劉 歡，劉濟明,管睿婷，梁格林，唐子燕

(貴州大學 林學院，貴州大學森林生態(tài)研究中心，貴州 貴陽 550025)

米槁(CinnamomummigaoH.W.Li)系樟科(Lauraceae)樟屬的一種高大常綠喬木，成年株高可達25 m，是中國西南地區(qū)特有的藥用植物，僅分布于云南、貴州、廣西三省交界的玉江、盤江、紅水河形成的干熱河谷[1].米槁的果實是香料、食品、精油等的原料[2-3].然而，由于人們對米槁資源的不合理利用及其生境的不斷惡化，使其已處于野生資源分布稀缺的狀態(tài)[4].要解決野生中藥材瀕危問題，需要發(fā)展人工種植.但西南地區(qū)土層淺薄、土壤的高滲透性使水分流失加快，干旱脅迫成為限制該地區(qū)植物生長與分布的主要因素之一[5]，因此，研究如何提高米槁幼苗的抗旱性對西南地區(qū)的人工栽培具有重要意義.

以往研究表明，叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，簡稱AMF)能在土壤干旱條件下改善植物水分狀況，提高植物水分利用效率，減少根系水分喪失[6-7].菌根真菌與植物共生后通過提高宿主植物活性氧清除系統(tǒng)酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量和磷元素吸收能力等間接地提高宿主植物的水分吸收能力，延遲干旱脅迫的致死時間[8].許平輝等[9]研究發(fā)現(xiàn)接種AMF可以提高水分脅迫下茶樹的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，有效清除活性氧，緩解干旱脅迫對茶樹的傷害，這一結論與賀學禮等對民勤絹蒿[10]和紫穗槐[11]的研究一致.

前人對米槁的抗旱性能研究多集中于其在自然干旱脅迫下的生長特性，還未有人對米槁的菌根化苗抗旱性進行過研究.因此，在該研究中，作者選擇了能在香樟根部定殖的層狀球囊霉(Glomuslamellosum，簡稱Gl)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum，簡稱Ge)作為AMF接種菌劑，設置不同接菌量對米槁幼苗進行接種，旨在探討AMF是否能提高米槁幼苗的抗旱性，為西南地區(qū)的造林技術研發(fā)提供理論支撐.

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 米槁的無菌苗

選取健康、成熟飽滿、大小均勻的米槁種子，于貴州大學林學院生態(tài)學實驗室內(nèi)育苗.試驗前，經(jīng)200 mg·L-1的GA3溶液催芽處理48 h后用5% NaClO攪拌消毒10 min，無菌水沖洗4次后用滅菌河沙埋藏，置于25 ℃恒溫氣候箱萌發(fā)培育.出苗20 d后移至口徑為24 cm×19 cm的滅菌花盆中培養(yǎng).

1.1.2 叢枝菌根真菌

AMF層狀球囊霉(Glomuslamellosum)和幼套球囊霉(Glomusetunicatum)由貴州大學森林生態(tài)研究中心和森林培育實驗室提供.通過白三葉草(TrifoliumrepensL.)種子(75% C2H5OH表面消毒10 min后無菌水洗凈4次)進行為期128 d的擴繁培養(yǎng)，將剪碎的三葉草根系與培養(yǎng)基質(zhì)混勻即得含有孢子、菌絲、菌根的AMF菌劑，每20 g土壤中約含有60個孢子.

1.1.3 栽培基質(zhì)

栽培基質(zhì)為森林土(過10目篩)、河沙(粒徑0.7～1 mm)與珍珠巖(粒徑2～4 mm)的混合物(體積比為5∶1∶1)，pH為6.4，在0.14 Mpa、125 ℃下連續(xù)滅菌2 h.每盆含栽培基質(zhì)3.5 kg.

1.2 試驗設計

1.2.1 試驗方案

米槁幼苗移栽到花盆里種植3個月后進行接菌處理.通過拌基質(zhì)接菌方式，將菌種擴繁所得AMF菌劑對米槁幼苗進行接種，每個接種菌劑設置5個接菌量梯度：0(對照)，20，40，60，100 g，每個處理設置4個重復，如表1所示.

