宗晗,杜聰,李益民,袁文杰

(大連理工大學 生物工程學院,遼寧 大連,116023)

傳統(tǒng)化石能源面臨的問題凸顯[1-3],燃料乙醇可作為可再生清潔能源替代化石能源[4]。纖維素乙醇以木質(zhì)纖維素為原料,來源廣泛且充足[5]?！蛾P(guān)于擴大生物燃料乙醇生產(chǎn)和推廣使用車用乙醇汽油的實施方案》中明確指出,到2025年力爭實現(xiàn)纖維素乙醇的規(guī)模化生產(chǎn)[6]。

纖維素原料經(jīng)預處理產(chǎn)生葡萄糖、木糖以及其他單糖[7]。纖維素乙醇目前尚沒完成大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn),還存在幾個挑戰(zhàn)。其中,預處理步驟通常會產(chǎn)生各種木質(zhì)纖維素衍生化合物,如脂肪酸、呋喃衍生物和幾種酚類化合物[8]。這些化合物抑制微生物發(fā)酵,即使在低濃度時也能抑制細胞的生長[9]。木質(zhì)纖維素水解液中主要的酸類抑制物有甲酸和乙酸,其中甲酸毒性較大[10]。醛類抑制物有糠醛和五羥甲基糠醛,酚類抑制物主要有香草醛。酸類抑制物導致細胞內(nèi)酸化[11],進而導致細胞內(nèi)的ATP含量減少,細胞代謝緩慢甚至死亡[12]?？啡┖?-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)是水解液中主要的醛類毒性物質(zhì),據(jù)報道5-HMF可以抑制酵母細胞生長與減少乙醇的產(chǎn)量,有研究表明醛類抑制表現(xiàn)在降低酵母細胞中的蛋白質(zhì)含量[13]。

能夠利用木糖并能有效代謝產(chǎn)生乙醇的微生物,是木質(zhì)纖維素乙醇工藝成為具有經(jīng)濟競爭力的前提條件[14]。裂殖酵母Pichiastipitis[15],假絲酵母Candidashehatae[16],Kluyveromycesmarxianus[17-18]都可以發(fā)酵葡萄糖和木糖,乙醇生產(chǎn)速率和產(chǎn)率遠遠低于葡萄糖。最近發(fā)現(xiàn)的Spathasporapassalidarum是一種存在于木材中的甲蟲消化道內(nèi)的酵母,可以在有氧和無氧條件下發(fā)酵木糖,其效率要比P.stipitis的發(fā)酵效率更高[19-21]。

研究證明乙醇積累量與通氣量呈正相關(guān)。S.passalidaram在氧氣限制后,比生長速率下降,乙醇生產(chǎn)速率卻大幅增加[22]。氧氣在酵母發(fā)酵過程中并不是越多越好,通入量應該有一個最優(yōu)值。用氧化還原電位(oxidation-reduction potential,ORP)來表征和控制發(fā)酵過程中氧氣的通入量,可以找到一個最優(yōu)設定值使得發(fā)酵能力最大。在調(diào)控ORP策略下,多種混合抑制物對K.marxianus酵母生長代謝的影響,發(fā)現(xiàn)不僅產(chǎn)物濃度顯著增加,酵母細胞對玉米秸稈水解液多種抑制物的耐受性也提高了[23-24]。通氣量的優(yōu)化在S.passalidarum發(fā)酵不脫毒纖維素水解液中發(fā)酵中的作用同樣至關(guān)重要。

本研究利用天然木糖發(fā)酵優(yōu)勢菌株S.passalidarum,以不脫毒纖維素水解液為底物,采用ORP調(diào)控和恒定通氣2種策略研究微量通氣對發(fā)酵過程的影響,提高S.passalidarum抑制物耐受性的同時,縮短發(fā)酵時間,降低生產(chǎn)成本,為纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗儀器

酶標儀,Thermo公司；5415R離心機,SIGMA公司；KG-SX-500高壓滅菌鍋,TOMY公司；Waters 1525高效液相色譜儀,美國Waters公司。

