非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的一種臨床病理綜合征，主要病理特征是彌散性肝細胞大泡性脂肪變性和脂肪貯積，疾病譜有非酒精性單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)和非酒精性脂肪性肝硬化

，可發(fā)展至肝衰竭或肝癌。目前NAFLD的發(fā)病機制并不明確，其中“二次打擊學說”和近年興起的“多次打擊學說”能夠在一定程度上解釋NAFLD的疾病進展過程，涉及胰島素抵抗、氧化應激、脂質過氧化、炎癥等反應過程

。目前現代醫(yī)學的治療手段主要是改善胰島素抵抗和保肝抗炎，常用藥物有熊去氧膽酸、維生素E、還原型谷胱甘肽等，中藥治療通常以保肝抗炎為主

。

苦黃顆粒由苦參、大黃、茵陳、柴胡、大青葉5味中藥組成，源于醫(yī)圣張仲景名方“茵陳蒿湯”，是治療濕熱黃疸的名方，具有清熱利濕，疏肝退黃的作用，臨床使用過程中發(fā)現，苦黃顆粒除了在退黃、降酶、改善患者癥狀、體征方面有良好的療效外，還能夠調節(jié)機體免疫功能、改善肝損傷和炎癥反應

。筆者基于網絡學理學和動物實驗，探討苦黃顆粒對NAFLD的作用潛力與機制。

1 材料與方法

1.1 苦黃顆粒的活性化合物篩選 利用TCMSP 數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索苦黃顆粒組方中柴胡、大黃、苦參、茵陳和大青葉的主要化學成分，根據藥物的吸收、分布、代謝、排泄參數進行篩選，選擇口服利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的活性化合物

，并參考增加《中國藥典》記載的藥材指標成分，最終篩選獲得苦黃顆粒的主要活性化合物。

1.2 苦黃顆粒治療NAFLD的靶點預測

1.2.1 苦黃顆?；钚曰衔锏陌悬c篩選 在TCMSP 數據庫中檢索苦黃顆粒主要活性化合物的作用靶點，未檢索到靶點的活性化合物，再通過檢索Smiles結構式依次在PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

、Swiss Target Prediction數據庫

(http://swiss-targetprediction.ch/)、SEA數據庫(http://sea.bkslab.org)和STITCH數據庫(http://stit-ch.embl.de/)進行靶點檢索

；合并最終靶點結果并刪除重復值。利用String數據庫(https://string-db.org/)和Uniprot數據庫(http://www.uniprot.o-rg/)將檢索到的靶點統一為基因名(gene symbol)

。

通過函數調用，將上市公司全稱與境外投資企業(yè)名稱進行精確匹配；處理上市公司名稱，刪除 “集團”、“股份”、“控股”、“有限”、“公司”等字樣，再一次進行模糊匹配；進一步利用關聯交易文件確定上市公司與對外直接投資企業(yè)間是否存在關聯關系。本文認為其母子公司或同一集團控股子公司間接參與對外直接投資活動，符合本文研究上市公司對外直接投資活動對整個企業(yè)集團績效影響的初衷。

1.2.2 NAFLD的相關靶點篩選 以“Non-alcoholic fatty liver disease”為關鍵詞，挖掘DisGeNET數據庫(http://ww-w.disgenet.org和GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)中的疾病靶點

，合并檢索結果，刪除重復項，并將檢索到的靶點統一為基因名。

重要靶點的KEGG通路富集分析顯示有96條相關通路，均

<0.01提示NAFLD為關聯度較高的疾病之一，HIF-1、TNF、Toll樣受體、FoxO等信號通路可能為關鍵通路。

2.3 潛在靶點PPI網絡分析 苦黃顆粒治療NAFLD的潛在靶點導入String數據庫中，得到苦黃顆粒治療NAFLD的PPI網絡圖。最終PPI網絡包含105個靶點，2138條邊，平均網絡節(jié)點度為40.7，平均局部聚類系數(表示節(jié)點的聚集程度)為0.688，結果表明該PPI網絡中每個靶點平均約有40個靶點與之相連，并且網絡中各靶點之間關聯性較強。PPI網絡中按照“degree值大于均值”的標準篩選出重要靶點51個， 其中INS(91)、Alb(86)、IL(82)、AKT1(81)、TP53(79)和TNF(76)為度值最高的6個靶點，可能是苦黃顆粒治療NAFLD的關鍵靶點。

