陳彥甫，范楊楊，周衛(wèi)娟，李子馨，李兆基，王健，趙瑩*，羅海希

（1.海南大學(xué)林學(xué)院，熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南省熱帶特色花木資源生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 570228；2.海南科技職業(yè)大學(xué)海南省藥食同源植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571126）

熱帶睡蓮是睡蓮科（Nymphaeaceae）睡蓮屬（Nymphaea）植物中廣泛分布于熱帶地區(qū)的類群的統(tǒng)稱，是多年生草本水生花卉。由于其花色艷麗、豐富，具有很高的觀賞價(jià)值，同時(shí)睡蓮的根具有凈化水體的作用，熱帶睡蓮逐漸成為園林設(shè)計(jì)中重要的水生植物[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)睡蓮屬植物富含黃酮、酚酸等多種活性成分，具有抗氧化、抗菌、抗輻射、降血糖等多種生物活性[2-3]。熱帶睡蓮的花和葉制成的食品及護(hù)膚品深受大眾喜愛[3-4]。Zhang等[5]通過系統(tǒng)基因組學(xué)分析證實(shí)了熱帶睡蓮是所有現(xiàn)存被子植物中的基部類群，是被子植物中最古老的分支之一。

熱帶紅睡蓮（Nymphaea rubra）因其花期長(zhǎng)、品質(zhì)優(yōu)良、繁殖能力強(qiáng)，成為熱帶水景園林設(shè)計(jì)中異軍突起的新優(yōu)種類。根據(jù)范楊楊等[6]的研究發(fā)現(xiàn)，其相比于埃及白睡蓮（Nympheae lotus）、藍(lán)鳥睡蓮（Nymphaea'Blue Bird'）等常見熱帶睡蓮品種，熱帶紅睡蓮的含水量、可溶性蛋白含量、維生素C含量更為突出，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，由此可見熱帶紅睡蓮在食藥工業(yè)具有廣闊的開發(fā)與應(yīng)用前景。

近年來關(guān)于睡蓮的研究主要集中于熱帶睡蓮品種的栽培與選育[7]、基因組及形態(tài)多樣性分析[8-9]、睡蓮的生理機(jī)制[10-11]、睡蓮在吸收重金屬離子及凈化污水[12]等方向，但睡蓮精油的提取工藝研究較少。植物精油在食品、化妝品等行業(yè)應(yīng)用前景廣闊，目前研究植物精油的主要提取手段有微波輔助提取、水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取、亞臨界水萃取等方法，吳曉菊等[13]采用4種提取方法分別提取神香草精油，比較4種方法的精油得率后得知超臨界CO2流體萃取法的精油得率要高于水蒸氣蒸餾法。同時(shí)超臨界流體萃取法相比于工藝較簡(jiǎn)單的水蒸氣蒸餾法和微波輔助提取法來說，采用的流體（如CO2）通常無害，有機(jī)溶劑殘留的風(fēng)險(xiǎn)較少，是目前眾多提取方法中較為環(huán)保并且精油得率較高的一種提取手段[14-15]，近幾年關(guān)于應(yīng)用超臨界流體技術(shù)萃取植物油脂方面的研究也日趨增多。

同時(shí)，植物精油抗氧化能力較強(qiáng)[16]，近年來研究表明植物提取精油在一定程度上對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌及真菌具有顯著的抑制作用，且抑制作用受溫度影響變化較小[17-20]，具備一定的紫外穩(wěn)定性[21]。植物精油還可降低化妝品的刺激性，在化妝品行業(yè)中起著極為關(guān)鍵的作用[22]。目前對(duì)熱帶睡蓮精油的抑菌能力及抗氧化活性的研究較少，對(duì)其進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，將為熱帶睡蓮精油在化妝品行業(yè)中的應(yīng)用提供參考。

本研究采用超臨界CO2流體萃取法提取熱帶紅睡蓮精油，對(duì)精油組分進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）分析，鑒定出熱帶紅睡蓮精油內(nèi)各化合物組分，并對(duì)熱帶紅睡蓮精油進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，探究精油對(duì)6種常見菌種的抑制能力，以期為熱帶紅睡蓮精油的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

