朱進(jìn)華，翟亞瑩，朱肖亭，于 翔，李玉龍2,，張志杰，張格陽2,，張子敬，呂世杰，施巧婷，陳付英，徐照學(xué)，王二耀*

(1.河南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，鄭州 450003；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院， 鄭州 450002；3. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所， 鄭州 450002)

在傳統(tǒng)方法(ZFNs技術(shù)和TALENs技術(shù))中，外源序列被隨機(jī)整合到動物基因組中，具有隨機(jī)性和不確定性，編輯效率低且成本較高。CRISPR/Cas9技術(shù)與傳統(tǒng)方法截然不同，基因組可以以單核苷酸的精度進(jìn)行工程改造，使基因更精確地定點編輯[1]。

對于我國的肉牛種業(yè)品種改良進(jìn)展慢、育種成本高，這是限制其良種培育的“卡脖子”問題[2]。CRISPR/Cas9技術(shù)的產(chǎn)生與應(yīng)用在改良肉牛遺傳育種上，提供了一種更加高效價廉的方法，對肉牛育種和疾病防控等產(chǎn)生了巨大和深遠(yuǎn)的影響。本文就CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的發(fā)展歷程、作用機(jī)制、生產(chǎn)應(yīng)用方面進(jìn)行綜述，重點介紹該系統(tǒng)在肉牛研究中已取得的最新進(jìn)展，并對其發(fā)展做出展望。

1 CRISPR/Cas9的發(fā)展歷程

早在1987年，Ishino[3]在研究大腸桿菌的IAQ基因時，發(fā)現(xiàn)IAQ基因的編碼區(qū)下游有一段串聯(lián)間隔的重復(fù)序列，被含32個堿基的序列隔開，但此發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時并沒有引發(fā)太大關(guān)注。后來科研人員在細(xì)菌及古細(xì)菌中都檢測到了CRISPRS[4]，并預(yù)測了它們在基因修復(fù)或調(diào)控中發(fā)揮的作用[5-6]，Jansen博士領(lǐng)導(dǎo)的實驗室發(fā)現(xiàn)了4個與CRISPR相關(guān)的基因—CAS基因[7]，這些基因始終位于CRISPR基因座上。后來人們發(fā)現(xiàn)這些短而獨特的序列與病毒或質(zhì)粒的DNA序列相匹配，這暗示著CRISPR-Cas系統(tǒng)的“適應(yīng)性”，其能提供針對入侵者的特異性防御[8]。隨后的生信分析[9]驗證了這一點， 而后CRISPR 的作用機(jī)制首次在葡萄球菌干擾試驗中得到驗證[10]。CRISPR-Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種類型[11-12]，張鋒課題組[13]設(shè)計了兩種不同的Ⅱ型CRISPR / Cas系統(tǒng)，證明了Cas9核酸酶通過介導(dǎo)短RNA(sgRNA)可以定向誘導(dǎo)內(nèi)源性基因組位點裂解。Cas 9還可以轉(zhuǎn)化為一個缺口酶，促進(jìn)具有最小誘變活性的同源定向修復(fù)。另外，多個sgRNA序列可以共同編碼成一個CRISPR陣列，同時編輯基因的多個位點，這表明CRISPR —Cas系統(tǒng)具有易編輯性和廣泛適用性。

2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)制

CRISPR/Cas9的作用機(jī)制可以分為以下三個階段：間隔區(qū)的獲得、CRISPR的表達(dá)、外源DNA的切割。第一步：間隔區(qū)的獲得，當(dāng)噬菌體侵入細(xì)菌時，CRISPR系統(tǒng)會捕獲一段被稱為原型間隔序列的外源DNA序列，通過 Cas1、Cas2 和 Csn2 整合到 CRISPR 陣列中，當(dāng)噬菌體再次入侵時，該“記憶”區(qū)間能起到自動識別的作用CRISPR系統(tǒng)將該序列插入到前導(dǎo)序列與間隔重復(fù)序列之間[14]。第二步：CRISPR的表達(dá)，新形成的間隔區(qū)與其他所有間隔區(qū)，共同轉(zhuǎn)錄成一個包含間隔區(qū)和重復(fù)序列的CRISPR RNA( pre-crRNA) ，進(jìn)一步被切割成較小的crRNA，同時合成Cas9蛋白。第三步：crRNA和cas9蛋白在track RNA的指導(dǎo)下形成和蛋白復(fù)合物并進(jìn)行定點切割外來序列，破壞外源DNA[15](如圖1)。

