管凇 周漢林 榮光 徐鐵山 孫衛(wèi)平 胡海超

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所 海南 ?？?571101）

海南黑山羊的養(yǎng)殖歷史悠久，可以追溯到1 700多年前，又稱東山羊。海南黑山羊具有許多優(yōu)良特性，具有耐濕熱、耐粗飼、抗病力強(qiáng)，肉質(zhì)鮮嫩多汁，皮薄肉厚，脂肪分布均勻，膠原蛋白豐富，膻味小，羊胎素含量高，膽固醇含量低等特點(diǎn)。但是海南黑山羊生長緩慢，個(gè)體小，繁殖力低，嚴(yán)重影響生產(chǎn)效益和市場需求，一直以來，海南黑山羊個(gè)體矮小的分子機(jī)制不明確。因此，通過候選基因法，篩選影響海南黑山羊生長性狀的分子標(biāo)記，如果能應(yīng)用于育種實(shí)踐中，對于海南黑山羊的提純復(fù)壯、品種選育以及雜交利用都有著重要意義。通過生物信息學(xué)工具分析和預(yù)測基因突變對性狀影響的分子機(jī)理在現(xiàn)代生命科學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮出越來越重要的作用。

胰島素樣生長因子2基因（Insulin like Growth Factor‐2，IGF2）是一種多功能細(xì)胞增殖調(diào)控因子，對細(xì)胞的分化、增殖、胚胎的生長發(fā)育作用，刺激培養(yǎng)細(xì)胞生長，研究表明，胰島素樣生長因子對于骨骼肌的生長發(fā)育和肌肉細(xì)胞的成熟分化有著精密的調(diào)控的功能，在動(dòng)物生長發(fā)育過程中起重要作用。許多研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IGF2基因影響豬初生重、斷奶重、平均日增重、生長速度、背膘厚、瘦肉率等重要經(jīng)濟(jì)性狀［1‐2］，可作為用于育種實(shí)踐的分子遺傳標(biāo)記［3］。李豐田等［4］利用分子生物學(xué)技術(shù)克隆了遼寧絨山羊IGF2基因，并對IGF2的信號肽和蛋白質(zhì)親水性進(jìn)行檢測分析。結(jié)果表明，IGF2僅含有一個(gè)TATA－box，3個(gè)CpG島，且IGF2有信號肽序列，屬于分泌蛋白。本文以海南黑山羊?yàn)檠芯繉ο螅x取IGF2基因?yàn)楹蜻x基因，采用直接測序和SnaPshot分型方法檢測海南黑山羊IGF2基因是否存在單核苷酸多態(tài)性，以及對生長性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，探討海南黑山羊生長遲緩、個(gè)體矮小的原因，為探究海南黑山羊生長發(fā)育分子機(jī)制以研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集和生長性狀的測定

樣品采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所山羊海南黑山羊保種場的耳組織樣。測量的生長性狀包括體長、體高、體重，一共測量了104只成年山羊，同時(shí)，對測定的山采集耳組織，采樣前對每頭仔豬耳朵用75%乙醇消毒，剪取耳組織，置于裝有75%乙醇的離心管中，低溫環(huán)境下帶回實(shí)驗(yàn)室備用。DNA提取采用試劑盒提取耳組織總DNA，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品，并用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)每個(gè)樣品DNA質(zhì)量濃度，每35個(gè)DNA構(gòu)建1個(gè)總DNA池。

1.2 引物設(shè)計(jì)

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/）數(shù)據(jù)庫中獲得山羊IGF2基因DNA序列（GenBank登錄號分別為NC_030836），根據(jù)SNP位點(diǎn)序列信息，使用引物設(shè)計(jì)軟件PrimerPlex2設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)引物，使用primer3plus在線設(shè)計(jì)單堿基延伸引物，引物序列為上游3’CGGGAAAC‐GTCGTTCAAATC5’，下 游3’TCGTGCGTG‐GTTTTGACTTG5’，擴(kuò)增片段為265 bp。

1.3 SNP位點(diǎn)的篩選和分型

對提取的DNA基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)總體積為10μL：5μL（5×）TaqPCR mas‐termix，上下游引物各0.5μL（20μmol/L），模板DNA1μL（20 ng/uL），加ddH2O至10μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；45個(gè)循環(huán)（94℃，20 s；60℃，30 s；72℃，30 min）；72℃再延伸3 min。在PCR反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物用SAP（shrim palk aline phosphatase，蝦堿性磷酸酶）處理，以去除體系中游離的dNTPs。在堿性磷酸酶處理結(jié)束后，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系總體積5μL。委托武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司對PCR產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步分型，采用SnaPshot方法分型，并統(tǒng)計(jì)出每個(gè)樣品的SNP位點(diǎn)的基因型。