熱帶紅睡蓮：印度紅睡蓮（Nymphaea rubra），海南榮豐花卉有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（CP）、葡萄糖（AR）、檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·2H2O）（AR）：西隴科學(xué)股份有限公司；YPD培養(yǎng)基（EA）：上海吉至生化有限公司；腺嘌呤（EA）：生工生物工程（上海）股份有限公司；青霉素、結(jié)晶牛血清蛋白（低內(nèi)毒素）：上海麥克林生化科技有限公司；2，6-二叔丁基對(duì)甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）（EA）：上海偉寰生物科技有限公司；氯化鈉（AR）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；吐溫80：海南金唯諾生物科技有限公司；大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、黑曲霉（均需4℃低溫保藏）：海南子約儀器設(shè)備有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

XMTD-8222電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HP6890/5975C GC/MS聯(lián)用儀：美國(guó)安捷倫公司；SPE-EDAFE-2超臨界CO2流體萃取儀：美國(guó)Applide Separations公司；UV-5500紫外分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 超臨界CO2方法萃取熱帶紅睡蓮精油

首先將紅睡蓮鮮花花瓣在電熱恒溫干燥箱中45℃下干燥7 h，待其達(dá)到恒重時(shí)，在粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，將得到的干粉備用。

參考黃秋偉等[7]的試驗(yàn)方法萃取精油。稱取40 g紅睡蓮干粉，裝入1 L的裝料罐，將其放入萃取釜中密封。將CO2流速控制在30 L/h，分離釜Ⅰ壓力設(shè)定為6.0 MPa、分離釜Ⅰ溫度設(shè)定為30℃；分離釜Ⅱ壓力設(shè)定為5.8 MPa、分離釜Ⅱ溫度設(shè)定為25℃，設(shè)定好分離條件后，設(shè)置萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為35℃，萃取時(shí)間2 h，進(jìn)行動(dòng)態(tài)循環(huán)萃取，當(dāng)萃取結(jié)束后，從分離釜中接取得到的物料，使用注射器吸取漂浮于上層的黃色油層進(jìn)行稱重，在－20℃條件下進(jìn)行冷凍備用，按照下式計(jì)算精油得率。

式中：m1為分離釜Ⅰ出口精油質(zhì)量，g；m2為分離釜Ⅱ出口精油質(zhì)量，g；m為紅睡蓮干粉質(zhì)量，g。

1.4 熱帶紅睡蓮精油成分GC-MS分析

1.4.1 固相微萃取

萃取前，取紅睡蓮精油0.6 g，放入5 mL進(jìn)樣瓶中，使用硅膠墊密封進(jìn)樣瓶。隨后，取100 μm聚二甲基硅氧烷固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣萃取頭，250℃預(yù)熱2 h，由頂部插入樣品瓶，28℃萃取80 min。將萃取頭向GC-MS汽化室內(nèi)快速插入，于230℃溫度下進(jìn)行3 min洗脫處理。以離子源（electron ionization，EI）為電離源進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4.2 GC-MS條件

GC條件：使用色譜柱為石英毛細(xì)管柱，將流速設(shè)定為0.3 L/min、進(jìn)樣量 1 μL、分流比 10∶1；進(jìn)樣溫度250℃，四極桿溫度150℃。升溫程序：在5℃/min速度下升至170℃，在2.5℃/min速度下再升至250℃，到指定溫度后維持15 min。

MS條件：選擇EI離子源，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，接口溫度280℃，溶劑延遲5 min，電子能70eV，掃描質(zhì)量范圍29amu～450amu。以Nist 2005質(zhì)譜鑒定分析總離子流圖內(nèi)各峰的質(zhì)譜圖結(jié)果。以峰面積歸一化法來計(jì)算各成分的相對(duì)含量。

1.5 熱帶紅睡蓮精油抑菌活性測(cè)定

1.5.1 濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑

取1.3中得到的紅睡蓮精油1 g，溶解于5 mL DMSO中，得到紅睡蓮精油溶液。把濾紙片貼于含菌平板上，3片/皿，向各濾紙上滴加精油溶液0.01 mL，同時(shí)分別滴加等量吐溫80、青霉素，以作參照，將細(xì)菌移至培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃培養(yǎng)1 d，將真菌移至培養(yǎng)箱內(nèi)，28℃培養(yǎng)3 d。每組試驗(yàn)重復(fù)5次，每皿使用交叉法測(cè)量抑菌圈直徑3次，取平均值，分析熱帶紅睡蓮精油對(duì)各供試菌種的抑菌活性。