CRISPR/Cas9的結(jié)構(gòu)之一—Cas9是一種內(nèi)切核酸酶，它使用RNA雙鏈體(TracRNA:CrRNA)中的導(dǎo)向序列與DNA靶序列形成堿基對，使Cas9能夠在DNA中引入位點特異性雙鏈斷裂。在實驗室試驗中，雙重tracrRNA:crRNA被設(shè)計成一個單一的導(dǎo)向RNA (sgRNA )，它保留了兩個關(guān)鍵特征:在5′的序列通過沃森-克里克堿基配對確定DNA靶位點，在3′的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)結(jié)合Cas9。sgRNA指導(dǎo)Cas9的導(dǎo)向序列發(fā)生變化，以靶向任何感興趣的DNA序列[16]，從而進(jìn)行定點切割。DNA雙鏈切斷后，細(xì)胞啟動自我修復(fù)機(jī)制，利用非同源末端連接修復(fù)(NHEJ)和同源重組修復(fù)(HDR)兩種方式對基因進(jìn)行修復(fù)。此環(huán)節(jié)科研人員可插入外源基因，實現(xiàn)基因的同源重組[17](如圖2)。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的防御機(jī)制[2]

圖2 CRISPR/Cas9的作用機(jī)理[2]

3 CRISPR/Cas9技術(shù)在肉牛上的應(yīng)用

牛的生產(chǎn)周期長，實驗成本高，所以CRISPR/Cas9技術(shù)在牛上的應(yīng)用比較少，較其他動物而言發(fā)展較慢，在2014年才出現(xiàn)第一個由CRISPR/Cas9介導(dǎo)、圍繞牛開展的基因編輯試驗[18]，該試驗表明CRISPR/Cas9技術(shù)可以高效地編輯牛胚胎和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞。近些年對于肉牛的基因編輯研究有所增加，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用對于提高肉?？共⌒?、改善產(chǎn)肉性能、優(yōu)化繁殖性狀等方面均有顯著影響。

3.1 應(yīng)用于提高?？共⌒?/h3>

肉牛的健康狀況直接影響著肉牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，CRISPR/Cas9技術(shù)可以通過定點敲入或敲除基因，培育出具有抗病能力的牛。日本黑牛肉質(zhì)鮮美以大理石花紋聞名，95%的日本黑牛是通過人工授精繁育，所以當(dāng)優(yōu)秀的公牛攜帶的疾病時，可通過人工授精廣泛傳播。其中IARS綜合征是存在于日本黑牛中隱性疾病的一種，其發(fā)病原因是IARS基因突變?yōu)榧兒献?，患病純合突變的犢牛在宮內(nèi)生長遲緩，體質(zhì)虛弱，死亡率高甚至宮內(nèi)死亡。為修正突變的密碼子，日本科學(xué)家利用CRISPR/Cas9技術(shù)，將CRISPR/Cas9和包含正確氨基酸的同義密碼子的供體DNA，引入從純合突變小牛分離的胎牛成纖維細(xì)胞(BFF)細(xì)胞中，后進(jìn)行細(xì)胞核移植得到了SCNT胚胎，最后成功得到的IARS基因被正確修復(fù)的胎牛[19]。

地方上傳染病對于當(dāng)?shù)嘏I(yè)發(fā)展而言是很大的威脅，其中牛白血病病毒(BLV)導(dǎo)致的地方性傳染病是一種可以在人和牛間廣泛傳播的慢性傳染病，其防治對于人畜安全生產(chǎn)都很重要。有研究表明，CD209分子可能是BLV的潛在受體，目前已在實驗室水平研究出用于敲除CD209基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，有望通過基因編輯生產(chǎn)出對BLV感染具有抵抗力的牛[20]。

在牛生產(chǎn)上，腹瀉一直是嚴(yán)重影響犢牛、成牛健康狀況的重要疾病，病原之一的牛病毒性腹瀉病毒(BVDV，以下簡稱BVDV)可導(dǎo)致牛病毒性腹瀉病 (BVD)，該病在牛之間具有高度接觸傳染性[21]。牛感染該病毒后輕則出現(xiàn)精神沉郁，腹瀉發(fā)熱，胎牛流產(chǎn)等癥狀，重則直接死亡；對育肥牛的產(chǎn)肉率，奶牛的奶產(chǎn)量，種用牛的繁殖力有一定影響，并且繼發(fā)持續(xù)感染[22]。為從基因水平上探究防治 BVDV 的方法，有研究利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，分別敲除了牛腎上皮(MDBK，以下簡稱MDBK) 細(xì)胞的低密度脂蛋白受體(LDLR) 基因[23]和MDBK細(xì)胞的SERPINF2基因[24]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別敲除這兩個基因均能顯著性抑制BVDV復(fù)制，這為生產(chǎn)抗腹瀉病毒的牛提供了試驗依據(jù)。

另外，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)還可以用于疫苗的研發(fā)，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成功敲除了牛皰疹病毒( BHV) 的gE基因，使牛皰疹病毒滅活且重組毒株具有免疫原性，為疫苗生產(chǎn)的新方式提供了試驗基礎(chǔ)[25]。

