高習(xí)龍,劉麗霞,鄭淳一,屈夢嬌,袁建梅,尚學(xué)芳

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

硫化氫(H2S)長期以來被認(rèn)為是一種帶有臭雞蛋味道的有毒氣體，近年來研究表明，H2S是繼一氧化碳和一氧化氮之后的第3種氣體信號分子，在生物系統(tǒng)中具有重要的生理功能[1-3].它在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和其他涉及人類健康和疾病的基本信號過程中發(fā)揮著重要作用，包括血管平滑肌的放松[4-5]、神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)[6-7]、抑制胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)炎癥[8-10]等.內(nèi)源性的H2S可以通過3種不同的酶促途徑生成，包括胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)和3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)與半胱氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(CAT)的偶聯(lián)[11-12].此外，H2S水平的改變也可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，如高血壓、肝硬化、糖尿病、唐氏綜合征和阿爾茨海默病[13-15].因此，為了更全面了解H2S在生物系統(tǒng)中的生理作用，尋找具有高靈敏度和選擇性的檢測技術(shù)來監(jiān)測生物體內(nèi)的H2S水平至關(guān)重要.

傳統(tǒng)的H2S檢測方法有化學(xué)發(fā)光法[16]、電化學(xué)分析[17]、氣相色譜法[18]等，但這些方法有較多局限性，比如需要對組織或細(xì)胞進(jìn)行處理或破壞，且不能對H2S進(jìn)行實時跟蹤定位，限制了其在生物環(huán)境中實時監(jiān)測的應(yīng)用.相比傳統(tǒng)方法，近幾年基于熒光探針的方法已經(jīng)成為熱門方法，它能夠?qū)崟r測量活體生物系統(tǒng)中的H2S，具有快速、高效、專一性識別等優(yōu)點.目前，研究者根據(jù)H2S特有的反應(yīng)機(jī)制，如親核加成[19-22]、金屬硫化物沉淀[23-25]、還原反應(yīng)等[26-30]，成功設(shè)計合成了不同類型的熒光探針，以此來檢測H2S的水平.

基于此，筆者設(shè)計合成了一系列含有苯肼類的熒光分子探針，通過紅外、核磁、高分辨質(zhì)譜等方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，利用紫外可見光譜、熒光光譜等方法研究系列探針與H2S之間的相互作用，探討新型熒光探針結(jié)合HS-的靶向性.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

主要儀器：梅特勒進(jìn)口電子天平，瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，河南省予華儀器有限公司；Unity Plus-400-MHz核磁共振儀，瑞士布魯克公司；UV2600紫外-可見分光光度計，日本島津公司；Eclipse熒光光譜儀，美國安捷倫公司；MicrOTOF-Q III高分辨質(zhì)譜儀，德國布魯克公司.

主要試劑：2,4-二羥基苯甲醛、7-羥基香豆素、六亞甲基四胺、四丁基氯化銨、四丁基溴化銨、四丁基氟化銨、四丁基碘化銨、四丁基乙酸銨、硫氫化鈉、半胱氨酸、谷胱甘肽等均購置于上海阿拉丁試劑有限公司；2,4-二硝基苯肼購置于上海試劑三廠有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購置于天津市德恩試劑有限公司.

實驗中用到的其他試劑均為分析純，所用蒸餾水為高純水，所用無水溶劑均按照有機(jī)溶劑純化手冊進(jìn)行處理.

1.2 化合物的設(shè)計及合成

化合物1～5的合成路線如圖1所示.