1.5.2 紅睡蓮精油熱穩(wěn)定性檢測(cè)

將精油分別在 30、40、50、60 ℃水浴 15 min。以大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為例，使用上述濾紙片法測(cè)定抑菌圈直徑，交叉法測(cè)量3次，每組試驗(yàn)重復(fù)5次，結(jié)果取平均值。比較分析熱處理對(duì)熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

1.5.3 紅睡蓮精油紫外穩(wěn)定性檢測(cè)

使用紫外燈照射紅睡蓮精油溶液，照射時(shí)間分別為 10、20、30、40、50、60 min。以 1.5.1 方法測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。比較分析紫外處理對(duì)熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

1.5.4 紅睡蓮精油酸堿穩(wěn)定性檢測(cè)

使用 NaOH 溶液（1 mol/L）及 HCl溶液（1 mol/L）對(duì)固體培養(yǎng)基的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，獲得pH值為4、5、6、7、8、9的培養(yǎng)基。以1.5.1方法測(cè)量抑菌圈直徑，結(jié)果取平均值。比較分析不同pH值對(duì)熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱帶紅睡蓮精油GC-MS分析

借助GC-MS聯(lián)用儀對(duì)熱帶紅睡蓮精油成分展開分析，同時(shí)通過峰面積歸一法，明確各組分相對(duì)含量，圖1為總離子流圖，分析結(jié)果詳情如表1所示。

表1 熱帶紅睡蓮精油成分Table 1 Essential oils composition of tropical red water lily

圖1 超臨界CO2提取熱帶紅睡蓮精油總離子流圖Fig.1 Supercritical CO2extraction of tropical red water lily essential oil total ion flow diagram

由圖1和表1可知，運(yùn)行至5 min時(shí)，開始出峰，然而裂解電壓較低，大多處于0.2×102eV～0.8×102eV區(qū)間；當(dāng)進(jìn)行至24 min～28 min時(shí)，裂解電壓上升至1.0×102eV。超臨界CO2流體萃取出的紅睡蓮精油含有41種化合物，其中烷烴、烯醛、烷酮、醇類為主要成分。這些成分中含芳香環(huán)的有苯甲醇、對(duì)苯二甲醚、1，4-二甲氧基甲苯、3，4-二甲氧基苯酚、4-甲氧基-3-（甲氧基甲基）苯酚與甲氧甲酚，但是缺少呈濃香的單萜和倍半萜，表明熱帶紅睡蓮精油的芳香度要低于玫瑰精油、薰衣草精油等濃香型植物精油。

2.2 熱帶紅睡蓮精油抑菌性分析

2.2.1 抑菌圈測(cè)定結(jié)果

不同供試菌種的抑菌圈直徑見表2。

表2 熱帶紅睡蓮精油對(duì)不同供試菌種的抑菌圈直徑Table 2 Diaphragm diameter of tropical red water lily oil for different tested strains

由表2可知，大腸桿菌的抑菌圈直徑為8.73 mm，銅綠假單胞菌抑菌圈直徑為8.33 mm，金黃色葡萄球菌抑菌圈直徑為8.86 mm，枯草芽孢桿菌抑菌圈直徑為9.39 mm，釀酒酵母抑菌圈直徑為8.40 mm，黑曲霉抑菌圈直徑為7.97 mm。熱帶紅睡蓮精油對(duì)供試菌的抑菌活性由強(qiáng)到弱依次為枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、釀酒酵母、銅綠假單胞菌、黑曲霉。

2.2.2 熱帶紅睡蓮精油熱穩(wěn)定性結(jié)果

溫度與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系見表3。

表3 溫度與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系Table 3 Relationship between temperature and antibacterial activity of tropical red water lily oil

通過表3結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)熱處理后，熱帶紅睡蓮精油抑制大腸桿菌的活性相比金黃色葡萄球菌略強(qiáng)；該精油在溫度低于50℃時(shí)，對(duì)兩種菌的抑菌活性隨著溫度上升而增強(qiáng)，且50℃處理對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有最佳抑菌活性?？傮w來看，當(dāng)處理溫度達(dá)到50℃以后，精油的抑菌效果均減弱，但依然維持了一定的抑菌效果。

2.2.3 熱帶紅睡蓮精油紫外穩(wěn)定性結(jié)果

紫外處理時(shí)間與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系見表4。

表4 紫外處理時(shí)間與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系Table 4 Relationship between UV treatment time and antibacterial activity of tropical red water lily oil