表1 AMF接種劑量梯度

接種AMF后，苗期管理期間不進行遮光處理.當水分蒸發(fā)強烈時，每天向每盆幼苗澆灌500 mL無菌蒸餾水.當水分蒸發(fā)較弱時，每3天澆灌1次500 mL的蒸餾水，直至接種120 d后菌根侵染成功.測定各處理組的菌根侵染率，隨后對米槁幼苗進行為期15 d的自然干旱脅迫處理.

1.2.2 指標測定

每個處理隨機選取4株米槁幼苗根樣，每株選取0.2 g細根(直徑小于1 mm)，采用改進的酸性品紅和臺盼藍染色法染色，然后參照Phillips等[12]的方法測定菌根侵染率，菌根依賴性的測定參照馬放等[13]的方法.

干旱脅迫結束后，每個處理隨機選取4株長勢一致的健壯植物，對米槁幼苗葉片進行保護酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、相對含水量和丙二醛(MDA)含量的測定.超氧化物歧化酶(SOD)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、過氧化物酶(POD)活性分別采用氮藍四唑(NBT)法、紫外吸收法和愈創(chuàng)木酚法測定[14]，參照李琬婷、馬蕾等[15-16]的方法測定可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸(Pro)和丙二醛(MDA)含量，葉片相對含水量(RWC)采用烘干稱重法測定[17]，分別稱取鮮重(fresh weight, 簡稱Wf)、飽和重(saturated weight, 簡稱Wt)和干重(dry weight, 簡稱Wd)，RWC(%)=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)×100.

參照王鑫、張愛玲等[18-19]的方法，利用各抗旱指標對不同接菌量處理下的米槁幼苗進行隸屬函數(shù)平均值的計算，以便對其抗旱性進行評價.該平均值代表米槁的抗旱性，隸屬函數(shù)均值越大抗旱性越強.具體計算方法如下：

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013和SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，5%水平下LSD Duncan檢驗各處理平均值之間的差異顯著性.采用單因素重測方差分析法進行差異顯著性分析.

2 結果與分析

2.1 菌根侵染

接種120 d后，層狀球囊霉和幼套球囊霉不同接菌劑量處理下的米槁幼苗根際均檢測出菌根真菌的存在(圖1)，無菌對照組米槁根系壓片中未發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌的侵染.通常，增加接菌劑量能夠提高內(nèi)生真菌的侵染率，但接菌劑量高于40 g時，兩種AMF在米槁幼苗根系的侵染率隨著接菌量的增加逐漸降低(表2).以40 g劑量接種層狀球囊霉和幼套球囊霉時菌根的侵染率最高，與米槁的共生力最強，在一定程度上提高了米槁幼苗的抗旱性.

左圖：層狀球囊霉；右圖：幼套球囊霉.

表2 AMF不同接菌量下的菌根侵染率 %

2.2 相對含水量的變化

接種不同劑量的AMF菌種后，干旱脅迫下的米槁幼苗葉片相對含水量都高于無菌對照組，如圖2所示，在(73.77%±0.96%)～(89.51%±0.69%)之間波動，整體呈現(xiàn)出一個先上升后下降的規(guī)律.接種層狀球囊霉時，低劑量(20 g)和高劑量(100 g)接菌組處理下的葉片相對含水量低于其他接菌組，且兩個處理間無顯著性差異；接種幼套球囊霉時，40 g接菌組的葉片相對含水量最高，隨著接菌劑量的增加，米槁幼苗葉片相對含水量隨之降低，60 g與100 g接菌量接種的米槁幼苗葉片相對含水量無顯著性差異.

曲線上不同字母代表同一菌種的不同接菌量處理組之間具有差異顯著性(p<0.05).

2.3 葉片保護酶活性的變化

2.3.1 SOD活性

接種AMF并持續(xù)干旱脅迫15 d后，不同接菌量處理下米槁幼苗葉片SOD活性均顯著高于無菌對照組(p<0.05)，在(153.89±1.05)～(198.06±1.36)U·g-1之間波動，如圖3(a)所示.以20 g接菌量接種層狀球囊霉的米槁幼苗葉片SOD活性最高，60 g接菌量與20g接菌量處理間差異不顯著，40 g與100 g接菌量處理組的SOD活性則顯著低于20 g接菌量處理組的；幼套球囊霉各接菌組葉片的SOD活性隨著接菌劑量的增加逐漸下降.

