非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已經(jīng)成為全世界最常見的慢性肝病，全球患病率高達(dá)25%

。據(jù)統(tǒng)計，中國在內(nèi)的部分亞洲國家NAFLD患病率已高于世界平均水平

。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，中國的NAFLD患病率日趨上升且呈年輕化發(fā)展趨勢。該疾病因高發(fā)病率、高患病率、低齡化發(fā)病趨勢、慢性進(jìn)展過程、伴發(fā)心腦血管等疾病、誘發(fā)肝硬化及肝癌等特點(diǎn)，突顯其在臨床及科研中的重要性。目前臨床上尚無針對NAFLD的特效治療藥物。中醫(yī)中藥基于辨證論治對NAFLD 防治具有一定優(yōu)勢，其機(jī)理值得深入研究。

附子理中湯(FZLZD)原方出自宋代陳言所著的《三因極一病證方論》，譚茂卿等

研究發(fā)現(xiàn)FZLZD可以有效降低臨床脂肪肝患者的血脂，改善肝臟酶學(xué)指標(biāo)，緩解臨床癥狀，可調(diào)節(jié)人體代謝及改變體質(zhì)。已有動物實驗及體外細(xì)胞實驗證實FZLZD可有效促進(jìn)NAFLD小鼠肝細(xì)胞的增殖，抑制其凋亡

。FZLZD療效受到臨床實踐和基礎(chǔ)研究的肯定，但其作用機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(NP)融合了藥理學(xué)理論和系統(tǒng)生物信息，將藥物化合物成分及其作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)與疾病基因網(wǎng)絡(luò)相結(jié)合，廣泛運(yùn)用于解釋多種藥物成分通過多途徑作用于多個靶點(diǎn)的作用關(guān)系

。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的基本思維及方法，構(gòu)建FZLZD藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，探索FZLZD改善NAFLD的潛在作用機(jī)制，為FZLZD治療NAFLD提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 復(fù)方藥物活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫(http:// tcmspw. com/ tcmspsearch. php)獲取FZLZD組成藥物附子、甘草、人參、白術(shù)及干姜的所有化合物成分，設(shè)定口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18為過濾條件，篩選出FZLZD組成藥物潛在活性成分。檢索TCMSP平臺獲取藥物活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白全名，并借助Uniprot平臺(http//www.uniprot.org/)將藥物活性成分作用的靶點(diǎn)蛋白全名轉(zhuǎn)換為基因名。

1.2 疾病基因靶點(diǎn)的獲取 以“Non-alcoholic fatty liver disease”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(http://www.omim.org/)，獲取NAFLD疾病靶點(diǎn)基因，與藥物活性成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行匹配，即為FZLZD治療NAFLD的潛在靶點(diǎn)基因。

(3)0～10 cm土層，0.05～0.25 mm和<0.0 5 mm粒徑微團(tuán)聚體有機(jī)碳對總有機(jī)碳有顯著作用；10～20 cm土層，在1～2 mm、0.05～0.25 mm粒徑，團(tuán)聚體有機(jī)碳對總有機(jī)碳有顯著作用；20～40 cm和40～60 cm土層有機(jī)碳對團(tuán)聚體有機(jī)碳影響不明顯。這與植物根系分布深度及耕作施肥深度有關(guān)，同時也說明了紅壤有機(jī)碳的增加通過形成或進(jìn)入小團(tuán)聚體而實現(xiàn)。

2.5 KEGG通路分析 通過對共有基因的KEGG富集分析，共獲得80條通路滿足基因富集顯著性

<0.01，根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對信號通路的解釋及NAFLD發(fā)病機(jī)制，最終篩選出與NAFLD相關(guān)的通路共25條，根據(jù)通路富集程度及顯著性選取排名靠前的20個條目繪制高級氣泡圖(見圖4)。富集程度較高的信號通路包括：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAG通路、細(xì)胞凋亡、NAFLD、TNF信號通路、胰島素抵抗、IL-17信號通路及NF-κB信號通路，提示這些通路可能為FZLZD治療NAFLD的重要通路。其中糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路富集程度和顯著性均為最優(yōu)，利用R 4.0軟件取該通路圖進(jìn)一步分析，并用顏色標(biāo)注本研究中靶點(diǎn)基因、該基因編碼的酶及該類酶參與的反應(yīng)，如圖5所示,糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE通路可能通過MAPK、PI3K-AKT信號通路等相關(guān)途徑調(diào)控炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，以達(dá)到治療NAFLD的目的。

