毛銀楓,崔松香,華臻,彭竑程,王建偉

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院,江蘇 南京210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院骨傷科,江蘇 無錫 214072)

骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量低和骨組織的微細(xì)結(jié)構(gòu)退化為特征的全身骨骼疾病,研究顯示,我國骨質(zhì)疏松的患病率為6.6%～19.3%[1]。骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture,OPF)是由骨質(zhì)疏松癥導(dǎo)致的骨折,常見于55歲以上的女性和 60歲以上男性,易導(dǎo)致大量與骨骼相關(guān)的疾病,并增加患者死亡率和醫(yī)療費用[2]。中醫(yī)藥防治OPF具有獨特優(yōu)勢[3-4],從脾論治已廣泛應(yīng)用于臨床,但缺少確切機(jī)制研究以闡明其科學(xué)性。本研究選取健脾的常用藥對黃芪-白術(shù)作為研究對象,探討其治療OPF的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 篩選黃芪-白術(shù)藥對活性成分

使用TCMSP數(shù)據(jù)庫[5](https://tcmspw.com/tcmsp.php),分別以“黃芪”“白術(shù)”為檢索詞,檢索藥對的全部活性成分?jǐn)?shù)據(jù),以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%,類藥性(drug likeness,DL)≥0.18為篩選條件[6],篩選出藥對活性成分及其對應(yīng)靶點。

1.2 篩選OPF疾病靶點

分別檢索GeneCards(https://www.genecards.org/),OMIM(http://www.omim.org/),TTD(http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)數(shù)據(jù)庫,檢索詞為“osteoporotic fracture”,合并后刪除重復(fù)條目,以獲得目前已知的與OPF相關(guān)的人類靶點。

1.3 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)及篩選關(guān)鍵靶點

應(yīng)用R語言篩選藥對靶點和OPF靶點的交集,使用String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)上傳交集靶點,并進(jìn)一步篩選關(guān)鍵靶點。

1.4 構(gòu)建藥對-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

使用Cytoscape 3.7.1,將篩選的靶點導(dǎo)入軟件,繪制藥對有效成分作用于OPF相關(guān)靶點的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。

1.5 富集分析

利用DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進(jìn)一步分析關(guān)鍵靶點蛋白在基因功能中的作用,對關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO生物學(xué)過程與KEGG代謝通路富集分析,并將富集分析結(jié)果以氣泡圖的形式展示。其中,不同類型富集結(jié)果以不同顏色節(jié)點表示,氣泡大小表示富集程度是否顯著。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義[7]。

1.6 分子對接驗證

取“藥對-活性成分-靶點-OPF”網(wǎng)絡(luò)度值排名前6的活性成分及PPI網(wǎng)絡(luò)度值排名前5的靶點蛋白進(jìn)行分子對接驗證。大蛋白受體3D結(jié)構(gòu)從PDB數(shù)據(jù)庫下載,小分子配體從TCMSP數(shù)據(jù)庫獲得,然后使用PyMOL軟件對關(guān)鍵靶點蛋白進(jìn)行去水、加氫等操作,分子對接通過AutoDockTools 1.5.6、AutoDock Vina軟件實現(xiàn),結(jié)合能記錄在Excel表格中。

2 結(jié)果

2.1 篩選藥物成分及其靶點

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選黃芪-白術(shù)所有成分68個,以O(shè)B≥30%,DL≥0.18為篩選條件,共篩選出有效成分19個,主要為葡萄糖苷、常春藤素、異鼠李素、槲皮素、芒柄花素、山奈酚等,相對應(yīng)的作用靶點176個,主要為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1、誘導(dǎo)型氧化亞氮合酶、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(JUN)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)等。

2.2 篩選OPF相關(guān)靶點

通過檢索GeneCards、OMIM、TTD數(shù)據(jù)庫,檢出OPF已知的人類相關(guān)靶點分別為2 903個、64個、0個,合并、刪除重復(fù)數(shù)據(jù)后,共納入2 953個OPF相關(guān)靶點。

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)及分析

運用R語言VennDiagram數(shù)據(jù)包篩選出黃芪-白術(shù)藥對有效成分對應(yīng)的靶點和OPF相關(guān)靶點的交集靶點,由此篩選出115個交集核心靶點。將靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫平臺預(yù)測蛋白相互作用關(guān)系,結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出,進(jìn)一步使用Cytoscape 3.7.1軟件進(jìn)行分析,導(dǎo)入交集核心靶點,分析靶點之間相互的作用關(guān)系,大于等于度值中位數(shù)2倍(14)的節(jié)點即為核心靶基因,最后得到24個核心靶基因,分別為腫瘤壞死蛋白P53(TP53)、絲裂原活化蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase-1,MAPK1)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、絲裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)等,提示其可能是黃芪-白術(shù)治療OPF的關(guān)鍵靶點。

