侯強川,王玉榮,王文平,田龍新,趙慧君,郭壯*

1(湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心,湖北 襄陽,441053) 2(襄陽市釀酒生物技術(shù)與應(yīng)用企校聯(lián)合創(chuàng)新中心,湖北 襄陽,441705) 3(湖北堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司,湖北 襄陽,441614)

白酒作為我國的國粹,擁有眾多的種類和品系,如清香型白酒、濃香型白酒、醬香型白酒和兼香型白酒等[1],其中醬香型白酒釀造工藝最為復(fù)雜[2],導(dǎo)致不同企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品風(fēng)味及品質(zhì)存在較大差異。在醬香型白酒生產(chǎn)過程中,高溫大曲是其發(fā)酵重要的糖化酶和微生物來源[3],大曲質(zhì)量在很大程度上決定著最終產(chǎn)品的品質(zhì)。高溫大曲在制作時,由于不同曲塊在車間堆放發(fā)酵時所處的位置不同,各個曲塊發(fā)酵時的微環(huán)境如溫度、濕度、氧濃度等均存在一定差異,導(dǎo)致最終成品曲塊的顏色有所不同。具體而言,如果發(fā)酵前期溫度低,發(fā)酵后期干燥差,會生產(chǎn)出白色大曲；發(fā)酵前期溫度適宜,發(fā)酵后期干燥充分,會生產(chǎn)出黃色大曲；發(fā)酵前期升溫快,發(fā)酵后期干燥差,則會產(chǎn)生黑色曲塊(較為少見)[4]。已有的研究表明不同顏色的高溫大曲微生物群落結(jié)構(gòu)及核心微生物類群等存在明顯差異[4]。

茅臺酒作為中國公認(rèn)的高品質(zhì)醬香型白酒,其風(fēng)味濃郁醇厚、回味綿長,幾乎代表了醬香型白酒制作的最高工藝。GAN等[5]研究發(fā)現(xiàn),放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)是茅臺高溫大曲中的優(yōu)勢細(xì)菌門,同時不同顏色高溫大曲菌群群落結(jié)構(gòu)存在較大差異。以茅臺醬香型高溫大曲為標(biāo)尺,在對中小型醬香型白酒企業(yè)高溫大曲細(xì)菌類群進(jìn)行測序的基礎(chǔ)上,采用生物信息學(xué)和多元統(tǒng)計學(xué)手段對兩者菌群群落結(jié)構(gòu)和功能差異進(jìn)行甄別,并以此為靶點在后續(xù)大曲制作過程中進(jìn)行工藝改良對于中小型醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)產(chǎn)品品質(zhì)的提升具有重要意義。

鑒于此,本研究將國際數(shù)據(jù)庫中湖北省堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司(下簡稱堯治河)[6]和茅臺高溫大曲群落結(jié)構(gòu)的細(xì)菌測序數(shù)據(jù)[5]進(jìn)行了下載和歸并分析,從菌群群落結(jié)構(gòu)、功能以及細(xì)菌表型等多個維度全面探究了兩者的共性和差異,通過本研究的開展以期為襄陽乃至湖北地區(qū)高溫大曲制作工藝的改良提供理論依據(jù)和有益指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 測序數(shù)據(jù)的獲取

按照GAN等[5]的描述,本研究從CNGB國家基因庫(https://db.cngb.org/cnsa/,編號:CNP0000-316)下載了茅臺白色高溫大曲(白曲)和黃色高溫大曲(黃曲)測序數(shù)據(jù)各26份,同時整合了本研究團(tuán)隊前期采集自湖北省堯治河楚翁泉酒業(yè)有限公司的白曲和黃曲測序數(shù)據(jù)各10份(https://www.mg-rast.org/,編號∶mgp96594)[6],共計72份測序數(shù)據(jù)。