由表4可知，熱帶紅睡蓮精油經(jīng)過不同時(shí)間的紫外照射后，抑菌活性上下波動(dòng)，且在紫外處理20 min時(shí)具有最佳抑菌活性。但各紫外處理時(shí)間下，抑菌效果差異不顯著（p＞0.05），說明熱帶紅睡蓮精油具有一定的紫外穩(wěn)定性。

2.2.4 熱帶紅睡蓮精油酸堿穩(wěn)定性

培養(yǎng)基pH值與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系見表5。

表5 培養(yǎng)基pH值與熱帶紅睡蓮精油抑菌活性的關(guān)系Table 5 Relationship between pH of culture medium and antibacterial activity of tropical red water lily oil

由表5可知，在熱帶紅睡蓮精油供試菌種中，pH 4、6、9時(shí)對(duì)大腸桿菌抑制效果較好，pH7、8時(shí)對(duì)金黃色葡萄球菌抑制效果較好。但各pH值下抑菌效果差異不顯著（p＞0.05），說明熱帶紅睡蓮精油具有廣譜酸堿穩(wěn)定性。

3 討論

研究表明，熱帶紅睡蓮精油對(duì)于6種供試菌皆表現(xiàn)出一定抑制效果，包括2類革蘭氏陰性菌（Gram negative bacteria，GNB）（枯草芽孢桿菌與大腸桿菌）、2類革蘭氏陽性菌（Gram positive bacteria，GPB）（銅綠假單胞菌與金葡菌）、2類真菌（黑曲霉與釀酒酵母）。其中對(duì)GPB的抑制效果相比GNB偏高，是由于GNB的細(xì)胞壁內(nèi)存在脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），可阻止疏水性成分向菌體內(nèi)轉(zhuǎn)移[23]，具有保護(hù)菌體的作用，馬立[24]的研究顯示，酚類物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致LPS結(jié)構(gòu)受損。同時(shí)，王勇[25]發(fā)現(xiàn)植物精油中的丁香酚、肉桂醛和檸檬烯等是有效抑菌成分，尤其丁香酚具備芳香環(huán)結(jié)構(gòu)，含極性基團(tuán)，此類基團(tuán)可結(jié)合菌中部分酶的活性基團(tuán)，使其正常的代謝機(jī)能受損，抑制菌體生長(zhǎng)。由此可以推測(cè)，酚類物質(zhì)、甲基丁香酚和各種烯醛類化合物是紅睡蓮精油具有抑菌活性的關(guān)鍵所在?？蔀楹罄m(xù)提升睡蓮精油抑菌性提供理論依據(jù)。同時(shí)，熱帶紅睡蓮精油穩(wěn)定性試驗(yàn)的結(jié)果表明，熱帶紅睡蓮精油具有良好的熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性，可廣泛應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)及生活中。

熱帶紅睡蓮精油對(duì)常見菌種的抑制效果雖比不上茶樹精油等具有極強(qiáng)抑菌效果的精油產(chǎn)品，但與玫瑰、鼠尾草、薰衣草等精油相比，不僅抑菌效果較好且具有良好的穩(wěn)定性。除此之外，因熱帶紅睡蓮精油對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制效果，而金黃色葡萄球菌是引起痤瘡等皮膚炎癥的主要原因之一，所以可考慮制備含熱帶紅睡蓮精油的護(hù)膚品。

4 結(jié)論

采用超臨界CO2流體萃取熱帶紅睡蓮精油，并用GC-MS檢測(cè)所提精油主要成分，結(jié)果顯示精油含有大量烷烴、烯烴、酮類、酯類物質(zhì)，為精油的抑菌性和抗氧化性奠定基礎(chǔ)。熱帶紅睡蓮精油對(duì)試驗(yàn)中供試菌的抑菌能力為枯草芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞釀酒酵母＞銅綠假單胞菌＞黑曲霉。表明對(duì)革蘭氏陽性菌抑制能力大于革蘭氏陰性菌，同時(shí)精油在抑菌能力方面具備一定熱穩(wěn)定性、紫外穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，即在 30℃～60℃、紫外線處理 10 min～60 min、pH4～9時(shí)，熱帶紅睡蓮精油的抑菌圈大小沒有顯著差異。