圖1 化合物1～5的合成路線

化合物1：將2,4-二硝基苯肼(1 980 mg,10 mmol)的無水乙醇溶液(20 mL)加到250 mL的三頸燒瓶中，在磁力攪拌下將2,4-二羥基苯甲醛(1 380 mg,10 mmol)的乙醇溶液(20 mL)逐滴加入上述燒瓶中，滴加完畢后，反應(yīng)溶液變紅色，將反應(yīng)體系于80 ℃回流6 h.反應(yīng)停止后冷卻至室溫，析出沉淀，過濾，經(jīng)無水乙醇洗滌和重結(jié)晶，得最終產(chǎn)物化合物1(1 908 mg, 60.2%)，熔點>300 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ 11.59(s,1 H),10.13(s,1 H), 9.97(s,1 H),8.82(m,2 H),8.32(dd,J=9.7 Hz,1 H),7.94(d,J=9.7 Hz,1 H),7.64(d,J=9.2 Hz,1 H),6.35(m,2 H).MS-HRMS(m/z)：計算值：317.052 8；實測值：317.052 7.

化合物2和3：將2,4-羥基苯甲醛(910.8 mg, 6.6 mmol)和乙酰乙酸乙酯(1.3 mL)溶于10 mL無水乙醇，向反應(yīng)液中分別加入0.1 mL哌啶和2滴冰醋酸，將反應(yīng)體系加熱回流6 h，反應(yīng)結(jié)束后冷凝析出，得棕色中間體M.將中間體M(40.8 mg)的甲醇溶液(5 mL)滴加至含有1滴HCl的4-硝基苯肼(39.6 mg,0.20 mmol)的甲醇溶液中，反應(yīng)體系在60 ℃恒溫攪拌2 h，過濾，得到黃色沉淀，無水CaCl2真空干燥，重結(jié)晶后得到化合物2(49.64 mg, 73%)，熔點：>300 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ 10.71(s,2 H),10.28(s,1 H),8.06(d,J=9.6 Hz,1 H),7.69(d,J=8.6 Hz,1 H),6.83(dd,J=8.5 Hz,2 H),6.76(d,J=2.1 Hz,3 H),3.34(s,3 H).13C-NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ162.14, 155.82, 151.58, 141.80, 139.24, 130.99, 126.31, 122.52, 114.07, 112.70, 111.98, 102.24, 16.21.MS-HRMS(m/z)：計算值：340.093 1；實測值：340.092 9.

另將含有中間體M(40.8 mg)的甲醇溶液(5 mL)逐滴加入含有1滴HCl的2,4-二硝基苯肼(39.6 mg,0.20 mmol)的甲醇溶液中，體系有沉淀產(chǎn)生，將反應(yīng)液于60 ℃恒溫攪拌2 h，過濾，無水CaCl2真空干燥，無水乙醇重結(jié)晶得化合物3(55.35 mg, 68%)，熔點：>300 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ 10.85(s,1 H),8.89(d,J=2.6 Hz,1 H),8.42(dd,J=9.6 Hz,1 H),8.34(s,1 H),8.06(d,J=9.6 Hz,1 H),7.71(d,J=8.6 Hz,1 H),6.85(dd,J=8.5 Hz,1 H),6.76(d,J=1.8 Hz,2 H),1.06(s,3 H).13C-NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ162.80, 156.19, 152.24, 144.75, 143.27, 138.05, 131.39, 130.57, 123.40, 121.15, 114.29, 111.76, 102.31, 15.69.MS-HRMS(m/z)：計算值：407.059 8；實測值：407.059 7.

化合物4和5：將4-二乙胺基水楊醛(1930 mg,10 mmol)和乙酰乙酸乙酯(1 300 mg,10 mmol)分別加入含有100 mL無水乙醇的燒瓶中，再滴加0.5 mL哌啶.將反應(yīng)體系加熱回流6 h，反應(yīng)結(jié)束后冷卻析出沉淀，重結(jié)晶得中間體N.將4-硝基苯肼(306.3 mg, 2 mmol)溶于少量無水乙醇中，在上述溶液中逐滴加入含有1滴HCl的中間體N(518 mg,2 mmol)的乙醇溶液中.將反應(yīng)體系在攪拌條件下加熱2 h，反應(yīng)1 h后溶液出現(xiàn)橙紅色沉淀，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，乙醇和水(1∶1)混合溶液洗滌，干燥，乙醇和水(1∶1)混合溶液重結(jié)晶，得到化合物4(550.63 mg, 69.7%)，熔點：232～235 ℃.1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ10.22(s,1 H),8.13(d,J=8.9 Hz,1 H),7.59(d,J=8.9 Hz,2 H),7.34(d,J=9.2 Hz,3 H),6.56(d,J=2.2 Hz,2 H),3.31～3.27(m,4 H),2.28(s,6 H),1.14(t,J=7.0 Hz,3 H).13C-NMR(101 MHz, DMSO-d6)δ156.76,151.68, 141.96, 139.00, 130.68, 126.32, 112.58, 109.84, 108.37, 44.60, 16.27, 12.82.MS-HRMS(m/z)：計算值：395.171 1；實測值：395.171 2.