1.2 生物信息學(xué)分析

使用QIIME(V1.9.1)平臺對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的分析,具體生物學(xué)分析過程包括：1)采用PyNAST軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行比對和校準(zhǔn)[7]；2)使用QIIME中的pick_closed_reference_otus.py命令結(jié)合Greengene數(shù)據(jù)庫在97%的相似度對校準(zhǔn)后的序列進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)劃分和注釋[8-9]；3)使用vsearch軟件對屬于嵌合體的OTU進(jìn)行識別并去除[10]；4)通過統(tǒng)計各OTU包含的序列數(shù)及對應(yīng)的注釋信息計算各樣本中細(xì)菌在門和屬水平的相對含量；5)基于各樣品在屬水平的相對含量分別基于Bray-Curtis距離和Binary Jaccard距離進(jìn)行β多樣性分析；6)通過計算樣本相同測序深度下的α多樣性指數(shù)(Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)、Observed species指數(shù)和Simpson指數(shù))評估樣品中菌群的豐度和多樣性,具體操作為以測序量最低的樣品為基準(zhǔn),各樣品隨機抽取相同的序列數(shù),并計算上述4個α多樣性指標(biāo),重復(fù)該過程1 000次,取各指標(biāo)1 000次計算得到的平均值作為該樣品最終的α多樣性指數(shù)值；7)應(yīng)用生物信息學(xué)開源軟件PICRUSt對大曲菌群的功能進(jìn)行預(yù)測[11],得到各樣品直系同源基因簇(clusters of orthologous groups,COG)組成；8)使用BugBase工具(https://bugbase.cs.umn.edu/)對各酒曲樣品細(xì)菌表型進(jìn)行分類統(tǒng)計和可視化。

1.3 多元統(tǒng)計學(xué)分析

使用非參數(shù)的Mann-Whitney秩和檢驗對兩組樣品進(jìn)行差異顯著性檢驗,使用Benjaminiand Hochberg的方法校正多次檢驗的假陽性率[12]。使用置換多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance,PERMANOVA)檢驗影響酒曲中菌群組成的關(guān)鍵因素。使用Spearman Rank 相關(guān)性分析確定茅臺和堯治河酒曲中菌群彼此間的相關(guān)關(guān)系性。所有分析在R語言(V3.2.5)和STAMP(V2.1.3)軟件中實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫大曲中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)的整體組成

在高溫大曲中共鑒定到23個細(xì)菌門和347個細(xì)菌屬,其中優(yōu)勢細(xì)菌門(平均相對含量 >1%)主要包括厚壁菌門(82.32%)、放線菌門(7.72%)和變形菌門(5.80%)(圖1-a)；優(yōu)勢細(xì)菌屬(平均相對含量 >1%)共有11個,主要包括芽胞桿菌屬(Bacillus,23.12%)、嗜熱放線菌屬(Thermoactinomyces,19.55%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus,6.43%)、Kroppenstedtia(5.51%)、乳桿菌屬(Lactobacillus,4.41%)和糖多孢菌屬(Saccharopolyspora,4.26%)等。此外,各樣品平均約24.12%的菌群無法鑒定到屬水平。

a-門水平；b-屬水平圖1 不同地區(qū)和顏色高溫大曲在門和屬水平的菌群組成Fig.1 Bacterial composition of high-temperature Daqu in different regions and colors at phylum and genus level

2.2 高溫大曲核心菌群分析

本研究將在不同地區(qū)和不同顏色高溫大曲中均出現(xiàn)的OTU定義為高溫大曲的“核心OTU”,結(jié)果顯示共有180個OTU滿足該條件(圖2)。這些OTU主要注釋結(jié)果為嗜熱放線菌屬(45個)、芽胞桿菌屬(34個)、Kroppenstedtia(12個)、乳桿菌屬(9個)和葡萄球菌屬(9個)等?！昂诵腛TU”注釋結(jié)果與酒曲中優(yōu)勢菌屬的分析結(jié)果一致。值得注意的是,核心OTU中平均分別包含有堯治河大曲75.52%(22.33%～97.55%)的序列,而平均僅包含有茅臺大曲中3.60%(0.38%～7.53%)的序列。同時,來自同一地區(qū)不同顏色的高溫大曲亦擁有大量共有OTU,如在茅臺和堯治河不同顏色高溫大曲分別共有1 726和1 484個OTU。其中茅臺黃曲和白曲共有OTU主要注釋結(jié)果為芽孢桿菌屬(8.86%)、嗜熱放線菌屬(4.52%)、乳桿菌屬(4.40%)和Kroppenstedtia(2.14%)等。堯治河黃曲和白曲共有OTU主要注釋結(jié)果為嗜熱放線菌屬(29.99%)、糖多孢菌屬(10.85%)、芽孢桿菌屬(4.18%)和Kroppenstedtia(4.11%)等。

圖2 不同地區(qū)和顏色高溫大曲共有OTU分析Fig.2 OTUs shared by high-temperature Daqu in different regions and colors

