劉 瀅，趙汝茹，王越振，田 波，徐秀泉

(江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

野菊花為菊科植物野菊 (ChrysanthemumindicumL.)的干燥頭狀花序，有清熱解毒、抗菌消炎等功效，是具有較高藥食兩用價(jià)值的常見(jiàn)中草藥[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明野菊花具有抗細(xì)胞凋亡、抗炎、清除氧自由基、抗菌等多種生物活性[2-3]。植物化學(xué)研究表明，黃酮類化合物是其發(fā)揮抗炎、抗腫瘤、抗菌等多種藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[4-5]。野菊花廣泛分布在我國(guó)大部分地區(qū)，野生資源豐富, 但對(duì)其黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)利用并不充分，而提取工藝的優(yōu)選是提高該類活性成分開(kāi)發(fā)利用潛力的首要環(huán)節(jié)。微波輔助、超聲輔助提取等先進(jìn)提取技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于野菊花總黃酮的提取工藝優(yōu)化[6-7]，更為方便，快捷的提取技術(shù)還需要繼續(xù)深入的開(kāi)發(fā)和探究。閃式提取是近年來(lái)迅速發(fā)展起來(lái)的一種綠色、高效的提取技術(shù)，該技術(shù)基于高速剪切作用和分子滲濾原理，能夠在數(shù)十秒甚至數(shù)秒內(nèi)完成溶質(zhì)傳遞的過(guò)程，具有提取時(shí)間短、效率高、能耗低等顯著特點(diǎn)，已成功應(yīng)用于多種類型植物活性成分的提取[8-9]。本文利用閃式提取技術(shù)來(lái)提取野菊花中的總黃酮類成分，結(jié)合響應(yīng)面分析法中的中心組合設(shè)計(jì)原理Central composite design (CCD)對(duì)提取過(guò)程中的乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、料液比等顯著影響提取得率的因素進(jìn)行優(yōu)化，以期建立簡(jiǎn)便、易行、高效的野菊花總黃酮提取工藝，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用野菊花這一中草藥提供依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材 料

野菊花購(gòu)自江蘇鎮(zhèn)江九泰醫(yī)藥有限公司，樣品粉碎過(guò)40目篩后置冰箱中保存?zhèn)溆?。蘆丁對(duì)照品 (批號(hào)：10080-201609，純度≥98%)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀 器

UV-2600紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司；ZHBE-50T閃式提取器，河南智晶生物科技發(fā)展有限公司；DHG-9145鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；BS 110 S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇科興儀器有限公司；Allegra X-30低溫冷凍離心機(jī)，貝克曼庫(kù)爾特 (美國(guó)) 有限公司；DK-8D恒溫水浴鍋,南京科爾儀器有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH絡(luò)合比色法建立總黃酮的含量測(cè)定方法[10]，具體操作步驟如下：精密稱取蘆丁對(duì)照品 10 mg置于50 mL量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇溶解并稀釋至刻度，獲得200 μg·mL-1蘆丁對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別量取上述儲(chǔ)備液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL置于10 mL量瓶中，依次加入0.3 mL 5%NaNO2溶液，0.3 mL 10%AlNO3溶液， 4 mL 4%NaOH溶液，每次加入間隔6 min，最后用體積分?jǐn)?shù)70% 的乙醇定容至刻度，振蕩搖勻，充分反應(yīng)15 min后于 510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，求得線性方程為：A= 0.014C+0.004 (r=0.9997)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘆丁在10.0 ～ 80.0 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2 野菊花總黃酮的閃式提取及含量測(cè)定

精確稱取粉碎過(guò)篩的野菊花粉末1.0g，加入一定體積的不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液室溫下浸泡 5 min，隨后采用閃式提取器提取規(guī)定時(shí)間，提取結(jié)束后，在5000 r·min-1條件下離心 10 min，取上清液，將殘?jiān)貜?fù)上述過(guò)程提取若干次。合并收集上清液，用70%乙醇定容至250 mL。最后，取該溶液 1.0 mL，按照“2.1”項(xiàng)下所述方法測(cè)定其在510nm 處的吸光度值并計(jì)算總黃酮得率。

