張飛翔，金葆康

(安徽大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，安徽 合肥 230601)

抗壞血酸(ascorbic acid，簡(jiǎn)稱AA)，通常稱為維生素C，是人類和動(dòng)物進(jìn)行代謝反應(yīng)所需的重要化合物.AA對(duì)正常組織的生長(zhǎng)、健康的細(xì)胞發(fā)育和自由基清除具有至關(guān)重要的作用[1-2].尿酸(uric acid,簡(jiǎn)稱UA)水平升高可能導(dǎo)致痛風(fēng)、高尿酸血癥、肥胖、非酒精性脂肪肝和慢性腎臟病[4-5].

快速準(zhǔn)確地測(cè)定AA和UA含量，是人們普遍關(guān)注的問(wèn)題.目前，已經(jīng)報(bào)道了多種定量分析檢測(cè)AA和UA的方法，例如，離子色譜法[6]、高效液相色譜[7]、比色法[8]和化學(xué)發(fā)光法[9]等.但是，這些方法費(fèi)用高昂、費(fèi)時(shí)和操作復(fù)雜.具有靈敏度高、檢出限低、成本低等優(yōu)點(diǎn)的電化學(xué)傳感器受到了研究者的喜愛(ài).抗壞血酸和尿酸都是電化學(xué)活性化合物，在水溶液中易被氧化，循環(huán)伏安法、差示脈沖伏安法、計(jì)時(shí)電流法和方波伏安法等電化學(xué)技術(shù)通常用于抗壞血酸和尿酸的檢測(cè).

硫堇(thionine，簡(jiǎn)稱Thi)是一種噻嗪類堿性染料[10]，它具有很好的電化學(xué)活性，是電化學(xué)傳感器優(yōu)良的基底材料和電催化劑[11].Lai等[12]將硫堇和磁性殼聚糖微球修飾在玻碳電極表面制備生物傳感器來(lái)實(shí)現(xiàn)同時(shí)靈敏地對(duì)多巴胺和尿酸的檢測(cè)，Sohrabnejad等[13]利用嵌入在聚氯乙烯(PVC)基體中的離子對(duì)絡(luò)合物硫堇-鎢磷酸鹽修飾電極通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)添加方法間接測(cè)定抗壞血酸.Sun等[14]報(bào)道了將尿酸氧化酶和硫堇-氧化石墨烯雜化納米片固定在玻碳電極上來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)尿酸的檢測(cè).

盡管已有報(bào)道對(duì)AA和UA進(jìn)行靈敏度和選擇性的檢測(cè)，但在常規(guī)電極上由于AA和UA的氧化峰重疊，同時(shí)緩慢的電子轉(zhuǎn)移動(dòng)力學(xué)及由其氧化產(chǎn)物引起的嚴(yán)重電極污染給電化學(xué)選擇性測(cè)量AA和UA的濃度造成了很大的困難[15].

筆者利用納米金(gold nanoparticles，簡(jiǎn)稱AuNPs)、硫堇/科琴黑(Ketjen black，簡(jiǎn)稱KB)修飾玻碳電極，開展AA和UA濃度的電化學(xué)檢測(cè).結(jié)果表明，硫堇/科琴黑復(fù)合物因其良好的電化學(xué)活性，能夠加快電子轉(zhuǎn)移，納米金具有良好的生物相容性和電催化活性[16]，兩者共同修飾，產(chǎn)生協(xié)同催化作用，實(shí)現(xiàn)較低的過(guò)電位下AA和UA的電催化氧化，以期得到分離明顯的AA和UA的氧化峰，擴(kuò)寬檢測(cè)方法的線性范圍，提高檢測(cè)方法的抗干擾能力及靈敏度等.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

硫堇(Thi)、科琴黑(KB)、抗壞血酸(AA)、尿酸(UA)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、半胱氨酸、多巴胺、NaCl、葡萄糖，均為分析級(jí)試劑.用Milli-Q水(18.2 MΩcm，Millipore)配置溶液.

循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)在CHI 660D電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行，采用傳統(tǒng)的三電極體系，鉑絲為對(duì)電極，Ag/AgCl電極用作參比電極，直徑3 mm的修飾玻碳電極(glassy carbon electrode，簡(jiǎn)稱GCE)用作基底電極.