此外,茅臺和堯治河不同顏色大曲共有OTU中分別有58.40%和34.30%無法鑒定到屬水平。上述結(jié)果顯示2個地區(qū)不同顏色高溫大曲共有菌群存在較大差異,同時茅臺大曲中存在較大比例的獨有菌群,對于大曲中在屬水平未能得到有效注釋的菌群需要后續(xù)研究進(jìn)一步挖掘和解析。

2.3 不同地區(qū)和顏色高溫大曲菌群α多樣性分析

α多樣性指標(biāo)可以反映不同樣品中菌群的豐度和多樣性差異。本研究分別使用Chao1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)的OTU數(shù)及Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)表征高溫大曲中菌群的豐度和多樣性信息,結(jié)果如圖3所示。各個指標(biāo)的結(jié)果均顯示堯治河高溫大曲菌群的豐度和多樣性顯著低于茅臺高溫大曲(P<0.05)。同時,與黃曲相比,白曲中菌群的豐度和多樣性會更高,但同一地區(qū)兩種顏色大曲菌群α多樣性差異不顯著(P>0.05)。

a-Chao1指數(shù)；b-發(fā)現(xiàn)的OTU數(shù)；c-Shannon指數(shù)；d-Simpson指數(shù)圖3 不同地區(qū)和顏色高溫大曲菌群α多樣性分析Fig.3 α-Diversity analysis of high-temperature Daqu in different regions and colors

2.4 不同地區(qū)和顏色高溫大曲菌群β多樣性分析

為了直觀的展現(xiàn)不同地區(qū)和不同顏色高溫大曲菌群群落結(jié)構(gòu)異同,本研究分別基于Binary Jaccard距離和Bray-Curtis距離進(jìn)行了主坐標(biāo)分析,結(jié)果如圖4所示?；贐inary Jaccard距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示(圖4-a),2個地區(qū)的樣品間存在明顯的分離趨勢,而同一地區(qū)不同顏色的大曲樣品間則存在明顯的重疊。基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析結(jié)果顯示(圖4-b),茅臺白曲與堯治河高溫大曲間存在明顯分離趨勢,而茅臺黃曲與堯治河高溫大曲存在一定重疊現(xiàn)象。此外,基于上述兩種距離的置換多元方差分析結(jié)果均表明,上述4組樣品菌群群落結(jié)構(gòu)差異具有顯著性(P=0.001),并且地區(qū)對酒曲菌群的影響大于曲塊顏色。

a-Binary Jaccard距離；b-Bray-Curtis距離圖4 基于Binary Jaccard距離和Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析Fig.4 Principal coordinate analysis based on Binary Jaccard distance and Bray-Curtis distance

2.5 不同地區(qū)和顏色高溫大曲菌群差異比較

為比較不同顏色高溫大曲菌群群落結(jié)構(gòu)的差異,分別使用Mann-Whitney秩和檢驗比較了同一地區(qū)不同顏色大曲菌群在屬水平的差異,結(jié)果如表1所示。

由表1可知,2個地區(qū)白曲中芽胞桿菌屬、乳桿菌屬和魏斯氏菌屬(Weissella)的相對含量均顯著高于黃曲(P<0.05)。此外,在茅臺白曲中,明串珠菌屬(Leuconostoc)和溶桿菌屬(Lysobacter)的相對含量顯著高于黃曲(P<0.05),而糖多孢菌屬相對含量顯著低于黃曲(P<0.05)。為了分析不同地區(qū)高溫大群菌落結(jié)構(gòu)差異,本研究進(jìn)一步對2個地區(qū)相同顏色的大曲菌群在屬水平進(jìn)行了Mann-Whitney秩和檢驗,結(jié)果如表2所示。

表1 相同地區(qū)不同顏色大曲間相對含量存在顯著差異的菌屬Table 1 Bacterial genera with significant differences in relative abundance between Daqu of the same region and different colors

表2 相同顏色不同地區(qū)大曲間相對含量存在顯著差異的菌屬Table 2 Bacterial genera with significant differences in relative abundance between Daqu of same color and different regions

由表2可知,堯治河大曲與茅臺大曲相比,芽胞桿菌屬、腸球菌屬(Enterococcus)和無色桿菌屬(Achromobacter)的相對含量顯著較低(P<0.05)。此外,堯治河白曲中明串珠菌屬、乳桿菌屬、假單胞菌屬(Pseudomonas)、短波單胞菌(Brevundimonas)、溶桿菌屬和Anaerosalibacter的相對含量顯著低于茅臺白曲(P<0.05),堯治河黃曲中Apibacter相對含量顯著低于茅臺黃曲(P<0.05)。而嗜熱放線菌屬、乳球菌屬(Lactococcus)在堯治河大曲中的相對含量顯著較高(P<0.05),同時糖多孢菌屬在堯治河白曲中的相對含量顯著高于茅臺白曲(P<0.05)。