2 數(shù)據(jù)分析和結(jié)果

對IGF2基因第一外顯子、第二外顯子、第三外顯子、第四外顯子進(jìn)行SNP多態(tài)性位點(diǎn)篩選，結(jié)果只在第一外顯子115bp處檢測到一個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，突變位點(diǎn)G→A轉(zhuǎn)換（見圖1），屬于同義突變，沒有導(dǎo)致氨基酸改變。突變位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（Ne）為1.166，觀測雜合度（Ho）為0.135，期望雜合度（He）0.142，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.132；多態(tài)位點(diǎn)有3種基因型GG、GA、AA，GG基因型89個(gè)，GA基因型14個(gè)，AA基因型1個(gè)，基因型與體長，體高，體重之間的關(guān)聯(lián)性分析差異不顯著（見表1）。

表1 多態(tài)位點(diǎn)與基因之間的關(guān)聯(lián)性

圖1 突變位點(diǎn)的序列比對結(jié)果

3 討論

IGF2基因是家畜重要經(jīng)濟(jì)性狀的候選基因，根據(jù)目前的國內(nèi)外研究結(jié)果，已發(fā)現(xiàn)顯著影響目標(biāo)性狀的分子標(biāo)記。薛慧良等［5］研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因外顯子8存在對豬初生重和6月齡背膘厚有顯著影響的分子標(biāo)記位點(diǎn)。劉桂蘭等［6］發(fā)現(xiàn)，IGF2基因內(nèi)含子8存在不同基因型，不同基因型對豬的肥肉率、瘦肉率、背膘厚有存在顯著相關(guān)性。Van‐Laere等［7］利用EMSA、熒光素酶報(bào)告基因和基于亞硫酸鹽甲基化分析等方法，證實(shí)豬IGF2基因內(nèi)含子3中存在一個(gè)影響肌肉發(fā)育的功能性單核苷酸多態(tài)性。韓瑞華等［8］發(fā)現(xiàn)IGF2基因有與秦川牛宰前活重、胴體重、胴體長、胴體胸深、眼肌面積顯著相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)，同時(shí)，與大理石花紋、嫩度、pH24也存在顯著相關(guān)性。IGF2基因存在與與生長性能、屠體重和腹脂率等重要經(jīng)濟(jì)性狀顯著相關(guān)的分子標(biāo)記位點(diǎn)［9‐10］。顏炳學(xué)等［11］研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因外顯子2中的存在對雞胸角寬、腺胃重、半凈膛重有顯著性影響的分子標(biāo)記。李玉冬等［12］采用生物信息學(xué)對雞IGF2基因進(jìn)行功能性分析好預(yù)測，發(fā)現(xiàn)T30P和E35G位點(diǎn)突變嚴(yán)重影響雞IGF2蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，可能是影響雞生長和體組成性狀的重要功能性SNPs。陳則東等［13］在雞的IGF2基因外顯子1中檢測到與4周齡體質(zhì)量呈顯著正相關(guān)的基因型。黃永震等［14］研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因存在4個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)及其單倍型，與秦川牛體高、體長、胸寬、胸深和體重存在顯著相關(guān)性，與18～24月齡郟縣紅牛的體重存在顯著相關(guān)性［15］，說明IGF2基因?qū)εＩL性狀具有顯著影響。毛海霞等［16］研究結(jié)果表明，IGF2基因第二外顯子的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與郟縣紅牛的胸圍、體重存在顯著相關(guān)性，可以用于郟縣紅牛遺傳育種選育的分子標(biāo)記，張爭鋒等［17］研究發(fā)現(xiàn)，IGF2基因第二外顯子的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與南陽牛6、12、18、24月齡體斜長和胸圍，12、18、24月齡的坐骨端寬，初生、6月、24月齡體重等顯著相關(guān)，是南陽牛選育非常有價(jià)值的分子標(biāo)記輔助選擇位點(diǎn)。

趙拴平等［18］研究發(fā)現(xiàn)IGF2基因第一內(nèi)含子的3個(gè)SNP多態(tài)性與大別山牛群體部分生長性狀具有顯著或極顯著的相關(guān)性。武建亮等［19］提示IGF2可作為脂肪沉積的候選基因應(yīng)用于標(biāo)記輔助選擇。多態(tài)信息含量（PIC）和雜合度（He）是度量群體內(nèi)遺傳變異的標(biāo)記，數(shù)值越高，說明遺傳變異越大，選擇潛力越大。本研究只在IGF2基因第一外顯子115 bp處檢測到一個(gè)SNP多態(tài)性位點(diǎn)，突變位點(diǎn)G→A轉(zhuǎn)換，屬于同義突變，沒有導(dǎo)致氨基酸改變。突變位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（Ne）為1.166，觀測雜合度（Ho）為0.135，期望雜合度（He）0.142，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.132。多態(tài)信息含量和雜合度較低，屬于低度多態(tài)，說明群體遺傳變異小，選擇潛力不大。多態(tài)位點(diǎn)有三種基因型GG、GA、AA，GG基因型89個(gè)，GA基因型14個(gè)，AA基因型1個(gè)，基因型與與體長，體高，體重的關(guān)聯(lián)性分析顯示差異不顯著，可能檢測的群體樣本少，長期圈養(yǎng)和近交繁殖導(dǎo)致群體純合度高，個(gè)體之間性狀差異不顯著。