1.2 Thi-KB納米復(fù)合材料的制備

參考文獻(xiàn)[17]制備Thi/KB納米復(fù)合材料.將1 mg KB和2 mg Thi分散在1 mL蒸餾水中.通過(guò)在室溫下至少6 h超聲處理形成Thi/KB納米復(fù)合材料.然后通過(guò)離心和連續(xù)水洗3次形成納米復(fù)合材料.將獲得的Thi/KB納米復(fù)合物再分散在1 mL蒸餾水中用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn).

1.3 AuNPs/Thi/KB修飾的玻碳電極(GCE)的制備

在修飾Thi/KB納米復(fù)合材料之前，先用0.05 μm和0.3 μm的氧化鋁漿料拋光GCE(直徑3 mm)，然后用水沖洗，再分別于去離子水和酒精中超聲清洗10 min，用氮?dú)獯蹈珊?，? μLThi/KB納米復(fù)合物懸浮液滴涂到GCE電極上，空氣干燥.然后將Thi/KB/GCE在含有2 mg·mL-1的HAuCl4溶液中進(jìn)行電化學(xué)沉積[18]，電位為-0.2 V，持續(xù)300 s.將得到的電極標(biāo)記為AuNPs/Thi/KB/GCE.電極使用前，二次水洗滌、氮?dú)獯祾吒稍?

利用類似方法，同時(shí)制備了納米金修飾玻碳電極(AuNPs/GCE)，Thi/KB/納米金修飾的玻碳電極(先沉積納米金，再修飾Thi/KB，最后得到Thi/KB/AuNPs/GCE)，以及Thi/KB修飾的玻碳電極(Thi/KB/GCE).

2 結(jié)果與討論

2.1 Thi-KB復(fù)合材料的形貌表征

利用SEM觀察KB,Thi,Thi/KB和AuNPs/Thi/KB修飾電極的表面形貌，結(jié)果如圖1所示.

圖1 KB(a),Thi(b),Thi/KB(c),AuNPs/Thi/KB(d)修飾電極的SEM圖

圖1顯示，KB修飾電極表面為小球狀(圖1(a)),而Thi在電極表面為典型的針狀晶體(圖1(b)),圖1(c)顯示制備的Thi/KB納米復(fù)合材料在電極表面呈現(xiàn)為小球與針狀晶體的組合體；進(jìn)一步，在Thi/KB復(fù)合材料修飾電極上電沉積HAuCl4溶液后，可以觀察到顆粒直徑約60 nm的納米金生成(圖1(d))，表明電化學(xué)還原可成功將AuNPs均勻地修飾至復(fù)合材料表面，有利于提升電子轉(zhuǎn)移速率[19].

2.2 修飾電極性能的研究

在0.2 mol·L-1PBS(pH 7.0)溶液中，利用循環(huán)伏安法研究1 mmol·L-1AA和1 mmol·L-1UA在幾種不同修飾電極上的電化學(xué)行為，結(jié)果如圖2所示.

圖中曲線a為GCE，b為AuNPs/GCE，c為Thi/KB/AuNPs/GCE，d為Thi/KB/GCE(d)，e為AuNPs/Thi/KB/GCE；掃速為10 mV·s-1.

由圖2可知，在實(shí)驗(yàn)條件下AA和UA在5種電極表面均發(fā)生不可逆的電化學(xué)氧化.相比于裸玻碳電極，在AuNPs/GCE和Thi/KB/GCE修飾電極上，AA和UA的氧化峰均發(fā)生顯著正移，且氧化峰電流增大，表明AuNPs和Thi/KB的修飾，均降低氧化過(guò)電位，加速電子轉(zhuǎn)移速率.AuNPs/Thi/KB/GCE(曲線e)與先電沉積修飾AuNPs再修飾Thi/KB(Thi/KB/AuNPs/GCE，曲線c)相比，前者在電化學(xué)氧化AA和UA均表現(xiàn)出更大的氧化電流.可能是在玻碳電極表面先電沉積的AuNPs被隨后修飾的Thi/KB所覆蓋，抑制了AuNPs對(duì)AA和UA催化氧化作用.而在AuNPs/Thi/KB/GCE電極上(曲線e)，展現(xiàn)出更低的氧化峰過(guò)電位和更大的氧化峰電流.這可能得益于AuNPs大的比表面積、良好的導(dǎo)電性以及表面的快速電子轉(zhuǎn)移[19]，而Thi/KB上的NH2，通過(guò)氫鍵與AA和UA作用，電子通過(guò)N…H…O傳遞，降低了氧化過(guò)電位，促進(jìn)了其電化學(xué)氧化還原.AuNPs和Thi/KB的協(xié)同作用，使得AuNPs/Thi/KB/GCE電極表現(xiàn)出最佳電催化性能.