2.6 高溫大曲發(fā)酵菌群相關(guān)性分析

為了揭示高溫大曲中發(fā)酵菌群彼此間的相關(guān)關(guān)系,本研究分別對茅臺和堯治河高溫大曲優(yōu)勢菌屬進(jìn)行了Spearman Rank相關(guān)性檢驗,彼此間具有顯著相關(guān)關(guān)系(P<0.05)的菌屬如圖5所示。

a-茅臺；b-堯治河圖5 茅臺和堯治河高溫大曲優(yōu)勢菌屬相關(guān)性分析Fig.5 Correlation analysis of dominant bacterial genera in Maotai and Yaozhihe high-temperature Daqu

與堯治河大曲菌群相比,茅臺高溫大曲中菌群彼此間相關(guān)關(guān)系更強。在茅臺大曲中,芽胞桿菌屬與魏斯氏菌屬和明串珠菌屬之間具有顯著正相關(guān)性,而乳桿菌屬與寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)、無色桿菌屬彼此間呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。值得注意的是,同屬于變形菌門的勞爾氏菌屬(Ralstonia)、寡養(yǎng)單胞菌、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)和無色桿菌屬彼此間存在顯著正相關(guān)關(guān)系。在堯治河大曲中,嗜熱放線菌屬與葡萄球菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,與Kroppenstedtia呈顯著正相關(guān)關(guān)系。此外,芽胞桿菌屬和魏斯氏菌屬彼此間也存在顯著正相關(guān)關(guān)系。

2.7 高溫大曲發(fā)酵菌群功能差異分析

本研究使用PICRUSt軟件對大曲中微生物的基因功能進(jìn)行預(yù)測,并依據(jù)蛋白質(zhì)COG進(jìn)行功能注釋。所有大曲樣品共計注釋到4 792 COGs,這些COGs分別屬于23個功能大類,不同高溫大曲間存在顯著差異的功能大類如圖6所示。由圖6-a可知,茅臺白曲與黃曲相比,COG功能大類M、D、O、S、T、U、L和J顯著高于黃曲,COG功能大類K、E、I、Q、G顯著低于黃曲。而堯治河白曲和黃曲菌群COG功能大類之間不存在顯著差異。本研究進(jìn)一步比較了相同顏色茅臺大曲與堯治河大曲菌群功能差異,結(jié)果顯示2個地區(qū)白曲功能差異較大(圖6-b),而黃曲功能較為相似(圖6-c)。具體而言,堯治河白曲與茅臺白曲相比,COG功能大類I、R、V、K、E相對豐度顯著較高,預(yù)示著其菌群對原料中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)潛在利用率更高,而O、M、U、T、S、Z顯著較低；此外,堯治河黃曲中COG功能大類V和R相對豐度顯著高于茅臺黃曲。

2.8 高溫大曲發(fā)酵菌群表型的差異分析

本研究使用BugBase工具對大曲中細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測,各組大曲表型分析結(jié)果如圖7所示。堯治河白曲和黃曲菌群所有表型均不存在顯著差異(P>0.05),而茅臺白曲和黃曲菌群表型差異較大。同時,2個地區(qū)間的酒曲菌群表型也存在較大差異。具體而言,茅臺白曲與黃曲相比,好氧菌、兼性厭氧菌、革蘭氏陽性菌相對豐度顯著較低,而革蘭氏陰性菌相對豐度顯著較高。堯治河高溫大曲與茅臺高溫大曲相比,厭氧菌、革蘭氏陽性菌、致病潛力相對豐度顯著較高,而生物膜形成、移動原件含量、革蘭氏陰性菌相對豐度顯著較低。

D-細(xì)胞周期控制,細(xì)胞分裂,染色體分割；E-氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝；G-碳水化合物運輸和代謝；I-脂質(zhì)運輸和代謝；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成；K-轉(zhuǎn)錄；L-復(fù)制、重組和修復(fù)；M-細(xì)胞壁/膜/包膜生物發(fā)生；O-翻譯后修飾,蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn),伴侶；Q-次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝；R-一般功能預(yù)測預(yù)測；S-功能未知；T-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；U-細(xì)胞內(nèi)運 輸、分泌和囊泡運輸；V-防御機制；Z-細(xì)胞骨架 a-茅臺白曲和黃曲;b-茅臺白曲和堯治河白曲;c-茅臺黃曲和堯治河黃曲圖6 不同地區(qū)和不同顏色高溫大曲菌群功能差異分析Fig.6 Functional difference analysis of high-temperature Daqu flora in different regions and colors