將2,4-二硝基苯肼(396 mg,2 mmol)溶于少量無水乙醇中，在上述溶液中逐滴加入含有1滴HCl的中間體N(518 mg, 2 mmol)的乙醇溶液.將反應(yīng)體系攪拌加熱2 h，過濾，用乙醇和水(1∶1)混合液洗滌，干燥，乙醇和水(1∶1)混合溶液重結(jié)晶，得到化合物5(665.28 mg, 72%)，熔點：262～263.5 ℃.1H-NMR(400 MHz,CHCl3)δ11.40(s,2 H),9.1(s,1 H),8.37(d,J=9.5 Hz,1 H),8.20～8.00(m,3 H),7.41(d,J=8.8 Hz,1 H),6.67(d,J=8.7 Hz,1 H),6.54(s,2 H),3.48(dd,J=13.8 Hz,4 H),1.2(t,J=6.9 Hz,6 H).13C-NMR(101 MHz, CHCl3)δ160.82, 157.22, 152.20, 151.58, 144.75, 138.17, 130.08, 129.64, 123.58, 117.23, 109.55, 108.42, 45.06, 15.47, 12.46.MS-HRMS(m/z)：計算值：462.138 9；實測值：462.138 8.

1.3 光譜性質(zhì)測定

分別稱取少量化合物1～5溶于適量的DMSO溶劑中，制得濃度為4.0×10-5mol·L-1的待測液備用.稱取適量高氯酸銅六水合物和硫氫化鈉分別溶于蒸餾水和DMSO中，配制濃度為4.0×10-5mol·L-1的銅離子和硫氫根離子儲備液待用.各移取2.5 mL化合物1～5的溶液，并向內(nèi)加入20 μL的銅離子溶液，最后，加入硫氫根離子儲備液，進(jìn)行光譜測定.其中，熒光發(fā)射光譜的激發(fā)波長為280 nm，狹縫寬度分別為10 nm和5 nm.

1.4 細(xì)胞毒性試驗

CCK-8法檢測探針1+Cu2+對HepG-2細(xì)胞的毒性.在96孔板中加入100 μL的細(xì)胞懸液(每孔約1×105個細(xì)胞)，將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h(37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5% CO2)，加入10 μL不同濃度(0,10,20,50,100，150 μg·mL-1)的探針溶液，接著在培養(yǎng)箱孵育24 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液.將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1～4 h，用酶標(biāo)儀測定其450 nm處的吸光度.

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外-可見光譜及選擇性實驗

在DMSO溶劑中，通過紫外-可見吸收光譜研究了化合物1～5及探針與HS-的作用.如圖2(a)所示，化合物1在425 nm處有較強(qiáng)的吸收峰，隨著Cu2+的加入，在294 nm處出現(xiàn)一個逐漸增強(qiáng)的新的吸收峰，并伴有輕微藍(lán)移，且在395 nm處呈現(xiàn)等吸收點，說明化合物1與Cu2+形成了穩(wěn)定絡(luò)合物(將其命名為探針1+Cu2+).在化合物1和Cu2+絡(luò)合形成探針后(溶液由黃色變?yōu)榈S色)，逐漸滴加NaHS(如圖2(b)所示)，隨著HS-的加入，在294 nm處的吸收峰強(qiáng)度逐漸降低，而且在458 nm處出現(xiàn)一個明顯的等吸收點，說明探針1+Cu2+和HS-發(fā)生了相互作用.當(dāng)探針1+Cu2+中加入其他陰離子及生物硫醇后，探針的紫外-可見光譜并未發(fā)生明顯變化(如圖2(c)所示)，表明探針與其他陰離子及生物硫醇之間的相互作用很弱,可以忽略.上述結(jié)果表明，探針1+Cu2+與HS-存在相互作用，可以作為HS-的檢測傳感器.