進(jìn)一步利用CV考察了AuNPs/Thi/KB/GCE電極上AA和UA電化學(xué)性能，結(jié)果如圖3所示.

a→i掃速分別為10，20，30，50，70，80，100，130，150 mV·s-1.

由圖3可知，AA和UA均呈現(xiàn)為不可逆氧化過(guò)程，隨電位掃速增加，AA和UA的峰電位略有正移，氧化峰電流增大，且峰電流值與掃速的平方根呈線性關(guān)系，表明氧化電流受擴(kuò)散控制.進(jìn)一步說(shuō)明AA和UA受AuNPs和Thi-KB的協(xié)同催化作用，在修飾電極上具有較快的電子轉(zhuǎn)移速率.

2.3 條件優(yōu)化

2.3.1 電沉積納米金的時(shí)間

考察修飾納米金的電化學(xué)沉積時(shí)間對(duì)電極電化學(xué)行為的影響.定義氧化電流變化值：△I=(Ip′-Ip0)/Ip0×100%(Ip0，Ip′分別表示納米金修飾前、后氧化峰電流值).考察△I隨沉積時(shí)間的變化關(guān)系，結(jié)果如圖4所示.

圖4 Thi/KB/GCE上沉積不同時(shí)間納米金時(shí)在AA和UA緩沖溶液中的氧化峰電流值增大的比例曲線(電位為-0.2 V)

由圖4可知，當(dāng)電沉積納米金時(shí)間小于300 s時(shí)，AA和UA在AuNPs/Thi/KB/GCE上氧化峰電流隨沉積時(shí)間增加逐漸增大，在300 s時(shí)達(dá)到最大，當(dāng)電沉積納米金超過(guò)300 s時(shí)，氧化峰電流又逐漸減小.可能的原因是，當(dāng)電沉積納米金時(shí)間小于300 s時(shí)，隨著電沉積時(shí)間的增加，電極表面的AuNPs顆粒逐漸增多，增大了修飾電極的表面積，加速了電子傳遞速率，當(dāng)電沉積時(shí)間超過(guò)300 s時(shí)，隨著納米金的沉積，在電極表面形成致密的金膜，減小了Thi/KB與AA和UA的直接接觸，從而降低其電催化能力，導(dǎo)致電流減小.故選取電沉積300 s為最佳沉積時(shí)間.

2.3.2 緩沖溶液pH

考察了緩沖溶液pH對(duì)AA和UA在修飾電極表面的電化學(xué)行為的影響.利用循環(huán)伏安法分別研究不同pH下，PBS溶液中AA和UA在修飾電極上的伏安行為，結(jié)果如圖5(a)(c)所示.由圖可知：隨著緩沖溶液pH的升高，AA和UA的氧化峰電位負(fù)移，并且AA和UA的氧化峰電位與pH呈線性關(guān)系，斜率為-51.06 mV·pH-1(AA，圖5(b))和-58.91 mV·pH-1(UA，圖5(d)).該值接近-59.2 mV·pH-1的理論值.表明AA和UA在修飾電極上的電化學(xué)氧化為等質(zhì)子等電子過(guò)程[19-23].

圖5 不同pH下1 mmol·L-1AA(a)和1 mmol·L-1UA(c)在AuNPs/Thi/KB/GCE上的CV圖；AA(b)和UA(d)氧化峰電位與pH的關(guān)系

2.4 定量分析

在優(yōu)化條件下，利用差分脈沖伏安法研究AuNPs/Thi/KB/GCE對(duì)AA和UA的同時(shí)電化學(xué)檢測(cè)，結(jié)果如圖6所示.

圖(a)中a→k表示AA濃度分別為0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，3，4，5 mmol·L-1；圖(c)中a→j表示UA濃度分別為0.002，0.005，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，0.8，1 mmol·L-1.

