適用于牛支原體的快速檢測[24]。

2.2 分子生物學(xué)方法

為了克服常規(guī)分離培養(yǎng)的不足，目前已經(jīng)開發(fā)了多種基于核酸的分子檢測方法，這些方法具有檢測速度快、靈敏性和特異性高等優(yōu)點(diǎn)。由于基于核酸的分子檢測方法是物種特異性的，所以能夠區(qū)分不同種類的支原體以及牛支原體的不同基因型。常用牛支原體核酸診斷技術(shù)比較見表1。

表1 牛支原體核酸診斷技術(shù)

2.2.1 PCR技術(shù)

應(yīng)用PCR技術(shù)檢測來自各種樣品類型的支原體具有更高的效率、特異性和敏感性。早期主要利用16S rRNA基因做靶標(biāo)，但由于牛支原體與無乳支原體的16S rRNA序列一致性高達(dá)99%，所以經(jīng)常發(fā)生交叉擴(kuò)增的現(xiàn)象[25]。為了區(qū)分不同病原體，設(shè)計(jì)了針對16S～23S rRNA間隔區(qū)的PCR方法，可以區(qū)分支原體與無膽甾原體；使用幾個(gè)引物組設(shè)計(jì)的多重PCR，能夠同時(shí)鑒別感染牛的幾種不同支原體，在牛奶樣品中的檢測下限低至1×101CFU/mL[26-27]。目前，實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)也逐漸應(yīng)用于牛支原體的檢測。由于與無乳支原體16S rRNA高度的同源性，人們選取了特異性更好的DNA修復(fù)基因uvrC基因、ATP結(jié)合蛋白o(hù)ppD/F基因和p81基因等作為靶基因進(jìn)行特異性擴(kuò)增，Clothier等[28]針對uvrC基因設(shè)計(jì)開發(fā)了實(shí)時(shí)熒光PCR檢測方法，檢測下限低至2.4×102CFU/mL，靈敏度和特異性良好。

2.2.2 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

Zhao等[29]針對牛支原體uvrC基因設(shè)計(jì)開發(fā)了重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)與側(cè)流層析試紙分析(RPA- LFD)相結(jié)合的檢測方法，能在30 min內(nèi)檢測到牛支原體，檢測下限為20個(gè)拷貝，靈敏度和特異性分別為99%和95.6%。Bai等[30]針對牛支原體uvrC基因設(shè)計(jì)開發(fā)了LAMP法，與普通PCR方法相比較，在純培養(yǎng)物中測定的靈敏度比PCR高10倍，檢測下限為34個(gè)拷貝，該方法的靈敏度和特異性分別為100%和74%，靈敏度高，特異性較準(zhǔn)確，適宜于在生產(chǎn)中檢測牛支原體。Yumiko等[31]針對oppD/F基因區(qū)域設(shè)計(jì)6對引物，改進(jìn)后的LAMP法，其靈敏度、特異性分別為97.2%和90.9%(kappa系數(shù)為0.823 1)。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳文學(xué)團(tuán)隊(duì)研發(fā)的牛支原體環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒于2020年獲得了國家新獸藥注冊證書((2020)新獸藥證字35號)。

2.2.3 DNA微陣列技術(shù)

Schnee等[32]根據(jù)基因組高度保守區(qū)16S～23S rRNA間隔區(qū)和可變區(qū)交替分布的23S rRNA序列，對38個(gè)支原體、3個(gè)無膽甾原體和3個(gè)解脲脲原體設(shè)計(jì)了70個(gè)寡核苷酸探針；為了擴(kuò)展微陣列的區(qū)分能力，將tuf基因視為另一個(gè)靶標(biāo)，設(shè)計(jì)了86個(gè)滿足基本選擇標(biāo)準(zhǔn)的寡核苷酸探針，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和生物素化后，在陣列上探針與DNA的雜交可特異性鑒定目標(biāo)病原，一次最多可以檢測出37種支原體。微陣列測定法的主要優(yōu)點(diǎn)包括操作簡便、快速和信息量高，分析靈敏度與實(shí)時(shí)熒光PCR相當(dāng)，并且無需培養(yǎng)即可檢查野外樣品。

2.2.4 遺傳鑒定

由于牛支原體基因組相對于病毒較大，全基因測序比較困難，人們使用脈沖場凝膠電泳(PFGE)、可變串聯(lián)重復(fù)序列(VNTR)、多基因座可變串聯(lián)重復(fù)分析(MLVA)和多基因座序列分型(MLST)等對支原體基因組的幾個(gè)管家基因進(jìn)行獨(dú)特的序列分析，用于牛支原體的遺傳鑒定與基因分型。最近提出了3種MLST方案用于研究牛支原體的種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化和傳播：Manso-Silvan等[33]開發(fā)的MLST方案基于4個(gè)管家基因(fusA、gyrB、lepA和rpoB)，分辨力為0.833；Register等[34]開發(fā)的MLST方案基于7個(gè)管家基因(adh-1、gltX、gpsA、gyrB、pta-2、tdk、tkt)，分辨力為0.923；Rosales等[11]開發(fā)改進(jìn)的MLST方案基于7個(gè)管家基因(dnaA、metS、recA、tufA、atpA、rpoD和tkt)，分辨力為0.91(95%置信區(qū)間為0.88～0.93)，后兩種改進(jìn)方案均優(yōu)于第一種方案。