3 結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

精密稱取粉碎過(guò)篩的野菊花粉末1.0 g 5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為30、40、50、60、70% 的乙醇溶液30 mL提取120 s，計(jì)算不同體積分?jǐn)?shù)乙醇條件下野菊花總黃酮提取得率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1(a)，由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，野菊花總黃酮提取得率在以體積分?jǐn)?shù)60%乙醇作為提取溶劑時(shí)達(dá)到最大值為4.24±0.10%；隨后再提高乙醇的體積分?jǐn)?shù)，總黃酮得率有較為明顯的下降趨勢(shì)，說(shuō)明野菊花中主要黃酮類化合物在體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇中溶解度較大，因此選擇體積分?jǐn)?shù)為60%乙醇溶液作為較佳的提取溶劑。

3.1.2 料液比的選擇

精密稱取粉碎過(guò)篩的野菊花粉末1.0 g 5份，分別加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液15、20、25、30、35 mL提取120 s，計(jì)算不同料液比下各提取液中總黃酮含量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1(b)。由結(jié)果可知，當(dāng)料液比小于30 mL·g-1，隨料液比的提高，總黃酮提取得率逐漸升高說(shuō)明較高的溶劑體積能夠?qū)⒁熬栈ㄖ械目傸S酮充分的提取出來(lái)；當(dāng)料液比超過(guò)30 mL·g-1，總黃酮的提取得率反而有所下降，這主要是提取體積的增加導(dǎo)致了閃式提取過(guò)程中機(jī)械剪切作用降低的緣故[11]。綜上所述，在料液比30 mL·g-1時(shí)獲得了最高的總黃酮得率，因此選擇 30 mL·g-1作為最佳的料液比。

3.1.3 提取時(shí)間的選擇

精密稱取粉碎過(guò)篩的野菊花粉末1.0 g 5份，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液30 mL分別提取30、60、90、120、150 s，比較提取時(shí)間下對(duì)野菊花總黃酮提取得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1(c)。由圖1(c)可知，在提取時(shí)間120 s時(shí)總黃酮得率達(dá)到了最大值；然后再延長(zhǎng)提取時(shí)間總黃酮得率有下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樘崛r(shí)間過(guò)長(zhǎng)，加速了非黃酮類化合物溶解、釋放的緣故。因此選擇提取時(shí)間為120 s作為最佳提取時(shí)間。

3.1.4 提取次數(shù)選擇

圖1 不同因素對(duì)野菊花總黃酮提取得率影響Fig.1 Effect of different conditions on the extraction yield of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

在體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇溶液，料液比為30 mL·g-1，提取時(shí)間為120 s條件下連續(xù)提取4次，分析提取次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖 1(d)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，提取次數(shù)對(duì)野菊花總黃酮提取得率幾乎沒(méi)有影響，通過(guò)一次提取就幾乎將野菊花中所有黃酮類化合物完全提取出來(lái)，因此在提取過(guò)程中固定提取次數(shù)為1次即可。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時(shí)間三個(gè)因素為自變量，野菊花總黃酮的提取得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平共17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，其中12個(gè)為析因?qū)嶒?yàn)，5個(gè)為中心實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方案與結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 野菊花總黃酮閃式提取工藝響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Central composite design (CCD) experimental design of factors with experimental and predicted valuesover flash extraction of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

3.2.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.5軟件對(duì)表1中的數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)，料液比(X2)，提取時(shí)間(X3)與野菊花總黃酮提取得率之間的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=4.44+0.14 X1+0.21 X2+0.36 X3-0.042 X1X2-0.065 X1X3+ 0.077X2X3-0.17 X12-0.16 X22-0.23 X32

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 閃式提取野菊花總黃酮得率方差分析結(jié)果Table 2 ANOVA of flash extraction of total flavonoids from Chrysanthemum indicum