圖6表明，保持AA或者UA的濃度不變，另一種物質(zhì)的峰電流值隨著其自身濃度的升高而線性增大，AA氧化峰電位在0 V左右，UA氧化峰電位在0.3 V左右，兩者氧化電位差達(dá)到300 mV，呈現(xiàn)完全獨(dú)立的2個(gè)氧化峰.AA的氧化峰電流與其濃度在5×10-3～1×10-5mol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為：i=13.885+13.512cAA，相關(guān)系數(shù)r=0.995，校準(zhǔn)曲線的斜率為13.512 μA·(mol·L-1)-1，靈敏度為191.16 μA·(mol·L-1)-1·cm-2，檢出限為1.30×10-6mol·L-1(S/N=3).UA的氧化峰電流與其濃度在1×10-3～2×10-6mol·L-1范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為：i=0.031+92.05cUA，相關(guān)系數(shù)r=0.992 6，校準(zhǔn)曲線的斜率為92.05 μA·(mol·L-1)-1,靈敏度為 302.24 μA·(mol·L-1)-1·cm-2，檢出限為6.32×10-7mol·L-1(S/N=3).

將筆者所制備的電化學(xué)傳感器的性能與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的AA和UA電化學(xué)傳感器進(jìn)行比較，結(jié)果如表1～2所示.

表1 不同AA電化學(xué)傳感器的檢測(cè)性能

表2 不同UA電化學(xué)傳感器的檢測(cè)性能

由表1～2可知，制備的電化學(xué)傳感器具有較寬的線性范圍和較低的檢出極限，可以實(shí)現(xiàn)AA和UA的同時(shí)檢測(cè).表明所制備的傳感器具有較好的同時(shí)檢測(cè)AA和UA的能力.

2.5 傳感器的抗干擾性、重復(fù)性和穩(wěn)定性

利用差分脈沖伏安技術(shù)研究了葡萄糖、氯化鈉、多巴胺和半胱氨酸對(duì)AA和UA測(cè)定的干擾.分別加入2.5倍濃度葡萄糖、氯化鈉、多巴胺和半胱氨酸作為干擾物，考察干擾物的加入對(duì)峰電流的影響，結(jié)果如圖7所示.

橫坐標(biāo)上1為加入干擾物前的UA(左側(cè)柱)和AA(右側(cè)柱)；2～5分別為加入干擾物2.5 mmol·L-1葡萄糖、2.5 mmol·L-1氯化鈉、1 mmol·L-1多巴胺、2.5 mmol·L-1半胱氨酸的UA(左側(cè)柱)、AA(右側(cè)柱).

由圖7可以發(fā)現(xiàn)，干擾物加入前后，AA和UA氧化峰電流值變化均小于5%，表明該修飾電極對(duì)AA和UA的檢測(cè)都具有良好的抗干擾性.

修飾電極回收率測(cè)試結(jié)果如表3～4所示.

表3 AA回收率的測(cè)定

表4 UA回收率的測(cè)定

由表3～4可知，AA回收率在97%～105%范圍內(nèi)，UA回收率在95%～103%范圍內(nèi)，表明修飾電極準(zhǔn)確性良好，可應(yīng)用于在實(shí)際樣品中對(duì)AA和UA的檢測(cè).

修飾電極制備的平行性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果如圖8所示.

圖8 AA(a)和UA(b)在4根平行AuNPs/Thi/KB/GCE上立刻測(cè)定(左側(cè)柱)和放置一周之后(右側(cè)柱)測(cè)定的氧化峰電流值

圖8顯示，對(duì)于AA和UA的檢測(cè)，4根平行電極的氧化峰電流值相差小于8%，表明該電極具有很好的可重現(xiàn)性，在放置一周之后，AA和UA的氧化峰電流降低小于10%，顯示修飾電極具有較好的穩(wěn)定性.

3 結(jié)束語(yǔ)

基于硫堇/科琴黑復(fù)合物滴涂在玻碳電極上，然后電沉積納米金，成功地制備了可同時(shí)定量檢測(cè)抗壞血酸和尿酸的AuNPs/Thi/KB/GCE修飾電極.研究結(jié)果表明AuNPs和Thi/KB均可獨(dú)自催化抗壞血酸和尿酸的電化學(xué)氧化，而AuNPs/Thi/KB/GCE修飾電極表現(xiàn)出更高的電催化氧化效果，表明兩者可能存在協(xié)同催化作用.該傳感器制作過(guò)程簡(jiǎn)單，具有較寬檢測(cè)線性范圍、較低的檢出限和同時(shí)檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn).