黃良圓 周颯 廖慧鈺 王金花

（海南大學(xué) 海南 ?？?570228）

無(wú)漿體是一類無(wú)固定形態(tài)的微生物，專性寄生于脊椎動(dòng)物血細(xì)胞中。根據(jù)無(wú)漿體代謝特征和超微結(jié)構(gòu)，將其歸為立克次體目（Rickettsiales）無(wú)漿體科（Anaplasmataceae）無(wú)漿體屬（Anaplasma）。主要種類有：嗜吞噬細(xì)胞無(wú)漿體（Anaplas-ma pagocytophilum），綿羊無(wú)漿體（Anaplasma ovis）、牛無(wú)漿體（Anaplasma bovis）、邊緣無(wú)漿體（Anaplasma marginale）、中央無(wú)漿體（Anaplasma centrale）、扁平無(wú)漿體（Anaplasma platys）、山羊無(wú)漿體（Anaplasma capra）等［1］。其中，A.ovis、A.pagocytophilum對(duì)羊 危害 較 大，A.marginale對(duì)牛危害比較大，A.pagocytophilum已經(jīng)被公認(rèn)是一種引起人畜共患的病原。

無(wú)漿體?。ˋnaplasmosis）是由幾種無(wú)漿體病原經(jīng)蜱媒傳播引起的一種立克氏體疾病，主要在熱帶和亞熱帶地區(qū)流行，主要表現(xiàn)為發(fā)燒、貧血、黃疸、流產(chǎn)等癥狀，嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起死亡，給畜牧養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］，還威脅到人的健康。該病已被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類動(dòng)物傳染病，也被我國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列為進(jìn)出口動(dòng)物檢疫項(xiàng)目之一［3］。目前，我國(guó)多個(gè)地區(qū)均有無(wú)漿體病報(bào)道，海南地區(qū)尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 樣品

對(duì)海南地區(qū)176頭黃牛頸靜脈采血（見圖1），其中，定安縣161頭、?？谑?頭、瓊?？h5頭、儋州縣6頭。記錄動(dòng)物的飼養(yǎng)模式、性別、年齡和品種，將血液于‐20℃保存。

圖1 樣品來(lái)源分布圖

1.2 提取血液基因組DNA

將冷凍EDTA血液樣品于室溫下解凍并渦旋。吸取200μL全血，使用血液基因組DNA抽提試劑盒（Sangon Biotech，ShangHai，China）進(jìn) 行DNA提取，使用Nanodrop ND1000分光光度計(jì)（Thermo Scientific?，美國(guó)）測(cè)DNA濃度和純度。丟棄小于5 ng/μLDNA樣品，并重新提取全血DNA，于‐20°C保存。

1.3 巢式PCR和單PCR擴(kuò)增

表1為本次研究使用引物序列。對(duì)A.phagocytophilum和A.bovis使用基于16Sr RNA基因?qū)Τ彩絇CR擴(kuò)增，第一輪引物為EE1和EE2，可能存在的所有無(wú)漿體物種的16S rRNA基因，第二輪引物使用SSAP2 f/r和AB1f/r進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增［4］；A.marginale使用基于MSP4基因設(shè)計(jì)的特異性引物［5］。以上所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。第一輪PCR反應(yīng)在25μL的最終體積中進(jìn)行，其中含有13μL Mix酶（中國(guó)南京諾維贊公司）、雙蒸水10μL、左右引物各0.5、1.0μL DNA。熱循環(huán)體系如［6］。A.phagocytophilum和A.bovis的第二輪PCR反應(yīng)最終體積為50μL，其中Mix酶（中國(guó)南京諾維贊公司）25μL、雙蒸水21μL、引物1μL、第一輪PCR反應(yīng)的產(chǎn)物2μL。A.ovis、A.marginale反應(yīng)的最終體系為25μL。熱循環(huán)反應(yīng)條件如表2所示。

表1 無(wú)漿體引物序列

表2 無(wú)漿體PCR擴(kuò)增條件

1.4 瓊脂糖凝膠電泳

用1×TAE電泳緩沖液和1.5%瓊脂糖配置凝膠液，稍冷后加入DNA Green染料（每100 mL瓊脂糖凝膠溶液加1μL DNA Green染料）混勻制膠，冷卻20 min，將巢式PCR第二輪產(chǎn)物和常規(guī)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。取8μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物加入凝膠孔，120 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后凝膠放置在紫外凝膠成像儀觀察拍照。

1.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

使用16S rRNA、Gro EL（熱休克蛋白）和MSP4（主要表面蛋白4）基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。首先從GenBank中獲取世界各地菌株并篩選（即丟棄重復(fù)測(cè)序，不完整的序列，并在非常相似的序列子集中選擇一個(gè)序列）。通過(guò)MegAlign軟件（DNAStar，Madison，WI）中Clustal W方法比對(duì)。使用Mega X軟件，Neighbor‐joining（NJ）算法中Kimura‐2‐parameter參數(shù)模型，Bootstrop值選擇1 000進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。最后，選用Figtree軟件將Mega X導(dǎo)出進(jìn)行原樹染色編輯。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增