箭頭所指為吸光度在該波長下分別隨著Cu2+以及HS-的加入導(dǎo)致其相應(yīng)的變化(化合物1：4.0×10-5 mol·L-1，Cu2+和HS-: 4.0×10-5 mol·L-1).

當(dāng)化合物1中加入其他陽離子(Li+,K+,Na+,Mg2+,Mn2+,Al3+,Fe3+,Co2+,Cd2+,Ni2+)后，只有Fe3+發(fā)生了與Cu2+類似的光譜變化(如圖3(a)～(b))，繼續(xù)向此溶液中逐漸滴加NaHS，吸收峰并沒有明顯的改變.對化合物2進(jìn)行同等條件下加入陰離子及生物硫醇的實驗(如圖3(c))，化合物2與Cu2+形成絡(luò)合物后，加入NaHS和其他陰離子均未有明顯的變化，表明它們之間的相互作用很弱，可以忽略，化合物3～5也未出現(xiàn)明顯的光譜變化(如圖3(d)，以化合物3為例).因此，化合物2～5未能用于H2S的檢測.其原因可能與化合物結(jié)構(gòu)中羥基的位置有關(guān)，化合物1中，希夫堿的鄰位和對位都有羥基，化合物2和3中對位有羥基，但鄰位換成了羰基，化合物4和5中沒有羥基且鄰位是羰基，而只有化合物1與NaHS發(fā)生了相互作用.故從實驗結(jié)果可看出，化合物1中對位的羥基在主客體作用中發(fā)揮了重要作用.此外，在此系列化合物中，苯環(huán)上硝基的存在對結(jié)果影響不大.

化合物1～3: 4.0×10-5 mol·L-1，所有離子及生物硫醇: 4.0×10-5 mol·L-1.

2.2 熒光光譜

箭頭所指為熒光強(qiáng)度在該波長下分別隨著Cu2+的加入而降低以及隨著HS-的加入而升高(化合物1: 4.0×10-5 mol·L-1，Cu2+和HS-: 4.0×10-5 mol·L-1).

向化合物1中加入其他陽離子(Li+,K+,Na+,Mg2+,Mn2+,Al3+,Fe3+,Co2+,Cd2+,Ni2+)后，只有Fe3+表現(xiàn)出與Cu2+類似的光譜變化.同時，向該溶液中繼續(xù)加入HS-后，其熒光強(qiáng)度未發(fā)生明顯增強(qiáng).同樣，對化合物2做相同實驗處理，發(fā)現(xiàn)探針的熒光強(qiáng)度沒有發(fā)生顯著增強(qiáng)，而另外4個探針與HS-結(jié)合后，探針的熒光強(qiáng)度均沒有明顯的增強(qiáng).因此，探針1+Cu2+可以選擇性地識別H2S.熒光光譜實驗得出與紫外-可見光譜相同的結(jié)果，進(jìn)一步說明該系列結(jié)構(gòu)中，鄰位羥基在主客體的相互作用中發(fā)揮了重要作用.

2.3 熒光壽命

在DMSO溶劑中，依次加入化合物1、探針1+Cu2+及探針1+Cu2++HS-3種儲備樣，所測得的熒光壽命結(jié)果如圖5所示.經(jīng)過儀器擬合熒光壽命時間曲線得到的均為一階壽命，計算化合物1的平均壽命為40.67 ns，加入Cu2+后為30.21 ns，當(dāng)加入HS-后熒光壽命為40.12 ns.由此可以看出化合物本身具有一定的熒光壽命，當(dāng)加入Cu2+后熒光壽命降低，可能是由于主客體之間相互作用[33]造成的，隨著HS-的加入，熒光壽命再次增加至原來化合物的水平，表明游離的化合物被釋放出來.

