徐偉,楊奇,陸定坤,肖釗,姜袁越,4 何大偉,孫俊,顧杰,葉洋,陸榮柱,

(1.江蘇大學醫(yī)學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013；2.南京中醫(yī)藥大學附屬鹽城市中醫(yī)院病理科,江蘇 鹽城 224001；3.鎮(zhèn)江市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院病理科,江蘇 鎮(zhèn)江 212000；4.昆山市中醫(yī)醫(yī)院病理科,江蘇 蘇州 215300；5.昆山市第一人民醫(yī)院臨床實驗研究中心,江蘇 蘇州 215300；6.昆山市第一人民醫(yī)院肝膽外科,江蘇 蘇州 215300；7.江蘇大學生命科學學院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

鈣敏感受體(calcium-sensing receptor,CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體C家族成員,在維持機體鈣穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[1]。研究表明,CaSR廣泛表達于各種類型的組織細胞中,參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡及衰老過程[2-3]。CaSR在前列腺癌[4]、乳腺癌[5]、甲狀旁腺癌[6]和結(jié)直腸癌[7]中的作用已被證實,此外,有研究發(fā)現(xiàn)肝癌易感性與CaSR變異高水平表達密切相關(guān)[8],但其在肝癌發(fā)生發(fā)展中的病理生理意義仍不明了。

近年研究發(fā)現(xiàn),來源于十字花科蔬菜的天然成分3,3′-二吲哚甲烷(3,3′-diindolylmethane,DIM)可以抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[9]。本課題組前期研究顯示,在肝癌HepG2、SMMC-7721細胞中,DIM可以通過升高細胞內(nèi)Ca2+濃度,抑制細胞增殖、促進細胞凋亡從而達到抗肝癌效果[10]。因CaSR作為維持細胞內(nèi)外鈣穩(wěn)態(tài)的重要參與者,其在DIM抗肝癌效應中的作用值得探索。本研究在探討DIM對肝癌細胞增殖、遷移及侵襲影響的基礎(chǔ)上,評價DIM對肝癌細胞CaSR表達的影響,并選用CaSR激動劑氯化釓探討CaSR對DIM抗癌效應的影響,為確定DIM的抗癌靶標提供線索。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞株購自中科院上海細胞生物學研究所；DMEM高糖培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；鏈霉素、青霉素混合液(上海碧云天生物技術(shù)公司)；DIM、MTT、二甲基亞砜(DMSO)、氯化釓(美國Sigma公司)；Transwell小室、Matrigel膠(美國BD公司)；兔抗人CaSR抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；β-肌動蛋白、羊抗兔IgG(美國Santa Cruz公司)；多聚甲醛、結(jié)晶紫染液、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測試試劑盒、一抗稀釋液、SDS-PAGE分離膠試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)

將人肝癌HepG2和SMMC-7721細胞從-80 ℃冰箱中取出,迅速在37 ℃水浴鍋中完全溶解后移至培養(yǎng)皿,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng),每天換液。待細胞密度達70%～80%時胰酶消化,以1∶2比例傳代。

1.3 細胞分組及處理

取HepG2和SMMC-7721細胞以4 000個/孔接種于96孔培養(yǎng)板,以60 000個/孔接種于6孔培養(yǎng)板,待細胞融合度達70%～80%時,按以下分組進行實驗。

細胞分為對照組和實驗組,對照組用上述高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)；實驗組加入含有不同濃度(0、20、40、60、80 μmol/L)DIM的培養(yǎng)基,處理24 h后,分別檢測細胞增殖活性、遷移侵襲能力及CaSR蛋白表達,從而篩選出合適的DIM濃度用于后續(xù)實驗。

1.4 MTT法檢測肝癌細胞增殖活性

取對數(shù)生長期細胞,按“1.3”方法處理后,接種于96孔培養(yǎng)板中,每組設6個復孔；棄去培養(yǎng)基,每孔加入100 μL MTT試劑和高糖培養(yǎng)基的混合液(0.05 g/mL),37 ℃避光孵育3～4 h；棄去培養(yǎng)基,每孔加入150 μL DMSO溶液,避光充分振蕩混勻,490 nm波長檢測光密度(D)值。

1.5 Transwell法檢測肝癌細胞遷移能力

用不用濃度(0、20、40、60、80 μmol/L)DIM分別處理HepG2和SMMC-7721細胞24 h；將細胞以7 000個/孔加至Transwell小室中,下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(不含抗生素),在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出小室,棄去其中液體,預冷PBS清洗2遍,用棉簽輕輕擦拭以去除未遷移細胞；將小室置于4%多聚甲醛中固定30 min,預冷PBS清洗2遍；結(jié)晶紫避光染色15 min；顯微鏡下每孔隨機選取至少6個視野,拍照計數(shù)。