2.3 免疫學(xué)方法

不同于牛支原體的分離與PCR檢測，免疫學(xué)檢測方法無需在牛支原體的排泄期采集樣本，因?yàn)閯游餀C(jī)體感染牛支原體所產(chǎn)生的抗體可以保持幾個(gè)月之久。在病料采集與檢測難度方面，免疫學(xué)方法具有極大優(yōu)勢，通過優(yōu)化，免疫學(xué)方法在檢測牛支原體方面具有良好的靈敏性與特異性。

2.3.1 免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)

Hermeye等[36]對膿腫的細(xì)支氣管或終末呼吸道、肺臟和腎小管上皮細(xì)胞等組織進(jìn)行了染色檢測，在顯微鏡下組織切片可見棕黃色顆粒，呈彌漫性出現(xiàn)于細(xì)胞周圍，即為牛支原體陽性。

2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)

目前有多種類型的ELISA用于檢測牛支原體，包括間接ELISA、競爭ELISA和阻斷ELISA等。利用VSP重組蛋白或膜脂蛋白作為包被抗原以檢測血清中的IgG，所建立的間接ELISA方法是檢測牛血漿、血清和牛奶等樣本的首選方法，應(yīng)用最為廣泛。

間接ELISA檢測方法依賴于牛對牛支原體的免疫反應(yīng)及其產(chǎn)生的抗體。研究顯示，動物機(jī)體產(chǎn)生的牛支原體抗體可以持續(xù)數(shù)月，且不受牛支原體間歇性排泄的影響，這表明間接ELISA適用于牛支原體抗體的檢測，但幾例實(shí)驗(yàn)性感染表明，血清IgG抗體轉(zhuǎn)化需要2～3周，在該時(shí)間段內(nèi)進(jìn)行檢測可能顯示陰性結(jié)果[37]。間接ELISA方法還適用于對牛奶樣品的檢測，可應(yīng)用于大罐奶的檢測以大規(guī)模分析牛群中牛支原體的感染情況，進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，但單個(gè)乳樣本檢測結(jié)果往往并不理想[38]。這可能是因?yàn)镮gG抗體是在血液中產(chǎn)生的，當(dāng)轉(zhuǎn)移到牛奶中時(shí)導(dǎo)致濃度較低的緣故，并且抗體在牛奶中存在的時(shí)間沒有在血液中持久[39]。CABI的入侵物種綱要對ELISA檢測患病牛的鼻拭子、肺、牛奶、關(guān)節(jié)液和滑膜、精液和生殖器分泌物等樣本與血清樣本的檢測效果進(jìn)行了比較分析，發(fā)現(xiàn)在血清中都能檢測到抗體，而其他樣品只有相關(guān)部位發(fā)生炎癥時(shí)才能檢測出來。由此可知，血清樣本最適用于做牛支原體的間接ELISA檢測樣本，但需要注意在血清抗體轉(zhuǎn)化后進(jìn)行檢測診斷，或增加樣本檢測量以提高準(zhǔn)確度。

目前已有開發(fā)的牛支原體抗體ELISA檢測商品化試劑盒，但陽性檢出率差，靈敏度不足[34,39]。最近Wawegama等[40]建立了一種基于MilA蛋白重組片段的間接ELISA，檢測實(shí)驗(yàn)性感染犢牛，最佳臨界值估計(jì)為68.6抗體單位(AU)；對于成年牛群，最佳臨界值估計(jì)為58.7 AU；在自然條件下，育肥牛的最佳臨界值估計(jì)為105 AU。在此臨界值時(shí)，診斷靈敏度為94.3%，95%概率區(qū)間(PI為89.9%～99.6%)，特異性為94.4%， PI為90.3%～99.6%)。與目前的商品化試劑盒相比，Wawegama等[41]開發(fā)的間接ELISA方法診斷靈敏性和特異性更佳，更適用于牛支原體的血清學(xué)診斷與流行病學(xué)調(diào)查。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所辛九慶團(tuán)隊(duì)研發(fā)的牛支原體ELISA抗體檢測試劑盒于2017年獲得了國家新獸藥注冊證書((2017)新獸藥證字48號)。

3 常用診斷技術(shù)比較

不同診斷技術(shù)有各自的優(yōu)點(diǎn)和不足，對牛支原體常用診斷技術(shù)比較的結(jié)果見表2[35]。

表2 牛支原體常用診斷技術(shù)比較[35]

4 小結(jié)

我國是養(yǎng)牛大國，牛支原體病嚴(yán)重危害我國養(yǎng)牛業(yè)，掌握其流行病學(xué)特征以及診斷技術(shù)是控制和預(yù)防該病的關(guān)鍵。同時(shí)我國也是牛及其產(chǎn)品的進(jìn)口大國，目前國際上存在多種基因型牛支原體，基因組測序和基因分型鑒定有利于對牛支原體進(jìn)行分析溯源，有助于降低牛支原體通過國際貿(mào)易傳入的風(fēng)險(xiǎn)。不同的診斷方法具有一定的優(yōu)缺點(diǎn)，使用者需針對不同使用環(huán)境、不同的診斷需求，選擇最合適的方法。目前還需要將新材料、新技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)結(jié)合起來，研究快速和高通量檢測技術(shù)，以提高疾病的診斷能力。