2.4 構(gòu)建藥對-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

借助DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芪-白術(shù)藥對中對OPF有治療作用的潛在靶點進(jìn)行GO富集分析,使用Cytoscape 3.7.1導(dǎo)入19個活性成分、115個交集靶點、藥對和OPF,構(gòu)建藥對-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)(圖1)。圖中藍(lán)色代表共同靶點,橙色代表藥對活性成分,連線分別表示相互作用關(guān)系,與靶點連接較多的活性成分主要有槲皮素(quercetin)、山奈酚(kaempferol)、刺芒柄花素(formononetin)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、異鼠李素(isorhamnetin)、毛蕊異黃酮(calycosin)等。

圖1 藥對-有效成分-靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)

2.5 富集分析

借助DAVID數(shù)據(jù)庫對黃芪-白術(shù)藥對中對OPF有治療作用的潛在靶點進(jìn)行GO富集分析,設(shè)定P值<0.05,共獲得568條生物過程或通路,其中433個與生物過程相關(guān)、92個與分子功能相關(guān)、43個與細(xì)胞組分相關(guān)。選取P值較小的前20條GO條目,繪制氣泡圖(圖2),靶點主要涉及DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、核受體激活、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等生物過程。

圖2 GO功能富集分析氣泡圖

本研究KEGG分析共獲得111條通路(P<0.05),選取P值較小的前20條通路,并進(jìn)行可視化。黃芪-白術(shù)OPF核心基因的KEGG通路主要涉及的信號通路見圖3。

圖3 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.6 分子對接驗證

將PPI網(wǎng)絡(luò)中度值排名前5的靶點蛋白(JUN、AKT1、TP53、MAPK1、RELA)分別與“藥對-活性成分-關(guān)鍵靶點-OPF”網(wǎng)絡(luò)中排名前6的活性成分(quercetin、kaempferol、formononetin、7-O-methylisomucronulatol、isorhamnetin、calycosin)進(jìn)行分子對接(圖4)。對接評分越低,配體與受體結(jié)合性越好,其中對接評分<-4.25 kcal/mol可認(rèn)為配體與靶點之間具有結(jié)合活性,評分<-5.0 kcal/mol表明結(jié)合活性較好,評分<-7.0 kcal/mol表明兩者之間有強(qiáng)烈的對接活性。黃芪-白術(shù)藥對中的關(guān)鍵活性成分與OPF核心靶點對接能量均<-6.0 kJ/mol,表明黃芪-白術(shù)藥對活性成分能較好地與OPF相關(guān)靶點結(jié)合,潛在生物活性高。取其中對接結(jié)果較好的quercetin與MAPK1(結(jié)合能-9.1 kcal/mol)、calycosin與MAPK1(結(jié)合能-9.0 kcal/mol)、calycosin與RELA(結(jié)合能-8.9 kcal/mol)、isorhamnetin與MAPK1(結(jié)合能-8.9 kcal/mol)進(jìn)行對接結(jié)果可視化,以探究受體蛋白與配體小分子之間的結(jié)合模式(圖5)。

圖4 分子對接結(jié)合能熱圖(kcal/mol)