1.6 Transwell法檢測肝癌細胞侵襲能力

將20 μL Matrigel膠與100 μL 4 ℃預冷的無血清培養(yǎng)基混合,加至Transwell小室中,37 ℃孵育4 h使其干成膠狀；0、20、40、60、80 μmol/L DIM處理HepG2和SMMC-7721細胞；將細胞以7 000個/孔加至Transwell小室中,下室加入600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基(不含抗生素),置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,后續(xù)操作同“1.5”。

1.7 蛋白免疫印跡法檢測CaSR蛋白表達

分別用0、20、40、60、80 μmol/L DIM處理HepG2和SMMC-7721細胞24 h；棄去培養(yǎng)基,預冷PBS清洗3遍,加入RIPA裂解液,冰上裂解細胞30 min以提取總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,調(diào)整至相同蛋白濃度。制備8% SDS-PAGE分離膠,80 V電泳分離蛋白1.5 h；300 mA轉(zhuǎn)90 min至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入CaSR一抗(1∶1 000)和β-肌動蛋白一抗(1∶10 000),4 ℃過夜；TBST清洗膜3次,每次5 min；二抗稀釋液(1∶10 000)搖床室溫孵育1 h;TBST清洗膜3次,每次5 min；顯影,使用Image J軟件計算條帶灰度值。

1.8 氯化釓預處理對細胞CaSR表達、細胞增殖活性及遷移侵襲能力的影響

取對數(shù)生長期HepG2和SMMC-7721細胞進行實驗,細胞分4組:對照組、60 μmol/L DIM組、300 μmol/L氯化釓組、氯化釓+DIM組。氯化釓+DIM組使用300 μmol/L氯化釓預處理30 min,棄去培養(yǎng)基,加入含60 μmol/L DIM和300 μmol/L氯化釓的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。蛋白免疫印跡法檢測CaSR蛋白表達、MTT法檢測細胞增殖活性、Transwell法檢測細胞遷移侵襲能力。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 DIM抑制肝癌細胞增殖

MTT結(jié)果顯示,在HepG2細胞中,與對照組相比,60和80 μmol/L DIM處理組細胞活力明顯降低(P<0.05)。在SMMC-7721細胞中,與對照組相比,40、60和80 μmol/L DIM組細胞活力明顯降低(P<0.05)；與40 μmol/L DIM組相比,60 μmol/L DIM組細胞活力下降更顯著(P<0.05)。DIM抑制兩株細胞活力呈現(xiàn)出濃度-效應依賴性,見圖1。據(jù)以上結(jié)果,選擇60 μmol/L DIM進行后續(xù)實驗。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與40 μmol/L DIM組比較；c:P<0.05,與60 μmol/L DIM組比較圖1 DIM對肝癌細胞增殖能力的影響

2.2 DIM抑制肝癌細胞遷移和侵襲能力

Transwell遷移實驗結(jié)果顯示,在HepG2細胞中,與對照組相比,40、60和80 μmol/L DIM組遷移細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示,與對照組相比,60和80 μmol/L DIM組侵襲細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05)；與60 μmol/L DIM組比較,80 μmol/L DIM組侵襲細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),見圖2。在SMMC-7721細胞中,與對照組相比,60和80 μmol/L DIM組遷移細胞數(shù)明顯減少(P<0.05),且60與80 μmol/L DIM組間遷移細胞數(shù)比較,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與對照組相比,40、60和80 μmol/L DIM組侵襲細胞數(shù)均明顯減少(P<0.05),見圖3。據(jù)以上結(jié)果,對兩株細胞均選擇60 μmol/L DIM進行后續(xù)實驗。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與40 μmol/L DIM組比較；c:P<0.05,與60 μmol/L DIM組比較圖2 DIM處理對HepG2細胞遷移和侵襲能力的影響(×100)

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與60 μmol/L DIM組比較圖3 DIM處理對SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力的影響(×100)

2.3 DIM降低HepG2細胞和SMMC-7721細胞中CaSR蛋白表達

蛋白免疫印跡結(jié)果顯示,與對照組相比,在HepG2細胞中,60和80 μmol/L DIM處理組CaSR蛋白表達量明顯降低(P均<0.05)；在SMMC-7721細胞中,40、60和80 μmol/L DIM組CaSR蛋白表達量明顯降低(P均<0.05)。見圖4。說明DIM處理可以抑制肝癌細胞中CaSR的表達。

2.4 氯化釓預處理逆轉(zhuǎn)DIM致HepG2和SMMC-7721細胞中CaSR蛋白表達降低

與對照組相比,DIM組兩株細胞中CaSR蛋白表達均明顯降低(P<0.05)；與DIM組相比,氯化釓+DIM組兩株細胞中CaSR蛋白表達均明顯增加(P<0.05)。見圖5。由此說明,DIM引起肝癌細胞CaSR蛋白表達下降,同時,這種下降可被CaSR激動劑緩解。

a:P<0.05,與對照組比較圖4 DIM處理對兩株肝癌細胞中CaSR蛋白表達的影響

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與DIM組比較圖5 氯化釓預處理對DIM所致肝癌細胞CaSR蛋白表達抑制的影響