1.1.2 實驗試劑

無水葡萄糖、混合糖[m(葡萄糖)∶m(木糖)=1∶1]、酵母浸粉、瓊脂粉、木糖醇、蛋白胨、木糖、冰乙酸、無水甲酸、糠醛、丙三醇、5-羥甲基糠醛、無水乙醇。

1.1.3 菌株

(SpathasporapassalidarumATCC MYA-4345),美國菌種保藏中心,實驗室保藏編號為1710,由大連理工大學生物工程學院保藏。菌種在40%甘油中于-80 ℃長期保存。

1.1.4 培養(yǎng)基

活化培養(yǎng)基(YPD)(g/L)：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20。121 ℃滅菌 20 min。

種子培養(yǎng)基1：同活化培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基2(g/L)：酵母浸粉10、蛋白胨20、葡萄糖20、木糖10。121 ℃滅菌 20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基1(g/L)：酵母浸粉5、蛋白胨5、混合糖50[m(葡萄糖)∶m(木糖)=1∶1]。115 ℃滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基2(g/L)：酵母浸粉5、蛋白胨5、混合糖50[m(葡萄糖)∶m(木糖)=1∶1]、乙酸1、無水甲酸0.3、糠醛0.4、五羥甲基糠醛0.3、香草醛0.1。115 ℃滅菌15 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)及發(fā)酵條件

首先從-80 ℃冰箱中取出菌種1710,經(jīng)過無菌操作接種到含有約5 mL活化培養(yǎng)基的小瓶中過夜培養(yǎng)12～16 h活化菌體。然后將活化好的菌液取出1 mL接種到裝有100 mL種子培養(yǎng)基1的250 mL三角瓶中過夜培養(yǎng)12～16 h進行第一次擴大培養(yǎng)。然后將第一次擴大培養(yǎng)得到的菌液取20 mL接種到裝有200 mL種子培養(yǎng)基2的500 mL三角瓶中過夜二次擴大培養(yǎng)。將二次擴大培養(yǎng)得到的菌懸液利用酶標儀測菌體濃度后,收集菌體,然后用生理鹽水重懸菌體之后接種到發(fā)酵罐,接種后使得裝液量2 L的發(fā)酵罐(總體積5 L)內(nèi)菌體濃度OD600約為0.7。然后進行相關(guān)發(fā)酵實驗。

培養(yǎng)條件：溫度30 ℃、轉(zhuǎn)速150 r/min。

1.2.2 通氣調(diào)控

恒定通氣策略：發(fā)酵罐接種后,打開氣泵,通過空氣流量計來調(diào)節(jié)通入發(fā)酵罐無菌空氣的量,在利用發(fā)酵培養(yǎng)基2進行發(fā)酵實驗時,依次設定通氣量分別為0.5、1.0、1.5、2.0 vvm。

ORP調(diào)控策略：利用通入無菌空氣控制發(fā)酵過程ORP穩(wěn)定在設定值(±2 mV)。探究ORP對無抑制物情況下混合糖(發(fā)酵培養(yǎng)基1)發(fā)酵的影響時,分別控制ORP為-150、-130、-110 mV；探究ORP對抑制物存在情況下混合糖(發(fā)酵培養(yǎng)基2)發(fā)酵的影響時,分別設定值為-140、-130、-120、-110、-100、-90 mV；最后探究滅菌及發(fā)酵pH的變化對抑制物存在情況下混合糖(發(fā)酵培養(yǎng)基2)發(fā)酵的影響,設定ORP為最優(yōu)值。ORP電極(Pt4805-DPAS-SC-K8S/225,Mettler Toledo,Switzerland)監(jiān)測發(fā)酵過程中氧化還原電位變化,并連接至ORP控制儀((pH/ORP Transmitter PC-3100,Suntex,China),當發(fā)酵過程中氧化還原電位值低于預設值時,控制儀開啟氣泵通入無菌空氣,直至達到預設值(+2 mV),然后關(guān)閉氣泵。