3.2 應(yīng)用于提高產(chǎn)肉性能

MSTN已被證明跟肌肉的發(fā)育有關(guān)，MSTN的存在會抑制肌肉發(fā)育[26-28]。郭梓茹[29]利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建無標(biāo)記的MSTN基因敲除的蒙古牛細(xì)胞系，得到MSTN基因敲除的細(xì)胞株，該細(xì)胞株可作為供體細(xì)胞，利用體細(xì)胞核移植技術(shù)生產(chǎn)MSTN基因敲除的蒙古牛。后尉翔棟[30]利用CRISPR/Cas9技術(shù)成功制備了敲除MSTN基因的牛胚胎，豐富了雙肌肉牛品種培育的遺傳素材。目前敲除MSTN基因的轉(zhuǎn)基因牛已被生產(chǎn)出來，李廣鵬[31]等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù),以影響肌肉發(fā)育的MSTN基因為靶標(biāo),選擇不同位點進(jìn)行定點敲除,經(jīng)體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了基因編輯牛，再利用編輯牛精液分別與魯西牛、蒙古牛和西門塔爾牛配種,生產(chǎn)了221頭F1代，對F1代進(jìn)行生化血液分析和屠宰性狀分析，結(jié)果顯示MSTN基因編輯牛的各項體尺指標(biāo)普遍優(yōu)于普通牛,后軀發(fā)育極顯著提升,產(chǎn)肉率提高且肉質(zhì)正常。胎兒發(fā)育正常,出生體重正常,無明顯難產(chǎn)現(xiàn)象[32-33]。

除MSTN可以影響牛的肌肉發(fā)育外，肌細(xì)胞生成素(MyoG)、生肌因子6(Myf6)在肌纖維數(shù)量的固定、肌纖維類型的分化過程中也起到了重要作用[34]。李冬曉[35]以牛骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞為試驗材料，利用 CRISPR 干擾( CRISPRi) 技術(shù)同時和分別干擾MyoG、Myf6基因的表達(dá)，以探究MyoG、Myf6 基因的低表達(dá)時對肌肉分化的影響。另外，IGF2基因也已被證實與肌肉發(fā)育有關(guān)，以濃度控制的方式促進(jìn)肌纖維的分化[36]，濃度高時促進(jìn)肌肉生長發(fā)育，反之抑制[37]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)可以有效編輯IGF2基因并提高其表達(dá)水平,在得到IGF2基因編輯牛胚胎后，通過胚胎移植技術(shù)得到高產(chǎn)肉牛，這會成為分子育種的又一突破[38]。

3.3 應(yīng)用于提高繁殖率

牛繁殖率低是困擾養(yǎng)牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題之一，科研人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)不斷探索，嘗試找到提升牛繁殖性能的方法。BMP15和GDF9基因在牛的卵泡發(fā)育上起到調(diào)控作用[39-41]，其突變可以促進(jìn)卵泡發(fā)育并提高排卵率[42]。馮萬有[43]使用CRISPR/Cas 9技術(shù)突變對水牛胎兒成纖維細(xì)胞上的BMP15和GDF9 基因同時進(jìn)行基因敲除，其中BMP敲除效率為37.5%，GDF 敲除效率為10.0%，此試驗為CRISPR/Cas 9雙基因同時編輯提供了試驗基礎(chǔ)，旨在探究提高水牛繁殖能力的分子育種方法。另有研究表明，利用CRISPR/Cas 9系統(tǒng)對牛胚胎的NONAG基因進(jìn)行定點敲除后，滋養(yǎng)層(TE)的分離和維持沒有明顯變化，但可以影響多能內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(ICM)結(jié)的分化與增殖[44]。利用CRISPR/Cas9技術(shù)建立肉牛的繁育體系已經(jīng)被提上日程，中科院西北高原生物研究所[45]將此技術(shù)應(yīng)用在牦牛品種改良，提供了一套切實可行的牦牛體外胚胎生產(chǎn)和基因編輯技術(shù)體系，以促進(jìn)牦牛的優(yōu)繁優(yōu)育和闊群增量。

由于繁殖性狀受環(huán)境因素、人為因素的影響較大，主效基因復(fù)雜，目前利用CRISPR/Cas9對于繁殖性狀進(jìn)行改良的研究比較少，但隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷進(jìn)步和人們對基因的深入探索，相信該技術(shù)未來一定可以為肉牛種業(yè)的興旺發(fā)達(dá)做出貢獻(xiàn)。

4 展望

農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，種子是基礎(chǔ)。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生對于我國肉牛種業(yè)振而言有很大的促進(jìn)意義，科研工作者們有了更高效精確的工具來編輯基因。然而該技術(shù)還存在一些問題，如體系不穩(wěn)定、脫靶率較高等，需要進(jìn)一步改善優(yōu)化。目前CRISPR/Cas9技術(shù)在人、小鼠、斑馬魚等方面都有了長足進(jìn)步，該技術(shù)在肉牛上的實驗室研究也在如火如荼地進(jìn)行著，接下來需要理論與實踐相結(jié)合，把科研成果落實在生產(chǎn)上，相信未來我國的肉牛產(chǎn)業(yè)將會擁有更加廣闊的發(fā)展前景。