黃牛中檢測(cè)到A.bovis、A.phagocytophilum、A.marginale MSP4，其目的條帶大小分別為551、641、851 bp，如圖2所示。

圖2 部分黃牛樣品PCR結(jié)果

2.2 黃牛無(wú)漿體感染

2.2.1 不同地區(qū)黃牛無(wú)漿體感染情況分析

4個(gè)市縣牛均檢測(cè)出無(wú)漿體感染，其中?？谑?、瓊?？h和儋州3個(gè)地區(qū)無(wú)漿體感染率高達(dá)100.0%、80.0%、50.0%，但并不能說(shuō)明無(wú)漿體在這3個(gè)地區(qū)的流行情況。Yan等［7］報(bào)道在新疆塔里木河上游493份奶牛血液樣本中，無(wú)漿體的感染率為3.2%。Li等［8］報(bào)道在196份牛血液樣品中無(wú)漿體感染率為5.1%。Yang等［9］發(fā)現(xiàn)我國(guó)10省557頭牛中有31.6%的牛檢出A.marginale。El‐Dakhly等［10］報(bào)道在埃及，牛檢出A.marginale感染率為10.6%（16/150）。Fernandes等［11］報(bào)道在莫桑比克，牛中檢出A.marginale、A.phagocytophilum感染率分別為97.3、2.7%（6/219）。Sisson等［12］報(bào)道在南非克魯格國(guó)家公園飼養(yǎng)的非洲水牛747份血液樣本中，A.marginale、A.centale感染率別為17.3%、13.1%，總感染率為15.1%。本研究中黃牛的A.phagocytophilum感染率為6.3%（11/176），A.bovis感染率為11.4%（20/176），A.marginale感染率為5.7%（10/176），海南地區(qū)牛無(wú)漿體的感染率最高。Yan等報(bào)道了A.bovis、A.ovis、A.phagocytophilum和A.platys感染率分別為0.2%（1/493）、0.4%（2/493）、2.4%（12/493）、2.4%（12/493）。Rjeibi等［14］報(bào)道在阿爾及利亞的牛中，A.centrale、A.marginale、A.bovis三種無(wú)漿體的感染率為30.5%（55/180）、1.66%（3/180）、0（0/180）。本研究A.bovis感染率為11.4%（20/176），未檢出牛無(wú)漿體。

表3 不同地區(qū)黃牛無(wú)漿體感染情況分析

2.2.2 無(wú)漿體混合感染情況分析

研究發(fā)現(xiàn)，A.bovis+A.phagocytophilum感染率為2.0%（3/176），A.bovis+A.marginale的感染率為1.1%（2/176），A.phagocytophilum+A.marginale的感染率為0.6%（1/176），A.bovis+A.phagocytophilum+A.marginale感染率為3.4%（6/176）。海南地區(qū)牛A.bovis+A.phago-cytophilum+A.marginale混合感染情況比較普遍。Rjeib等［14］報(bào)道在阿爾及利亞的牛中A.centrale+A.marginale感染率為5.5%（10/180），A.marginale+A.bovis感染率為1.1%（2/180），A.centrale+A.marginale+A.bovis感染率為2.8%（5/180），其中A.centrale+A.marginale混合感染情況比較普遍，該結(jié)論與本研究結(jié)果不一致。

表4 ?；旌细腥厩闆r統(tǒng)計(jì)表

2.2.3 黃牛不同年齡、性別和飼養(yǎng)模式無(wú)漿體感染情況

調(diào)查不同性別牛無(wú)漿體感染情況發(fā)現(xiàn)，感染無(wú)漿體公牛有3頭，感染率為14.3（3/21），母牛23頭，感染率為14.8%（23/155），公牛和母牛感染無(wú)漿體的差異不明顯。調(diào)查不同年齡牛無(wú)漿體的感染情況發(fā)現(xiàn)，小于3歲的牛感染無(wú)漿體有9頭，感染率為14.3%（9/63），3～6歲牛感染無(wú)漿體有13頭，感染率為15.1%（13/86），大于6歲牛感染無(wú)漿體有3頭，感染率為11.1%（3/27），顯示不同年齡段牛感染率差異不明顯。研究發(fā)現(xiàn)散養(yǎng)模式下牛無(wú)漿體的感染率為73.3%，圈養(yǎng)模式下無(wú)漿體感染率為9.3%，可見牛在散養(yǎng)模式下無(wú)漿體感染率明顯高于圈養(yǎng)模式，該結(jié)論與張晶報(bào)道一致［15］。這可能與規(guī)模化農(nóng)場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境管理更科學(xué)，蜱蟲叮咬少，而自由放牧條件下，蜱蟲叮咬高，導(dǎo)致無(wú)漿體感染率高。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