2.[t?xui](這會兒)+[tala][f](說)[t?ie](這些)干嗎呢？(現(xiàn)在還要說這些干什么呢？)

2012年黨的十八大以來，以習(xí)近平同志為核心的黨中央堅定不移地堅持高舉改革開放旗幟、推進(jìn)全面深化改革、擴(kuò)大對外開放的戰(zhàn)略決策部署，展現(xiàn)了黨中央將改革開放進(jìn)行到底的政治魄力和堅定決心。

2 結(jié)果

2.2 復(fù)方藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)分析 根據(jù)藥物成分、靶點(diǎn)與疾病之間的關(guān)系及屬性，利用Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，圖中共涉及125個節(jié)點(diǎn)，402條邊。分析網(wǎng)絡(luò)圖可知，同一個靶點(diǎn)基因會同時受多種藥物成分的影響，不同靶點(diǎn)也可受同一種藥物成分干預(yù)。對藥物成分及靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治鲲@示，所有藥物成分的度值(Degree)均大于1，平均度值為5.16，山柰酚、槲皮素、柚皮素、β-谷固醇、異鼠李素、甘草查爾酮A度值均大于度值均數(shù)；靶點(diǎn)中介中心性(Betweenness Centrality)平均值為0.0033，山柰酚、槲皮素、柚皮素、β-谷固醇、異鼠李素、甘草查爾酮A、苜蓿素7個節(jié)點(diǎn)大于該均值。其中，山柰酚和皮素度值和中介中心性均明顯高于其他成分，這兩種藥物成分與多個靶點(diǎn)存在聯(lián)系，提示該成分可作用于多個靶點(diǎn)，可能為FZLZD發(fā)揮藥理效應(yīng)的核心成分。

2.1 復(fù)方潛在活性成分及靶點(diǎn)的獲取 通過檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫，共獲得142種藥物潛在活性成分，其中21種來自附子，87種來自甘草，22種來自人參，7種來自白術(shù)，5種來自干姜；利用Uniprot平臺將藥物活性成分所對應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白全名規(guī)范為基因名，并刪除重復(fù)項后共獲99個靶點(diǎn)基因，與1 442個疾病靶點(diǎn)取交集處理，最終獲取FZLZD治療NAFLD潛在靶點(diǎn)43個。43個共有靶點(diǎn)對應(yīng)的藥物成分共80種，詳細(xì)信息見表1。

隨著肥胖癥流行、糖尿病患病率的上升及人口老齡化，NAFLD的患病率以及晚期肝病患者的比例將繼續(xù)增加，其影響將反映在更高的肝細(xì)胞癌(HCC)發(fā)生率、肝臟相關(guān)疾病死亡率和肝移植的需求上，這將給醫(yī)療衛(wèi)生系統(tǒng)帶來沉重的負(fù)擔(dān)

。NAFLD是一種病因病機(jī)極其復(fù)雜的系統(tǒng)性代謝疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)針對NAFLD的治療，主要著眼于代謝危險因素及并發(fā)癥的治療，主要應(yīng)用藥物包括維生素E、乙酰半胱氨酸等抗氧化劑、二甲雙胍等胰島素增敏劑、他汀類調(diào)脂藥、谷胱甘肽等降酶護(hù)肝藥。這類藥物作用靶點(diǎn)各不相同，因療效不確定，或具有一定毒副作用，均未被證實是治療NAFLD單一直接有效藥物。中醫(yī)藥在治療NAFLD方面進(jìn)行了大量的探索性研究，諸多單味藥、中成藥及中藥復(fù)方的療效和安全性均得到證實。Meta分析發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥治療NAFLD在改善血液生化指標(biāo)及肝臟影像學(xué)表現(xiàn)方面優(yōu)于西藥對照組

。有學(xué)者認(rèn)為，藥物聯(lián)合治療NAFLD必然是未來研究的新思路，針對不同靶點(diǎn)及多層次靶向聯(lián)合治療是未來干預(yù)NASH的發(fā)展方向

。中藥復(fù)方基于多種活性成分的物質(zhì)基礎(chǔ)，作用于多個靶點(diǎn)基因發(fā)揮其療效，具有獨(dú)特的臨床和科研價值。

2.4 GO富集分析 GO富集分析結(jié)果中顯著性

<0.01的條目包括735個BP、43種MF、30類CC。根據(jù)其富集程度與顯著性，每個模塊篩選出前10個條目繪制柱狀圖(圖3)。參與BP主要有無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路、對酸性化學(xué)物質(zhì)的反應(yīng)、對類固醇激素的反應(yīng)、對凋亡信號通路的調(diào)節(jié)等；MF中蛋白激酶結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性、RNA聚合酶II特異性、蛋白質(zhì)均聚活性、脂質(zhì)結(jié)合等排位靠前；參與CC的主要有膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、受體復(fù)合體、黏附連接等。

石英占礦物總量的56.1%，主要呈他形、半自形粒狀以及粒狀集合體分布(圖1a、圖1c)，粒度約為0.1～8 mm。黃鐵礦、黃銅礦、閃鋅礦和磁黃鐵礦等硫化物礦物常分布于石英粒間以及多個石英顆粒組成的粒間孔洞中；黃銅礦、閃鋅礦和方鉛礦等硫化物礦物集合體常發(fā)育于石英裂隙和粒間孔洞中(圖1a、圖1b)，由于受到應(yīng)力作用的影響，粒徑較大的石英常具波狀消光及應(yīng)力裂紋。

1.4 共有靶點(diǎn)GO及KEGG富集分析 將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape(https://metascape.org/gp/index. html#/main/step1)數(shù)據(jù)庫分別進(jìn)行基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析。利用R 4.0軟件可視化處理，對KEGG結(jié)果中重要通路進(jìn)行分析。GO富集分析從分子功能(MF)、細(xì)胞組分(CC)和生物過程(BP)3個模塊進(jìn)一步分析各靶點(diǎn)的生物學(xué)功能富集情況。借助微生信(http// www. bioiformations. com. cn/)在線平臺繪制GO柱狀圖和KEGG氣泡圖。

1.3 構(gòu)建FZLZD藥物成分-作用靶點(diǎn)-疾病及蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 將FZLZD和NAFLD共有靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/ cgi/ input. pl)，檢索結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，隨后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖(PPI)，同時進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩苑治?，以預(yù)測FZLZD組成藥物作用于NAFLD的潛在關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。同時運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建FZLZD藥物活性成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

3 討論

2.3 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析 String 數(shù)據(jù)庫聯(lián)合Cytoscape 3.7.2 軟件，根據(jù)拓?fù)浞治鰠?shù)度值設(shè)定節(jié)點(diǎn)大小，連線粗細(xì)表示相鄰節(jié)點(diǎn)相關(guān)性強(qiáng)弱，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)(圖2)，PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有43個節(jié)點(diǎn)，258條邊，其中度值最大的幾個靶點(diǎn)分別為:IL6(31)、VEGFA(26)、CASP3(23)、MAPK8(23)、ESR1(22)、PPARG(21)，此6個節(jié)點(diǎn)中介中心性也高于其他節(jié)點(diǎn)，提示這些靶點(diǎn)在FZLZD對NAFLD的治療中具有重要意義，可能為FZLZD干預(yù)NAFLD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

本研究從FZLZD中篩選出的主要活性成分中山柰酚、槲皮素在PPI網(wǎng)絡(luò)中連接靶點(diǎn)個數(shù)最多，可能為FZLZD治療NAFLD的主要活性成分。山柰酚對肥胖、脂代謝、碳水化合物代謝和氧化應(yīng)激等都有明顯的作用，在對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡實驗發(fā)現(xiàn)，山柰酚通過調(diào)控p-JNK和Endo G的表達(dá)水平以拮抗細(xì)胞凋亡

。研究證實槲皮素對NAFLD有一定的治療作用,其作用機(jī)制主要包括抗氧化應(yīng)激作用、調(diào)控促炎因子相關(guān)基因、減少脂質(zhì)的合成以及改善胰島素抵抗等