圖5 化合物1、探針1+Cu2+及探針1+Cu2++HS-的熒光壽命衰減曲線

2.4 檢測限的測定

在DMSO溶劑中，通過紫外-可見光譜滴定測得探針1+Cu2+對HS-的檢測限.如圖6所示，探針在423 nm處的吸光度值為0.975，向探針中滴加HS-，當(dāng)HS-濃度為1.12×10-4mol·L-1時，吸收強(qiáng)度降低了1.3倍.說明探針對HS-的檢測限為1.12×10-4mol·L-1.

圖6 探針1+Cu2+對HS-的檢測限

2.5 干擾性試驗

圖7 共存離子對HS-的干擾性實驗

2.6 圓二色光譜

在DMSO溶劑中，探針與HS-作用的圓二色光譜如圖8所示.化合物1在220 nm處呈現(xiàn)出一個正的科頓效應(yīng)，可能是由于苯環(huán)的π→π*引起的[34].當(dāng)加入Cu2+形成探針后，峰值有所增加，這可能是因為Cu2+以剛性結(jié)構(gòu)鍵相連，分子共軛成分增加，從而使電子吸收增強(qiáng).再加入HS-后，發(fā)現(xiàn)峰值又降低到與化合物1本身相似，說明化合物1被釋放出來成自由態(tài).

圖8 化合物1、探針1+Cu2+以及探針1+Cu2++HS-的圓二色光譜圖

2.7 反應(yīng)機(jī)制探討

通過以上實驗數(shù)據(jù)分析，探針1+Cu2+與HS-可能的作用機(jī)制如圖9所示.化合物1中的雜原子N,O與Cu2+進(jìn)行配位，通過UV-Vis確定了化合物1與Cu2+的結(jié)合比.在Job-plot實驗中，保持化合物1與Cu2+兩者之間的總濃度不變，改變兩者之間的摩爾比例(1∶9,2∶8,3∶7,4∶6,5∶5,6∶4,7∶3,8∶2,9∶1)，通過紫外光譜測定不同比例下的吸收值，計算化合物1與探針1+Cu2+兩者吸光度值的差值為最大值時兩者的摩爾比即為兩者的結(jié)合比.如圖10所示，化合物1與Cu2+的結(jié)合比為2∶1.當(dāng)向探針1+Cu2+溶液中加入HS-后，推測HS-與探針1+Cu2+發(fā)生取代反應(yīng)，即HS-取代化合物1與Cu2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，最終將化合物1釋放出來.

圖9 探針1+Cu2+與HS-的反應(yīng)機(jī)制

圖10 化合物1與Cu2+的Job-plot曲線

2.8 細(xì)胞毒性實驗

筆者通過CCK-8法評價了探針1+Cu2+對人肝癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性.如圖11所示，探針1+Cu2+在濃度為0～150 μg·mL-1內(nèi)，細(xì)胞的存活率仍超過70.8%，表明探針1+Cu2+對細(xì)胞的毒性較小，進(jìn)一步說明探針1+Cu2+對于體外H2S的檢測具有很大的應(yīng)用潛力.

圖11 HepG-2細(xì)胞在0～150 μg·mL-1熒光探針下于37 ℃培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞活力

3 結(jié)束語

作者設(shè)計合成了一系列含有苯肼類硫化氫熒光分子探針，并篩選出具有高選擇性和高靈敏度的熒光探針1+Cu2+，通過紫外-可見光譜和熒光光譜等測定分析，在DMSO溶液中探針1+Cu2+對HS-的檢測限為1.12×10-4mol·L-1，具有良好的選擇性和靈敏度.以上研究表明，該苯肼類硫化氫熒光分子探針作用能力強(qiáng)、選擇性好，為進(jìn)一步檢測生物體內(nèi)H2S的水平奠定了基礎(chǔ).