圖5 關(guān)鍵成分與核心靶點之間的對接構(gòu)象

3 討論

從中藥-成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)圖中可以看出,黃芪-白術(shù)治療OPF的活性成分以槲皮素、刺芒柄花素、山奈酚為主,AKT1、MAPK1、TNF、IL-6、MAPK14等為篩選出的核心靶點。槲皮素能抑制NF-κB受體活化因子配體(RANKL)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成、成骨細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng),同時能夠促進(jìn)成骨、血管生成、抗氧化表達(dá)、脂肪細(xì)胞凋亡和破骨細(xì)胞凋亡,可能的潛在機(jī)制包括調(diào)控NF-κB等依賴的凋亡途徑以及內(nèi)源性和外源性的凋亡通路。另一方面,槲皮素能夠在MAPK通路上發(fā)揮復(fù)雜的作用,從而協(xié)調(diào)骨代謝。研究表明槲皮素能夠降低TNF-α、IL-6等促炎因子的表達(dá),升高IL-10抗炎因子的表達(dá),由此調(diào)控炎癥反應(yīng),進(jìn)而調(diào)控骨重塑[8]。綜上,槲皮素對OPF的治療是一個綜合作用。刺芒柄花素是一種植物雌激素,表現(xiàn)出不同程度的雌激素受體激動性,能夠顯著增加成骨細(xì)胞中骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP-2)的水平,同時增加Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子-2(Runx-2)的表達(dá)[9]。此外,刺芒柄花素能夠顯著抑制破骨細(xì)胞骨吸收相關(guān)的功能基因酒石酸鹽酸性磷酸酶(TRAP),基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)和碳酸酐酶2(Car2)等表達(dá)[10]。山奈酚能夠通過上調(diào)BMP-2的表達(dá),使p38MAPK等磷酸化,同時使堿性磷酸酶(ALP)等高表達(dá),從而促進(jìn)成骨作用。山奈酚可能促進(jìn)下游信號分子包括磷酸肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和MAPK的激活,促進(jìn)雌激素受體信號的激活,由此抑制炎性細(xì)胞因子,誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡產(chǎn)生對OPF的治療作用。此外,山奈酚還具有一定的抗炎作用,通過抑制NF-κB的核易位降低促炎因子的水平并提高抗炎因子的水平,從而對成骨細(xì)胞發(fā)揮抗炎作用,促進(jìn)骨形成[11]。研究表明,健脾中藥能夠抑制RANKL生成,進(jìn)而抑制骨吸收,同時促進(jìn)骨保護(hù)素產(chǎn)生,干擾RANKL信號傳導(dǎo)的同時促進(jìn)骨形成[12]。

本研究結(jié)果表明,黃芪-白術(shù)的主要有效成分可通過多個靶點、多個信號通路影響OPF的發(fā)生。黃芪-白術(shù)治療OPF的關(guān)鍵靶點主要是MAPK1、TNF、MAPK14、IL-6等,這些基因可通過影響DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、核受體活性、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性等來調(diào)控OPF的發(fā)生,即主要影響細(xì)胞因子及細(xì)胞因子受體、轉(zhuǎn)錄因子等從分子水平上促進(jìn)骨折愈合[13]。

黃芪-白術(shù)治療OPF的核心基因的KEGG通路眾多,TNF通過抑制成骨細(xì)胞分化來抑制骨形成。在TNF介導(dǎo)的炎癥環(huán)境中,TNF刺激間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)經(jīng)典Notch信號的激活并抑制其向成骨細(xì)胞的分化。TNF能夠增加破骨細(xì)胞骨吸收并且一定程度上減少成骨細(xì)胞骨形成[14]。NF-κB信號通路也能調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答,在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,是產(chǎn)生或抑制炎性因子的啟動子,并能調(diào)控骨重塑過程中的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞[15-16]。研究表明,Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)信號通路也與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。其中TLR4在肌肉骨骼系統(tǒng)中表達(dá),對調(diào)節(jié)其炎性環(huán)境發(fā)揮至關(guān)重要的作用,并且TLR4激活與破骨細(xì)胞生成因子聚集相關(guān)[17]。IL-17家族的細(xì)胞因子參與了很多疾病的發(fā)生發(fā)展,IL-17A在骨丟失中發(fā)揮重要作用,在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型中觀察到抗IL-17A治療能一定程度上減少骨丟失[18]。據(jù)此認(rèn)為,黃芪-白術(shù)可能主要通過調(diào)控炎癥反應(yīng)等產(chǎn)生治療OPF作用。此外,在骨修復(fù)和再生過程中,低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor,HIF-1)對血管生成和骨形成發(fā)揮關(guān)鍵作用,其中血管內(nèi)皮生長因子是HIF-1下游最有力的血管生成因子,在促進(jìn)血管生成中發(fā)揮重要作用,通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性受體結(jié)合,促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和管狀形成,提高血管通透性,改變細(xì)胞外基質(zhì)及增進(jìn)單核細(xì)胞趨化性的方式促進(jìn)血管生成[19]。

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出黃芪-白術(shù)19種活性成分及相關(guān)的176個潛在靶點,OPF疾病相關(guān)的2 953個靶點,其中交集靶點31個,對這31個靶點基因進(jìn)行PPI分析,黃芪-白術(shù)可能通過調(diào)節(jié)MAPK1、TNF、MAPK14、IL-6等靶點治療OPF,對這些靶點進(jìn)行GO富集和KEGG富集分析,黃芪-白術(shù)可能調(diào)控TNF、NF-κB、HIF-1等信號通路,發(fā)揮調(diào)控炎癥反應(yīng)及成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞等作用來治療OPF。因本研究所使用的數(shù)據(jù)完全基于現(xiàn)有的研究,旨在為實驗研究探究可能的方向,所以其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步實驗驗證。