1.5.2 藥物-化合物-靶點-通路網絡構建 將單味藥、關鍵化合物、核心靶點及KEGG通路TOP20的數據導入Cytoscape，構建藥物-化合物-靶點-通路網絡

。

刺玫果水提物的制備：用8倍體積的水浸泡過夜,回流1h，反復回流提取3次，合并濾液，濃縮，凍干成粉備用。刺玫果醇提物的制備：用8倍體積的濃度為70%醇回流提取刺玫果，回流1h，反復回流3次，合并濾液，濃縮，凍干成粉備用。

1.5 化合物-靶點拓撲分析與藥物-化合物-靶點-通路網絡構建

1.5.1 化合物-靶點拓撲分析 將化合物、交集靶點導入Cytoscape軟件生成化合物-靶標網絡圖，進行網絡拓撲分析，獲得各節(jié)點的度中心性(DC)、中間中心度 (BC)、緊密中心性(CC)以及拓撲系數(TC)等參數，根據“節(jié)點DC、BC、CC、TC值大于中位數”為標準篩選出重要靶點，與1.3中的重要靶點取交集，獲得核心靶點與關鍵化合物

。

1.4 潛在靶點的GO分析和KEGG通路富集分析 將PPI蛋白相互作用網絡得到的重要靶點導入David數據庫

(https://david.ncifcrf.gov/)，進行GO富集分析及KEGG通路富集分析，將pvalue≤0.01作為通路聚類標準，篩選出顯著的前20條生物功能和前10條顯著的信號通路分別利用ImageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/)進行可視化。

1.6 苦黃顆粒對高脂飼料復合CCl

脂肪肝模型小鼠肝組織中TNF-α、TLR4、Myd88表達的體內實驗

2.1 苦黃顆粒活性化合物篩選結果 經TCMSP數據庫檢索并合并藥典指標化合物，收集到活性化合物共計109個，其中因無法檢索到靶標剔除活性化合物19個，最終得到活性化合物柴胡16個、大黃17個、苦參32個、茵陳15個、大青葉10個，其中柴胡、茵陳共有成分2個(異鼠李素、青蒿素A)，柴胡、苦參、茵陳共有成分1個(槲皮素)，大黃、茵陳、大青葉共有成分1個(β-谷固醇)，最終獲得苦黃顆粒組方活性化合物84個。

1.6.2 方法 ①高脂飼料復合CCl

脂肪肝小鼠模型：C57BL/6小鼠，高脂低蛋白質飼料復合CCl

染毒8周模型，隨機分為正常組、模型組、苦黃組。正常組小鼠普通飼料喂養(yǎng)8周。模型組與苦黃組小鼠均用高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)2周后，第3周首劑腹腔注射50% CCl

2ml/kg，第4周開始每周1次腹腔注射10% CCl

, 2 ml/kg。同時第4周開始苦黃浸膏粉生物等效量灌胃。苦黃顆粒人用量18 g/d，小鼠用量按照70公斤成人用量的10倍量計算，生物等效量=18 g/70 kg×10倍=2.57 g/kg鼠重/d。浸膏粉出膏率為0.6，用水配置308 mg/ml苦黃溶液，苦黃組小鼠每10 g鼠重，灌胃0.05 ml。②血清肝功能檢測：ALT、AST測定采用賴式比色法。③肝組織病理染色：肝組織4%甲醛液固定，石蠟包埋，4 μm切片，二甲苯、多級乙醇脫蠟至水，作HE染色。④RT-qPCR法測肝組織中TNFα、TLR4、Myd88表達：小鼠禁食12 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉3 ml/kg麻醉抽取下腔靜脈血、取肝，-70℃低溫保存。用上述試劑盒提RNA、逆轉錄、PCR實驗。

2 結果

1.6.1 材料 ①動物：C57BL/6小鼠，雄性，SPF級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學實驗動物中心。②藥物：苦黃顆粒浸膏粉，購自蘇州雷允上藥業(yè)有限責任公司。③試劑：總RNA抽提試劑盒(Cat No.B511321)、逆轉錄試劑盒 PrimescriptTMRTreagent Kit with gDNA Eraser(CatNo.RR047A)、TBGreenTM Premix EX TaqTM 擴增試劑盒(Cat No.RR420A)，以上試劑均購自日本TaKaRa 公司；引物購于上海生工生物工程股份有限公司，信息見表1。

2.2 苦黃顆粒治療NAFLD的潛在靶點 利用化合物名稱在TCMSP、PubChem、Swiss Target Prediction、SEA和STITCH數據庫進行檢索，將檢索到的化合靶點利用String和Uniprot進行標準化，獲得苦黃顆粒化合物靶點462個。運用DisGeNET和GeneCards數據庫檢索疾病相關靶點，篩選GeneCards數據庫中“relevant score ≥25”的靶點和DisGeNET數據庫“score≥0.1”的靶點，刪除重復之后獲得NAFLD靶點308個。將化合物靶點和疾病靶點取交集得到105個苦黃顆粒治療NAFLD的潛在靶點。

1.3 潛在靶點的蛋白質-蛋白質互相作用(PPI)網絡的構建 在String數據庫中導入苦黃顆粒治療NAFLD的潛在靶點

，選擇基因物種為人(Homo sapiens)，最小相互作用閾值設置為“medium confidence”(>0.04)，獲得PPI網絡

；導出分析結果，統計各靶點的節(jié)點度值，篩選出重要靶點。利用Metascape平臺(https://metascape.org/)分析得PPI網絡各靶點密集連接的網絡模塊。

2.4 潛在靶點的GO分析與KEGG通路富集分析 利用DAVID平臺對苦黃顆粒51個重要靶點進行GO分析，涉及的生物過程有RNA聚合酶II啟動子轉錄的正向調控，對雌二醇、乙醇等藥物的反應，基因表達的正向調控，凋亡過程的負調控，脂多糖介導的信號通路，衰老，血管生成，炎癥反應等過程；相關的分子功能有酶、轉錄因子、蛋白質和蛋白激酶等物質的結合，細胞因子、生長因子等物質的活性，RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結合及其特異性DNA結合等；與之關聯的細胞成分有蛋白質復合物、膠質溶膠、細胞質外泌體、線粒體、核質等部分。

1.2.3 苦黃顆粒治療NAFLD的靶點篩選 利用韋恩圖獲取苦黃顆?；钚曰衔锇悬c和NAFLD靶點的交集，獲得苦黃顆粒治療NAFLD的潛在靶點。

2.5 苦黃顆粒治療NAFLD的藥物—化合物—靶點—通路網絡及拓撲分析

2.5.1 化合物-靶點網絡拓撲分析 利用Cytoscape對網絡中的節(jié)點進行拓撲分析，網絡Node Degree Distribution擬合度(Correlation=0.973，R-squared=0.812)顯示擬合質量好，精確度較高；結果顯示，所有節(jié)點的DC、BC、CC、TC的中位數分別為4、0.00271969、0.31958763和0.36129032，按照“節(jié)點的DC、BC、CC、TC值大于中位數”篩選出核心化合物10個(甘草酚、菜豆蛋白、青蒿素A、兒茶素等)。根據核心化合物信息及PPI篩選出的重要靶點，最終獲得核心靶點14個(CCND1、EGFR、IL1B、MMP2/9、PPARG等)。

子宮瘢痕妊娠是一種特殊類型的異位妊娠,指孕囊著床于既往剖宮產術后子宮下段瘢痕處。當前臨床上關于子宮瘢痕妊娠的發(fā)病機制尚不明確,一般認為孕婦的前次剖宮產術導致子宮內膜缺損、肌層連續(xù)性被破壞,由此而出現的縫合錯位、愈合不佳等情況使得子宮出現空洞或是縫隙,一旦受精卵和絨毛在此位置著床形成妊娠即為子宮瘢痕妊娠[4]。

2.5.2 藥物-化合物-靶點-通路網絡 利用Cytoscape軟件導入苦黃顆粒組方藥物、活性化合物、苦黃治療NAFLD 105個重要靶點和KEGG通路富集分析TOP10，構建藥物-化合物-靶點-通路網絡(見圖1)，圖中可見一個化合物連接多個不同靶點和通路，提示苦黃顆粒是通過多靶點和多通路作用發(fā)揮治療NAFLD作用。

閱讀教學的簡約化就是指閱讀教學設計與實踐的高度概括性，這種概括不是一般理解意義上的簡單、空洞，而是以簡潔、清晰、精煉、完美的外在形式具體地表達豐富的思想內涵。它不是教學環(huán)節(jié)在形式上的減少，也不是訓練強度上的削弱，而是要固守語文教學的“根本”，盡量削去一些形式上的、不必要的、閑散的東西，最大限度的追求課堂教學的最優(yōu)化，讓學生進行有滋有味的語文實踐活動，進入深入淺出思維的訓練，獲得簡約深刻的語文感受。

2.6 苦黃對高脂飼料復合CCl

脂肪肝小鼠的體外實驗

2.6.1 3組小鼠肝臟病理檢測情況 見圖2。肝組織HE染色結果顯示：正常組小鼠肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，形成肝板結構，細胞形態(tài)完整，未見壞死，胞核居中，無明顯炎性細胞浸潤。模型組小鼠肝板結構破壞，肝細胞疏松化、大泡樣脂變、小泡樣脂變及炎性細胞浸潤。與模型組相比，苦黃組小鼠肝小葉結構破壞數目減少，肝細胞脂肪樣變性及炎性細胞浸潤減少。血清肝功能結果顯示：與正常組相比，模型組小鼠肝功能ALT、AST明顯升高，苦黃組小鼠ALT、AST明顯下調(

<0.05)。

2.6.2 3組小鼠肝功能檢測結果 見圖3。

2.6.3 3組小鼠肝組織內TNFα、TLR4、Myd88表達情況 見圖4。結果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肝組織TNFα、TLR4與Myd88基因表達顯著升高；給藥后上述基因表達均顯著下降。

在食品生產企業(yè)的衛(wèi)生管理章節(jié)教學中，首先可通過課堂講授讓學生理解食品企業(yè)的SSOP，GMP和HACCP管理體系的建立。然后，拋出河豚毒素、貝類等中毒案例，引導學生設計符合HACCP的河豚、貝類等生產工藝。學生自行分組進行生產工藝的危害分析，并建立合適的關鍵控制點和關鍵限制，最后在課堂上全班共同討論案例的衛(wèi)生生產缺陷，并給出避免此類中毒案件的建議的衛(wèi)生生產標準。

3 討論

有研究表明，柴胡中的皂苷類能減少TC吸收、促進TC排泄，具有降低TG、TC水平作用；并能降低ALT、AST水平，減輕炎癥反應，發(fā)揮護肝作用。黃酮類具有脂質調節(jié)功能，消除自由基發(fā)揮抗氧化作用

。大黃中的大黃酚、大黃酸等成分能夠改善脂質調控基因PPAR、CPT-1的表達，改善NAFLD大鼠的ALT、AST、TG、TC和GLU的水平，發(fā)揮降脂作用

；同時，能夠抑制IL-1β、IL-6、TNF-α和TLR4表達，減輕炎癥反應，改善NAFLD大鼠肝臟脂質滴空泡情況

。研究發(fā)現茵陳能夠抑制LPS引起的巨噬細胞炎癥，并具有降低肝內脂肪積蓄能力

；還能降低CCl

/EtOH致急性肝損傷動物的ALT、AST、TG水平及GSH、ADH、SOD和MDA水平，發(fā)揮降酶和抗氧化損傷的作用

；有研究表明茵陳色原酮能夠改善肝損傷動物生化指標和病理特征

?？鄥A能夠減輕NAFLD模型小鼠的肝臟病理損傷，減少肝細胞脂質滴并改善炎癥細胞浸潤，降低ALT、AST、TG水平，同時還能抑制脂質過氧化反應

。大青葉水煎劑能夠促進小鼠淋巴細胞活性，增強腹腔巨噬細胞的吞噬功能，并顯示出抗氧化作用。

白色反光板頂端兩黑色圓塊形心間的距離通過游標卡尺設置為100.00 mm，在中心處設置同樣大小的黑色圓塊表示初始時刻激光照射在反光板上的圖案。在中心黑色圓塊附近布置一塊同樣大小的黑色圓塊表示結構發(fā)生位移后激光照射在反射板上的圖案。本次實驗如圖5所示，依次對10.00 mm、9.00 mm、6.00 mm和5.00 mm的4次不同位移距離進行測試。通過MATLAB軟件對圖像預處理并通過計算得到攝影測量結果和誤差，如表1所示。

眼前的男人，一頭白發(fā)，一臉皺紋。疲憊像刀一樣，把這個比他高一個頭的男人，削了一節(jié)。楊琳的病如一付重擔，壓在老鉗工肩上，整個人仿佛都在往下沉。

2.2.2 單株干物質積累量 由圖3看出，不同處理下冬小麥單株干物質積累隨生育進程推進呈S型增長趨勢，總體分3個階段，返青至拔節(jié)期緩慢增長階段，拔節(jié)至灌漿期快速增長階段(其中抽穗至灌漿最快)，灌漿至成熟期緩慢增長階段。早播條件下不同密度間的干物質積累量差異較大，晚播的不同密度處理間差異較小。同一密度下，單株干物質隨播期的推遲而降低，分析原因是分蘗成穗的高低所致。

NAFLD靶點篩選結果提示，苦黃顆粒通過TNF、TLR通路以及IL-1β等靶點調控NAFLD過程中的炎癥反應，調節(jié)脂質代謝可能是通過PPAR實現。

炎癥因子失衡是NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中重要的病理生理基礎。Toll受體4通過一系列級聯反應激活NF-κB，促進以TNF-α為代表的各類炎癥因子大量釋放，發(fā)生強烈的炎癥反應，在 NAFLD 的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。同時LPS可通過TLR4/MyD88信號途徑活化枯否細胞，引發(fā)胰島素抵抗。胰島素的生理作用包括參與糖代謝及促進脂肪合成、抑制脂解，減少游離脂肪酸的釋放。當機體存在有胰島素抵抗時，胰島素作用不足，脂肪分解增加，大量的游離脂肪酸(FFA)釋放，肝內FFA氧化障礙使其利用減少。上述異常共同促使甘油三酯的形成增多，后者在肝細胞內的不斷堆積導致NAFLD的發(fā)生。本研究結果提示苦黃顆?？赏ㄟ^下調幾種基因的表達對NAFLD的治療起作用，這與網絡藥理學初挖的核心靶點與關鍵信號通路結果一致，為后續(xù)深入研究苦黃顆粒治療NAFLD的作用機制提供部分參考依據。

[1] 張聲生,李軍祥.非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療專家共識意見(2017)[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(12):2270-2274.

[2] Day CP, James OF. Steatohepatitis: a tale of two "hits"?[J].Gastroenterology, 1998,114(4):842-845.

[3] Fang YL, Chen H, Wang CL,

. Pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease in children and adolescence: From "two hit theory" to "multiple hit model"[J].World J Gastroenterol, 2018,24(27):2974-2983.

[4] 黃小華,胡曉明,陳梅芳,等.優(yōu)思弗與苦黃顆粒治療藥物性肝損傷療效比較[J].現代醫(yī)院,2012,12(S1):58-59.

[5] 侯孝友.苦黃顆粒聯合甘利欣對慢性肝炎退黃作用的療效觀察[J].吉林大學學報(醫(yī)學版),2008，40(2):331.

[6] 吳勝兵,高司成,吳勝沛.苦黃顆粒聯合多烯磷脂酰膽堿治療濕熱型酒精性肝炎臨床觀察[J].河南中醫(yī),2018,38(9):1377-1380.