3 討論與結(jié)論

白酒的生產(chǎn)在我國呈現(xiàn)出明顯的地域區(qū)分,如赤水河產(chǎn)區(qū)孕育了茅臺、郎酒等醬香型白酒企業(yè),而長江宜瀘產(chǎn)區(qū)則孕育了五糧液、瀘州老窖等濃香型白酒企業(yè)。由于白酒生產(chǎn)的區(qū)域性,國內(nèi)的白酒科研團(tuán)隊亦常立足于某一區(qū)域的釀酒基質(zhì)微生物開展研究,加之部分釀酒基質(zhì)的保密性和稀缺性,最終導(dǎo)致很少有研究將不同地域、不同企業(yè)所蘊含的釀酒微生物進(jìn)行比較分析。近10年來,以454焦磷酸測序、Illumina MiSeq和HiSeq測序為代表的第二代高通量測序技術(shù)在發(fā)酵食品微生物多樣性解析中廣泛應(yīng)用[13-15],產(chǎn)生了海量的測序數(shù)據(jù),其中部分?jǐn)?shù)據(jù)上傳至國際公共數(shù)據(jù)庫。作為中國三大名酒之一,茅臺酒在醬香型白酒中的地位不言而喻,多數(shù)醬香型白酒生產(chǎn)企業(yè)常以其作為標(biāo)桿進(jìn)行產(chǎn)品工藝的完善。本研究從國際公共數(shù)據(jù)庫中下載了茅臺大曲細(xì)菌多樣性的測序數(shù)據(jù),同時將其與湖北省襄陽市堯治河楚翁泉酒業(yè)醬香型白酒高溫大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、功能和表型進(jìn)行了比較分析,一方面探究堯治河生產(chǎn)的高溫大曲與茅臺高溫大曲之間的共性和差異,另一方面亦期望為襄陽乃至湖北地區(qū)醬香型白酒高溫大曲制曲工藝的改良提供數(shù)據(jù)支撐和尋求方向。

本研究結(jié)果顯示,2個地區(qū)的高溫大曲細(xì)菌主要由芽胞桿菌屬、嗜熱放線菌屬、葡萄球菌屬、Kroppenstedtia等組成,優(yōu)勢菌群種類與之前的研究結(jié)果基本一致[16-17],這些菌屬代表了高溫大曲中3個主要的微生物組成部分：嗜熱菌(嗜熱放線菌屬和Kroppenstedtia)、原料中的優(yōu)勢菌(芽胞桿菌屬)和加工環(huán)境優(yōu)勢菌(葡萄球菌屬)。嗜熱放線菌屬和Kroppenstedtia耐熱能力強,在高溫大曲中經(jīng)常被檢測到。嗜熱放線菌屬具有提供豐富風(fēng)味物質(zhì)和風(fēng)味前體的潛在功能[18],例如,隸屬于嗜熱放線菌屬的普通嗜熱放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)和糖化嗜熱放線菌(Thermoactinomycessacchari)不僅具有分泌淀粉酶、酯酶、纖維素酶、果膠酶和磷酸酶的能力,而且還能產(chǎn)生具有醬香味的風(fēng)味物質(zhì),這對于白酒最終的風(fēng)味至關(guān)重要[19-20]。然而,目前對于Kroppenstedtia的發(fā)酵特性鮮有報道,需要進(jìn)一步的研究揭示。芽胞桿菌屬是各類白酒發(fā)酵中的常見菌和優(yōu)勢菌,芽胞桿菌分泌的淀粉酶和蛋白酶能將淀粉和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖和氨基酸,促進(jìn)白酒發(fā)酵過程中風(fēng)味化合物前體如2-5-二甲基吡嗪和四甲基吡嗪的形成[21-23],因此其對于白酒發(fā)酵亦非常重要。之前基于醬油和韓國豆醬的研究發(fā)現(xiàn),葡萄球菌屬在發(fā)酵過程中可以提供各種酶和抗菌潛力[24-25],因此該菌屬在白酒發(fā)酵中可能也具有一定的作用。值得注意的是,高溫大曲核心菌群的分析結(jié)果顯示,雖然在屬水平2個地區(qū)的大曲優(yōu)勢菌群類似,但在更精細(xì)化的分類學(xué)水平上,如種水平或者株水平,兩者之間存在較大差異；同時茅臺大曲中存在較大比例的獨有菌群,這應(yīng)該是導(dǎo)致后續(xù)分析中2個地區(qū)大曲菌群功能存在較大差異的重要原因之一。