2.3.2 CAT活性

米槁幼苗葉片的CAT活性受AMF接菌劑量的影響，在(54.24±3.08)～(277.98±8.58)U·g-1之間浮動，如圖3(b)所示.以40 g劑量接種層狀球囊霉的米槁幼苗葉片CAT活性顯著高于其他接菌組，比對照組高了205.66 U·g-1，而用100 g的劑量接種層狀球囊霉時，接種組的葉片CAT活性顯著低于對照組；幼套球囊霉60 g劑量接菌組接種的米槁幼苗CAT活性顯著高于其他劑量接菌組.總體來說，與無菌對照組相比，接種不同AMF菌劑后米槁幼苗的CAT活性有了顯著性增高，隨著接菌量的增加，CAT的活性又隨之下降.

2.3.3 POD活性

干旱脅迫15 d后，AMF兩個菌種不同接菌劑量處理下米槁幼苗葉片POD活性發(fā)生了顯著的變化，總體上高于對照組，如圖3(c)所示.接種Gl時，60 g接菌量處理下葉片的POD活性最高，100 g接菌量處理下的POD活性最低；以40 g劑量接種幼套球囊霉的米槁幼苗POD活性最高.總體而言，高接菌量處理的米槁幼苗POD活性不高，對米槁的抗旱性促進作用較弱甚至起到抑制作用.

圖中不同字母代表同一菌種的不同接菌量處理組之間具有差異顯著性(p<0.05).

2.4 滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的響應

2.4.1 可溶性糖含量變化

如圖4(a)所示，持續(xù)干旱脅迫15 d后，與對照組相比，AMF兩種真菌不同劑量接種處理下可溶性糖(SS)含量有了不同程度的增加，以20 g劑量接種層狀球囊霉的米槁幼苗可溶性糖含量最低，可溶性糖含量隨接菌劑量的增加而增加，但各劑量接菌組間無顯著性差異；接種不同劑量的幼套球囊霉時，40 g接種組的可溶性糖含量最高，20 g低劑量和100 g高劑量接種組的可溶性糖含量較低.

2.4.2 可溶性蛋白含量變化

不同劑量接種處理下的米槁幼苗葉片可溶性蛋白(SP)含量在(8.91±0.21)～(12.83±0.41)mg·g-1之間波動，如圖4(b)所示.接種層狀球囊霉和幼套球囊時，隨著接菌劑量的增加米槁幼苗的SP含量逐漸增加，60 g劑量接種的米槁幼苗SP含量顯著高于其他接菌組；層狀球囊霉100 g高劑量接種下的米槁幼苗SP含量最低，幼套球囊霉20 g低劑量接菌處理下的SP含量與對照組的差異性不顯著.由此可見接菌劑量過高或者過低都不利于提高米槁的抗旱性.

2.4.3 游離脯氨酸含量變化

接種AMF后的米槁幼苗游離脯氨酸(Pro)含量顯著高于無菌對照組，如圖4(c)所示.接種層狀球囊霉和幼套球囊霉的葉片游離Pro變化趨勢一致，Pro含量隨接菌量的增加而上升，高于60 g則開始下降，以60 g劑量接種AMF時，米槁幼苗的Pro含量顯著高于其他劑量接菌組.接菌量低于40 g時，接種層狀球囊霉的葉片Pro含量高于接種幼套球囊霉的葉片，接菌量高于40 g時則反之.

圖中不同字母代表同一菌種的不同接菌量處理組之間具有差異顯著性(p<0.05).

2.4.4 MDA含量變化

干旱脅迫15 d后，AMF兩個菌種不同劑量接種處理下米槁幼苗葉片丙二醛(MDA)的含量在(25.95±0.73)～(46.16±1.19)nmol·g-1之間波動，并且明顯低于無菌對照組(70.54 nmol/g)，如圖5所示.以不同接菌劑量接種Gl，Ge時，40 g接菌組的MDA含量最低，MDA含量最高的為100 g接種組.