由表2回歸方差顯著性檢驗(yàn)結(jié)果，獲得影響閃式提取野菊花總黃酮得率高低的因素依次為提取時(shí)間(X3) >料液比(X2) >乙醇體積分?jǐn)?shù) (X1)；二次項(xiàng)中三因素對(duì)總黃酮提取率的曲面效應(yīng)影響高度顯著(P<0.01)；比較各因子間交互作用均不顯著(P>0.05)。在本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，回歸方程顯著性檢測(cè)p=0.0006 <0.001，極顯著，模型的確定系數(shù)為0.9568，說(shuō)明該模型能解釋95.68%響應(yīng)值的變化，即該模型預(yù)測(cè)結(jié)果讓與實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果擬合良好，試驗(yàn)誤差小，應(yīng)用響應(yīng)曲面法優(yōu)化方法優(yōu)化野菊花總黃酮的閃式提取工藝是可行的。

3.2.3 響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程，采用Origin8.5軟件繪制出各因素交互作用的響應(yīng)面等高線圖和響應(yīng)面圖，結(jié)果見(jiàn)圖2。等高線形狀可以反映因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度以及因素之間交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩提取因素間的交互作用顯著，圓形則表示二者之間交互作用不顯著[12]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，各因素間的交互作用等高線形狀均接近于圓形，說(shuō)明因素之間的交互影響并不顯著，這與方差分析結(jié)果相符。通過(guò)響應(yīng)曲面圖的斜率不同因素對(duì)野菊花總黃酮提取得率的影響。由響應(yīng)圖可以看出，野菊花總黃酮得率均隨著各個(gè)因素的變化先增加后降低，說(shuō)明該因素設(shè)定的范圍合理，能夠在該范圍內(nèi)尋求到最大值。在三個(gè)因素中，提取時(shí)間的曲線最為陡峭，乙醇體積分?jǐn)?shù)曲線最為平滑，說(shuō)明提取時(shí)間對(duì)總黃酮得率的影響最為顯著，乙醇體積分?jǐn)?shù)提取得率的影響最弱，這同方差分析所得的結(jié)論也保持一致。

圖2 因素間相互關(guān)系對(duì)野菊花總黃酮提取得率影響Fig.2 Response surface plot for interactions between three independent variables (extraction parameters) on extraction yields of total flavonoids from Chrysanthemum indicum: ethanol concentration and liquid to material ratio

3.2.4 最佳工藝條件的確定

表3 不同提取方法下野菊花總黃酮提取得率比較Table 3 Comparison of extraction yields of total flavonoids over Chrysanthemumindicum obtained from different extraction methods

為確定各因素的最佳取值，利用Design-Expert軟件分析后，根據(jù)回歸模型存在的最大值點(diǎn)計(jì)算并結(jié)合實(shí)際操作條件，獲得閃式提取野菊花總黃酮最佳工藝條件為：采用體積分?jǐn)?shù)61%乙醇，在料液比為34 mL·g-1條件下，閃式提取147 s，此時(shí)野菊花總黃酮提取得率的最大估計(jì)值為Y=4.698%。在該條件下進(jìn)行操作，并同傳統(tǒng)的加熱回流提取進(jìn)行比較，比較結(jié)果見(jiàn)表3。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，在最佳閃式提取條件下，野菊花總黃酮得率為4.72%±0.06%，與預(yù)測(cè)值4.698%非常接近，說(shuō)明優(yōu)化的工藝非常穩(wěn)定，采用閃式提取技術(shù)提取野菊花總黃酮切實(shí)可行；同傳統(tǒng)的加熱回流比較，閃式提取技術(shù)提取野菊花總黃酮效率高、時(shí)間短、能耗低，值得推薦使用。

4 結(jié) 論

將單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法用于野菊花總黃酮的閃式提取工藝優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件：采用體積分?jǐn)?shù)61%的乙醇，在料液比為34 mL·g-1條件下，閃式提取147 s，此時(shí)野菊花總黃酮得率為4.72%±0.06%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)值相符。同傳統(tǒng)的回流提取相比較，閃式提取方法綠色、環(huán)保，提取效率高、能源消耗小，將該實(shí)驗(yàn)方法應(yīng)用于野菊花總黃酮的提取為該藥材的進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)奠定了基礎(chǔ)。