2.5 氯化釓預處理逆轉(zhuǎn)DIM致HepG2和SMMC-7721細胞的增殖抑制

與對照組相比,DIM組兩株細胞活力均明顯降低(P<0.05)；與DIM組相比,氯化釓+DIM組兩株細胞活力均明顯增加(P<0.05)。見圖6。由此表明,激活CaSR可以緩解DIM所致肝癌細胞的增殖抑制。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與DIM組比較圖6 氯化釓預處理對DIM所致的肝癌細胞活力變化的影響

2.6 氯化釓預處理逆轉(zhuǎn)DIM致HepG2和SMMC-7721細胞遷移和侵襲抑制

在HepG2細胞中,與對照組相比,DIM組細胞遷移和侵襲能力均明顯降低(P<0.05)；與DIM組相比,氯化釓+DIM組細胞遷移和侵襲能力均明顯增加(P<0.05),見圖7。在SMMC-7721細胞中,與對照組相比,DIM組細胞遷移和侵襲能力均明顯降低(P<0.05)；與DIM組相比,氯化釓+DIM組細胞遷移侵襲能力均明顯增加(P<0.05),見圖8。

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與DIM組比較圖7 氯化釓預處理對DIM所致HepG2細胞遷移和侵襲能力變化的影響(×100)

a:P<0.05,與對照組比較；b:P<0.05,與DIM組比較圖8 氯化釓預處理對DIM所致SMMC-7721細胞遷移和侵襲能力變化的影響(×100)

3 討論

腫瘤細胞具有遷移和侵襲能力,使其能夠脫離原發(fā)腫瘤,進入淋巴管和血管,到達其他組織或器官中,從而造成腫瘤在體內(nèi)的轉(zhuǎn)移擴散[11]。目前,抑制腫瘤細胞遷移侵襲能力相關(guān)的抗腫瘤藥物的開發(fā),受到人們廣泛的關(guān)注。但是,影響腫瘤細胞的遷移和侵襲能力的內(nèi)在機制尚不明確。Tharmalingam等[12]研究表明,CaSR在侵襲轉(zhuǎn)移性腫瘤中存在異常的高表達,被認為是預測轉(zhuǎn)移及判斷預后的一個新的標志物。在人胃癌和肝內(nèi)膽管細胞癌中,激活CaSR后也可顯著增強腫瘤細胞的遷移和侵襲能力[1,13]。但在人肝癌細胞中,CaSR作用如何,激活后能否產(chǎn)生類似的效應仍無證據(jù)。

DIM是由十字花科植物提取物吲哚-3-甲醇(indole-3-carbinol,I3C)在胃酸條件下轉(zhuǎn)變而來[14]。針對不同人群進行的研究證實,食用含有DIM的蔬菜如卷心菜、花椰菜和球芽甘藍,可以降低患肝癌的風險[15-17]。Zhu等[18]研究表明,DIM在抗腫瘤尤其是抑制肝癌進程方面發(fā)揮重要作用,其機制可能與干擾腫瘤細胞DNA合成、誘導腫瘤細胞凋亡有關(guān)。有研究顯示,低劑量(1 μmol/L)DIM可以促進胃癌細胞增殖[19]。但本研究MTT實驗結(jié)果表明,高劑量DIM處理后肝癌細胞增殖能力明顯降低,與前期結(jié)果一致[10,20],推測可能與低水平DIM增強了細胞中Oct4、c-Myc等轉(zhuǎn)錄因子表達,影響了細胞的重編程有關(guān)[21]。除此之外,已有研究發(fā)現(xiàn),DIM可以抑制MHCC-97H和SMMC-7721肝癌細胞遷移和侵襲[9]。本研究證實DIM可以呈濃度依賴性抑制肝癌HepG2和SMMC-7721細胞遷移及侵襲能力。

為進一步明確CaSR在DIM抗肝癌效應中的作用,本研究采用CaSR激動劑氯化釓處理兩種肝癌細胞株,觀察激活CaSR后對DIM抗肝癌效應的影響。氯化釓是一種高效且特異性的CaSR激動劑,有文獻報道[22],氯化釓可以通過增加人非小細胞肺癌A549細胞中CaSR表達從而促進細胞增殖。Zhao等[23]研究表明,在人骨肉瘤MG-63細胞中,采用氯化釓激活CaSR后可明顯提高細胞增殖能力。本研究表明,在激活CaSR后,DIM引起的CaSR蛋白低表達和細胞的增殖、遷移及侵襲能力的抑制均得以緩解,提示CaSR可以促進肝癌細胞生長,可能在肝癌細胞進程中發(fā)揮促癌基因的作用。

綜上所述,DIM通過抑制肝癌細胞中CaSR的表達,對肝癌細胞增殖、遷移和侵襲產(chǎn)生抑制作用,為DIM抗肝癌效應及肝癌的分子診療提供了潛在靶點,同時也為CaSR在肝癌組織及癌旁組織中的表達綜合評定其與肝癌分期、治療和預后的關(guān)系提供了方向。