1.2.3 發(fā)酵底物和產(chǎn)物量的測定

發(fā)酵過程中,接種后取樣為發(fā)酵起始點,測此時生物量,并將樣品5 000 r/min離心5 min后留上清液凍存,之后每隔12 h取1次樣,重復以上操作,直至發(fā)酵結(jié)束。

最后通過高效液相色譜檢測所存樣品中糖以及各種代謝產(chǎn)物濃度的變化。

生物量測定方法：將菌液適當稀釋,用酶標儀于波長600 nm 處測定吸光度值記為OD600。

發(fā)酵底物和產(chǎn)物量的測定：發(fā)酵過程的取樣樣品在5 000 r/min下離心5 min,取上清液,用孔徑為0.22 μm的水膜過濾,利用HPLC測定木糖、葡萄糖、木糖醇、甘油、乙酸和乙醇的含量。色譜柱的型號為 AminexHPX-87H,有機酸分析柱。流動相為稀硫酸(0.005 mol/L),流速為0.4 mL/min,柱溫為60 ℃,使用示差檢測器。

2 結(jié)果與分析

2.1 木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物對S.passalidarum發(fā)酵性能的影響

5 L發(fā)酵罐裝液量2 L,圖1-a中所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基1,圖1-b中所用培養(yǎng)基為發(fā)酵培養(yǎng)基2。1710菌種從-80 ℃冰箱中取出經(jīng)活化和擴大培養(yǎng)之后接種到已經(jīng)滅菌后的發(fā)酵罐中,考察菌株1710對混合糖發(fā)酵的能力和加入木質(zhì)纖維素預處理產(chǎn)生的主要抑制物,1710在混合糖培養(yǎng)基中發(fā)酵能力，結(jié)果如圖1所示。發(fā)酵培養(yǎng)基無水解抑制物添加時,菌株1710可以對葡萄糖和木糖進行共發(fā)酵,但是木糖發(fā)酵速度要明顯慢于葡萄糖,葡萄糖迅速被利用,12 h基本耗盡后木糖被消耗,36 h基本被耗盡,在此期間菌體濃度逐漸增加,到36 h菌體濃度達到最大。

a-不添加水解抑制物；b-添加水解抑制物圖1 菌株1710對混合糖的發(fā)酵情況Fig.1 Fermentation in the mixture sugar by 1710 strain

OD600≈4,乙醇濃度隨著發(fā)酵的進行逐漸增加,36 h乙醇產(chǎn)量為19.46 g/L,糖醇轉(zhuǎn)化率為0.46 g/g；當發(fā)酵培養(yǎng)基中添加水解產(chǎn)生的抑制物時,葡萄糖消耗變得十分緩慢,而木糖基本不消耗,菌體濃度也很小,最大菌體濃度OD600≈1,12 h才開始有乙醇生成,96 h內(nèi)共產(chǎn)生乙醇4.13 g/L。

菌株1710作為天然混合糖發(fā)酵菌株生產(chǎn)纖維素乙醇具有顯著優(yōu)勢,它不僅具有同步發(fā)酵葡萄糖木糖的能力,而且發(fā)酵時間短,糖醇轉(zhuǎn)化率遠高于其他發(fā)酵木糖的酵母,但是也可以看出,菌株1710對纖維素抑制物的抗性較弱,加入水解產(chǎn)生的抑制物之后對1710發(fā)酵能力產(chǎn)生了巨大影響,因此需要優(yōu)化發(fā)酵條件來克服這個問題。