2.3.1A.phagocytophilum16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

表5 不同年齡、性別、飼養(yǎng)模式無(wú)漿體感染率

本研究獲得的5株A.phagocytophilum 16S rRNA基因部序列與A.phagocytophilum16S rRNA基 因 序 列（AB196720、AB19672、GQ175174、JN558812、JN558816、JN990105、KC246018、KF569915、KJ782381、KJ782386、KP062963、KP276588、KR002114、KT944029、KU321298、KU870667、KX083402、KX236051、KX236051、KX450278、LC060986、LC060987、MF992253、MG002405、MN097858、MN216240、NR044762）以及Rickettsia（JX885456）、A.ovis（KJ459342）、A.platys（KU500900、KU500914、MH255941）、A.bovis（MH255928、MH255938）、A.centrale（MH588232、MH588233）和A.capra（MH762071、MT798602、MT052418）6種16SrRNA基因序列作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。A.phagocytophilum系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果表明，本研究獲得黃牛4株序列（XYAP2、RYAP3、RYAP4、RYAP6）獨(dú)立聚為一 類群，與（KT944029，KT782381）參照序列比較相近；NDAAP2序列獨(dú)立在不同的分支與來(lái)自巴基斯坦牛（MN216240）分離參照株比較相近。如圖3所示。

圖3 A.phagocytophilum16S rRNA基因序列（641 bp）系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.2A.bovis16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

本研中獲得的7株A.bovis 16S rRNA部分基因序列與A.bovis 16SrRNA基因序列（KU509992、KU509996、KX450273、KY242455、MH255927、MH255934、MH255935、MH255936、MH255939、MH255940、MH255941、MK028572、MK028574、MK446832、MN044717、MN309842、MN309843、MT036513），以及Rickettsia（JX885456）、A.ovis（KC484562、MN795156）、A.platys（KU500900、KU500914）和A.capra（LC432092、MH762071，MT052418、MT798602）4種16S rRNA基因序列作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。A.bovis系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明，海南地區(qū)A.bovis序列與其他地區(qū)（包括：馬來(lái)西亞，俄羅斯，韓國(guó)）的分離株聚集為一類群，得到了95.5%個(gè)節(jié)點(diǎn)支持，其中RYAB9的遺傳距離比較遠(yuǎn)。如圖4所示。

圖4 A.bovis16S rRNA基因序列（551 bp）系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3.3A.marginale MSP4基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

本研究獲得的10株A.marginale MSP4基因部序列與A.marginale MSP4基因序列（AF428082、

AF428086、AY283190、AY456002、AY665997、AY665999、AY851150、EF053264、EU283844、EU677383、JN564646、KX989516、KX989512、KX989513、MG676453、MG676455、MG676459、MH026093、MH172467、MH373246，MH939155、MK809379、MK809381、MK809384、MK809386、MK809387、MT268094）以及A.ovis（HM063433、KU497703）、A.centrale（KY305601、KY305604、KY305621）和A.phagocytophilum（EU008082、EU180058、MF974857）的MSP4基因序列作為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。A.marginale基于MSP4基因系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，A.marginale、A.phagocytophilum、A.centrale和A.ovis的MSP4基因序列分別獨(dú)立聚為不同分支。本研究獲得的10株A.marginale序列與其他地區(qū)A.marginale參照序列同聚為一類群，分支節(jié)點(diǎn)支持率高達(dá)100%，其中DAAM9株遺傳距離較遠(yuǎn)。如圖5所示。

圖5 A.marginale MSP4基因序列（851 bp）系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論

本次研究使用PCR方法對(duì)海南地區(qū)黃牛進(jìn)行了無(wú)漿體分子流行病學(xué)調(diào)查。海南地區(qū)4個(gè)市縣黃牛中無(wú)漿體感染率為14.8%，并在黃牛中檢測(cè)出A.bovis、A.pagocytophilum、A.marginale，其感染率分別為11.4%、6.3%、5.7%，混合感染率為11.8%，A.bovis為優(yōu)勢(shì)種，且A.bovis+A.pagocytophilum+A.marginale共同感染比較常見，散養(yǎng)比圈養(yǎng)更容易感染無(wú)漿體。本研究通過(guò)16S rRNA/MSP4基因構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)海南地區(qū)黃牛中，A.pagocytophilum、A.bovis、和A.marginale序列與來(lái)不同地區(qū)的無(wú)漿體參照序列之間未發(fā)現(xiàn)明顯地理隔離分化特征，而在A.pagocytophilum系統(tǒng)進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)不同宿主存在明顯分支，可能存在宿主分化特征。