α多樣性結(jié)果表明,堯治河高溫大曲中微生物的豐度和多樣性均顯著低于茅臺大曲。β多樣性結(jié)果證實了2個地區(qū)大曲的群落結(jié)構(gòu)亦存在明顯的區(qū)別,且這種區(qū)別主要體現(xiàn)在白曲上。眾所周知,黃色大曲形成的溫度要高于白色大曲,因而為了尋找導(dǎo)致2個酒企高溫大曲菌群群落結(jié)構(gòu)差異的原因,本研究首先確認(rèn)了溫度(顏色)與大曲菌群之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn),大曲中芽胞桿菌屬、乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、明串珠菌屬和溶桿菌屬的相對含量均隨著溫度的升高而下降,而糖多孢菌屬相對含量隨著溫度升高而升高。通過對比堯治河和茅臺酒曲中的差異菌群,如嗜熱放線菌屬和糖多孢菌屬在堯治河酒曲中的相對含量顯著較高,而芽胞桿菌屬和乳桿菌屬相對含量顯著較低,我們不難推測導(dǎo)致堯治河酒曲與茅臺酒曲菌群群落結(jié)構(gòu)差異的一個重要因素是堯治河制曲時的發(fā)酵溫度相較茅臺酒曲更高。菌群相關(guān)性分析結(jié)果表明,茅臺酒曲菌群間存在更為密切的相關(guān)關(guān)系,這一方面有利于酒曲中菌群群落結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定[26],同時大量菌屬彼此間存在顯著正相關(guān)關(guān)系,對于微生物彼此相互協(xié)作產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物也具有積極作用,這可能是茅臺酒風(fēng)味幽雅細(xì)膩、持久穩(wěn)定、回味悠長的關(guān)鍵因素之一。

a-好氧菌；b-厭氧菌；c-兼性厭氧菌；d-生物膜形成；e-移動元件；f-革蘭氏陰性菌；g-革蘭氏陽性菌；h-致病潛力；i-脅迫耐受圖7 不同地區(qū)和顏色高溫大曲菌群表型差異分析Fig.7 Phenotypic difference analysis of high-temperature Daqu in different regions and colors

高溫大曲發(fā)酵菌群功能分析結(jié)果表明,黃曲中菌群的功能大類如E、I、Q、G相對豐度顯著較高,這些功能對于菌群降解原料中的淀粉和蛋白質(zhì)及產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物至關(guān)重要,這可能是黃色大曲用于醬香型白酒生產(chǎn)時產(chǎn)品品質(zhì)最佳的原因[27],而白曲中相對含量顯著較高的的功能如M、D、O、T、U、L和J更多的與菌群的生產(chǎn)繁殖有關(guān),表明白曲中微生物彼此間的生長競爭更加激烈[28]。高溫大曲發(fā)酵菌群表型分析結(jié)果顯示,堯治河高溫大曲中革蘭氏陽性菌和致病潛力相對含量顯著較高(P<0.05),這與堯治河大曲中嗜熱放線菌屬和葡萄球菌屬的相對含量較高有關(guān)。同時,其菌群移動元件相對含量顯著較低,這表明堯治河高溫大曲中菌群對發(fā)酵環(huán)境的適應(yīng)性要弱于茅臺[29]。

綜上所述,堯治河高溫大曲制作溫度相較茅臺大曲更高,同時大曲中的重要發(fā)酵菌屬芽胞桿菌屬相對含量顯著較低,因此,在后續(xù)的制曲過程中適當(dāng)降低制曲溫度,同時嘗試具有優(yōu)良發(fā)酵特性芽胞桿菌屬的外源添加,可能對提升堯治河醬香型大曲及最終白酒的品質(zhì)具有積極的意義。值得一提的是,由于本研究所選取的OTU劃分方式、比對數(shù)據(jù)庫和計算參數(shù)等與原來的研究可能不盡相同,因此可能導(dǎo)致本研究的部分結(jié)果與原有研究報道稍有不同。