[7] Ru J, Li P, Wang J,

. TCMSP: a database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines[J].J Cheminform, 2014,6(1):1-6.

[8] Kim S. Getting the most out of PubChem for virtual screening[J].Expert Opin Drug Discov, 2016,11(9):843-855.

[9] Daina A, Michielin O, Zoete V. SwissTargetPrediction: updated data and new features for efficient prediction of protein targets of small molecules[J].Nucleic Acids Res, 2019,47(W1): W357-W364.

[10] Kuhn M, Szklarczyk D, Pletscher-Frankild S,

. STITCH 4: integration of protein-chemical interactions with user data[J].Nucleic Acids Res,2014,42(Database issue): D401-D407.

[11] UniProt Consortium. UniProt: a worldwide hub of protein knowled-ge[J].Nucleic Acids Res, 2019,47(D1): D506-D515.

[13] Stelzer G, Rosen N, Plaschkes I,

. The gene cards suite: from gene data mining to disease genome sequence analyses[J].Curr Protoc Bioinformatics,2016,54:1.30.1-1.30，33.

[14] Franceschini A, Szklarczyk D, Frankild S,

. STRING v9.1: protein-protein interaction networks, with increased coverage and integration[J].Nucleic Acids Res,2013,41(Database issue): D808-D815.

[15] Vella D, Marini S, Vitali F,

. MTGO: PPI Network Analysis Via Topological and Functional Module Identification[J].Sci Rep, 2018,8(1):5499-5512.

[16] Dennis G Jr, Sherman BT, Hosack DA,

. DAVID: Database for annotation, visualization, and integrated discovery[J].Genome Biol,2003,4(9):418-427.

[17] Tang Y, Li M, Wang J,

. CytoNCA: a cytoscape plugin for centrality analysis and evaluation of protein interaction networ-ks[J].Biosystems, 2015,127:67-72.

[18] Morris GM, Lim-Wilby M. Molecular docking[J].Methods Mol Biol,2008,443:365-382.

[19] Hsin KY, Ghosh S, Kitano H. Combining machine learning systems and multiple docking simulation packages to improve docking prediction reliability for network pharmacology[J].PLoS One, 2013,8(12):e83922.

[20] 馮彥,高曉霞,秦雪梅.柴胡及其類方降脂療效和作用機制研究進展[J].中藥材,2019,42(8):1957-1961.

[21] 江楠,于靖,楊莉,等.中藥柴胡皂苷藥理作用的研究進展[J].環(huán)球中醫(yī)藥,2018,11(5):796-800.

[22] 胡云芝,李軍民,魯之中,等.大黃酚對高脂飲食誘導的幼齡大鼠非酒精性脂肪肝的調節(jié)作用[J].免疫學雜志,2018,34(10):869-874.

[23] 呂媛琳,劉晨晨,劉慧,等.大黃酸對非酒精性脂肪肝病模型大鼠干預作用及對血清IL-1β、IL-6的影響[J].浙江中西醫(yī)結合雜志,2018,28(3):180-183，258.

[24] Shang Y, Li XF, Jin MJ,

. Leucodin attenuates inflammatory response in macrophages and lipid accumulation in steatotic hepatocytes via P2x7 receptor pathway: A potential role in alcoholic liver disease[J].Biomed Pharmacother,2018,107:374-381.

[25] Cai Y, Zheng Q, Sun R,

. Recent progress in the study of Artemisiae Scopariae Herba (Yin Chen), a promising medicinal herb for liver diseases[J].Biomed Pharmacother, 2020,130:110513.

[26] Khan S, Shehzad O, Chun J,

. Anti-hyperalgesic and anti-allodynic activities of capillarisin via suppression of inflammatory signaling in animal model[J].J Ethnopharmacol,2014,152(3):478-486.

[27] Gao X, Guo S, Zhang S,

. Matrine attenuates endoplasmic reticulum stress and mitochondrion dysfunction in nonalcoholic fatty liver disease by regulating SERCA pathway[J]. J Transl Med, 2018,16(1):319-334.