。二者均通過多種途徑起到對NAFLD調(diào)節(jié)的重要作用。在GO富集分析中，靶點(diǎn)主要參與無機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路等生物學(xué)過程，蛋白質(zhì)均二聚活性、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活劑活性等分子功能，膜筏、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔等細(xì)胞組分,涉及調(diào)控轉(zhuǎn)錄、炎癥、細(xì)胞凋亡、代謝、黏附連接等多種生物功能。這些靶點(diǎn)蛋白并非單獨(dú)產(chǎn)生作用，而是相互協(xié)調(diào)，共同發(fā)揮作用。

研究表明，靶點(diǎn)拓?fù)浞治鯠egree值越高，代表該類靶點(diǎn)具有更好的連通性及對整個網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控

。 本研究中Degree值排名靠前的幾個靶點(diǎn)IL-6、VEGFA、MAPK、CASP3、ESR1、PPARG靶點(diǎn)可作為后期研究的候選關(guān)鍵靶點(diǎn)。KEGG分析結(jié)果與NAFLD相關(guān)的通路多達(dá)25條。通路與靶點(diǎn)結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)，IL-6分別富集在AGE-RAG、NAFLD信號通路上，該靶點(diǎn)已被證實是參與NAFL向NASH和肝硬化轉(zhuǎn)變進(jìn)程中最重要的促炎癥因子之一

。從NASH進(jìn)展到非酒精性肝纖維化進(jìn)程中一個重要特點(diǎn)是白細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的粘附明顯增多。MAPK8富集于細(xì)胞凋亡、NAFLD信號通路，該靶點(diǎn)可通過酶促磷酸化級聯(lián)反應(yīng)參與到細(xì)胞分化、發(fā)育等多階段的調(diào)控過程中

。CASP3富集于AGE-RAG、NAFLD信號通路,作為抗凋亡信號分子，多種細(xì)胞凋亡路徑均依賴該位點(diǎn)，通過下調(diào)因子水平、激活通路中下游啟動型Caspase引發(fā)Caspase級聯(lián)反應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

。

閱讀一篇優(yōu)秀的詩文就像在與作者進(jìn)行對話，進(jìn)行思想的交流；美的文章能給我們美的享受，給我們心靈的震動，豐富我們的內(nèi)心世界，豐富我們的語言。而學(xué)生的語言積累豐富了，飽滿了，其表達(dá)也是富有情感的。

富集程度和顯著性最優(yōu)的通路為糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAG信號通路。NAFLD與糖尿病互為危險因素。一項研究發(fā)現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAG通路相互作用可促進(jìn)NAFLD進(jìn)展為脂肪性肝炎、肝纖維化

。另一研究證實，丹酚酸A可通過抑制糖尿病并發(fā)癥中AGE-RAG通路，預(yù)防NAFLD并發(fā)的糖尿病性腎病

。從KEGG數(shù)據(jù)庫中通路圖分析可知，該通路可能通過MAPK、PI3K-AKT等分支通路改善炎癥、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與NAFLD調(diào)控，具體效應(yīng)有待進(jìn)一步研究。重要靶點(diǎn)CASP3、AMPK8以及PPARG均富集于AMPK信號通路，通過調(diào)控胰島素敏感性和脂質(zhì)代謝的核受體發(fā)揮改善NAFLD的作用。已有動物實驗表明，F(xiàn)ZLZD能通過激活 AMPK 通路進(jìn)而抑制SREBP-1c，F(xiàn)ASN的表達(dá)以及抑制NF-κBp65通路進(jìn)而降低炎癥因子以達(dá)到改善 NAFLD 大鼠肝臟病理變化、降低血脂水平、改善肝功能的目的

。此外，VEGFA富集于PI3K-Akt信號通路，通過局灶性增加白細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞粘附參與NAFLD的進(jìn)展

。本研究中還包括胰島素抵抗、胰島素信號通路、內(nèi)分泌抵抗等相關(guān)路徑，這些通路均與胰島素抵抗相關(guān)，這一結(jié)論與胰島素抵抗被認(rèn)為是NAFLD發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵機(jī)制的研究結(jié)果相符

。

綜上所述，本研究中FZLZD可能通過80種藥物活性成分作用于43個靶點(diǎn)基因、參與808個生物學(xué)功能及25條信號通路發(fā)揮其治療NAFLD的藥理作用。明確了FZLZD治療NAFLD的分子基礎(chǔ)，初步探究其作用機(jī)制，為中醫(yī)辨證論治和方藥配伍等傳統(tǒng)理論提供科學(xué)依據(jù)。

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