圖中不同字母代表同一菌種的不同接菌量處理組之間具有差異顯著性(p<0.05).

2.5 抗旱性綜合評價

通過盆栽接種試驗，研究了AMF不同接菌劑量下米槁葉片相對含水量、可溶性糖、游離脯氨酸等指標的差異.使用隸屬函數(shù)法比較了AMF不同接菌劑量下米槁抗旱性的強弱，由表3可知，各接菌量下米槁抗旱性強弱由大到小依次為：40 g Gl>40 g Ge>60 g Ge>60 g Gl>20 g Ge>100 g Ge>20 g Gl>100 g Gl.

表3 抗旱性相關生理指標的隸屬函數(shù)值及排序

3 討論與結論

植物在干旱環(huán)境中用于保存水分的機制是其耐受干旱能力的關鍵.根外菌絲可擴大植株根系吸收范圍, 促進植株對水分及土壤礦質(zhì)元素的吸收和利用[11，20].該研究中，接種層狀球囊霉和幼套球囊霉的米槁幼苗葉片相對含水量高于未接菌對照組，當接菌量為 40 g時，米槁幼苗的相對含水量最高.說明層狀球囊霉和幼套球囊霉提高了干旱環(huán)境中米槁對土壤水分的利用率，增強了其抗旱性.

當植物遭遇長期干旱脅迫時，其代謝過程中產(chǎn)生活性氧的途徑與活性氧清除系統(tǒng)失衡，導致活性氧數(shù)量增多，嚴重損壞細胞膜系統(tǒng)從而破壞植物的防御機制[21].然而，接種AMF有助于緩解過氧化對植物細胞造成的損害.筆者的研究結果表明，在干旱脅迫下，接種層狀球囊霉和幼套球囊霉的米槁幼苗的SOD 和 POD活性增加，MDA積累減少，但以100 g高劑量接種AMF的兩個菌種時米槁幼苗的CAT活性低于未接菌對照組，說明AMF高劑量接種對提高米槁幼苗抗旱性的促進作用較弱，這與以往得出的研究結果相似[22-24].此外，接種AMF還可以提高滲透調(diào)節(jié)的水平，減緩干旱脅迫對植物的傷害.在該研究中，接菌促進了米槁幼苗可溶性糖、游離脯氨酸和可溶性蛋白的合成，接菌后的米槁幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)高于未接菌對照組，這與賀學禮等[10]對菌根化民勤絹蒿的研究結果一致.

接菌劑量能調(diào)控植物的抗旱性早已被證實[25].在筆者的研究中，接菌量對米槁耐旱性最直接的影響是AMF在米槁幼苗根部的定殖率(表2).接種量的增加會提高層狀球囊霉和幼套球囊霉的定殖率.由抗旱性綜合評價可知，當層狀球囊霉和幼套球囊霉以40 g劑量接種時，觀察到最強的抗旱性(表3).然而，60 g 和100 g的層狀球囊霉和幼套球囊霉的接種量對米槁幼苗抗旱生理指標的提升顯著低于其他接菌組，即接種孢子的密度較高可能會降低或抑制植物抵御干旱的性能[26].這些發(fā)現(xiàn)對處于西南喀斯特地區(qū)干旱生長環(huán)境的早期幼苗具有重要意義[27].

以往相關研究對叢枝菌根真菌的接種量沒有統(tǒng)一的定論，有的用接種勢來表示，有的用單位面積孢子密度和菌劑質(zhì)量來表示的，也有研究用單位體積孢子密度來表示[28-30]，但是在實際規(guī)?；a(chǎn)應用中，所用AMF菌種經(jīng)富集培養(yǎng)，菌劑除含有孢子外還包含菌絲、泡囊、菌根段等多種繁殖體，而且孢子定量工作費時費力甚至難以準確測定菌劑孢子密度，給造林工作帶來不便.因此，筆者選擇傳統(tǒng)的孢子含量作為接種質(zhì)量的評價指標，在該研究中，40 g接菌量對提高層狀球囊霉和幼套球囊霉的定殖率、米槁的抗旱性效果最佳.