2.2 無水解抑制物時ORP調(diào)控對菌株1710發(fā)酵性能的影響

微量通氣有利于酵母發(fā)酵能力的提高,但不同通氣方式對發(fā)酵結(jié)果的影響很大。本實驗首先通過ORP控制通氣量,研究其對菌株1710發(fā)酵混合糖的作用。1710菌種經(jīng)活化和擴大培養(yǎng)之后將菌種接種到已經(jīng)滅菌后的含有發(fā)酵培養(yǎng)基1的發(fā)酵罐中,設定ORP值分別為-150,-130,-110 mV進行發(fā)酵,由圖2可以看出,隨著ORP設定值的增加,菌株1710葡萄糖效應先減弱又增強,葡萄糖木糖共發(fā)酵的能力逐步提高后又降低,在ORP為-130 mV時共發(fā)酵能力最強；糖醇轉(zhuǎn)化率也是先升高后降低,分別為0.46 g/g(不調(diào)控ORP)、0.47、0.48、0.43 g/g。隨著ORP設定值的增加,菌體濃度逐步提高,最高達OD600≈8。尤為重要的是提高ORP能夠縮短發(fā)酵時間,不調(diào)控ORP值時,50 g/L混合糖耗盡需要36 h左右,調(diào)控ORP值(-130 mV)發(fā)酵時間縮短到24 h,提高了木糖利用速率。但是超出一定范圍后,過高的ORP值促進生物量的過量生長,降低了乙醇的得率。因此適當提高氧化還原電位在一定范圍內(nèi)有利于葡萄糖和木糖的發(fā)酵。

a-ORP=-150 mV;b-ORP=-130 mV;c-ORP=-110 mV圖2 無木質(zhì)纖維素水解抑制物時1710的發(fā)酵情況Fig.2 Fermentation without lignocellulose hydrolysis inhibitor by 1710

2.3 水解抑制物存在時ORP調(diào)控對菌株1710發(fā)酵性能的影響

將菌株1710菌種接種到已經(jīng)滅菌后的含有發(fā)酵培養(yǎng)基2的發(fā)酵罐中。因為水解產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物的添加會影響發(fā)酵體系中的氧化還原水平,因此將ORP值設定為-140、-130、-120、-110、-100、-90 mV。結(jié)果如圖3所示。在多種抑制物存在的情況下,隨著ORP設定值的提高,同樣可以減弱葡萄糖效應,有利于葡萄糖木糖的共發(fā)酵。ORP值提高到-100 mV時木糖消耗速率最快,繼續(xù)提高ORP值為-90 mV時,木糖消耗速率反而開始降低。從不調(diào)控ORP值到-120 mV時木糖沒有明顯消耗；當ORP值提高到-110 mV,木糖耗盡需要48 h左右,隨著設定值進一步提高木糖耗盡所需要的時間基本維持在36 h左右,見圖3-a。隨著ORP值的逐步提高,葡萄糖消耗速率也逐步提高,當ORP值提高到-100 mV,葡萄糖消耗速率最大,ORP值進一步提高到-90 mV時,葡萄糖消耗速率也開始減慢。而且隨著ORP值的提高,葡萄糖消耗從開始的極慢縮短到24 h。如圖3-b所示。

圖3-c顯示的是發(fā)酵產(chǎn)物乙醇的積累情況。ORP值設定為-140 mV時,36 h才開始有乙醇生成,隨著ORP值的提高,乙醇的生產(chǎn)效率逐步提高,當ORP值提高到-100 mV,乙醇生成速率最大,ORP值進一步提高到-90 mV時,乙醇生產(chǎn)速率又減慢,與兩種糖的消耗呈現(xiàn)相同規(guī)律。在ORP值為-110 mV時糖醇轉(zhuǎn)化率最大,48 h時為0.47 g/g。隨著ORP值進一步提高,乙醇產(chǎn)量降低,而且乙醇的損耗也隨之增加。

隨著ORP值的逐步提高,菌體的生長速率先增大后減小,如圖3-d所示。ORP值設定為-110 mV時,菌體具有最高生長速率。但是菌體的最終濃度是隨著ORP值的增大而增大,當ORP值設定為-90 mV時,發(fā)酵最終菌體濃度最大為OD600≈3.2。

總的來說,通過ORP控制發(fā)酵液的微量通氣,能夠顯著提高1710在發(fā)酵培養(yǎng)基2中的發(fā)酵能力,發(fā)酵時間顯著縮短,糖醇轉(zhuǎn)化率明顯提高,而且結(jié)合多方面因素考慮,最優(yōu)ORP調(diào)控值為-110 mV。

a-木糖濃度；b-葡萄糖濃度；c-乙醇濃度；d-OD600圖3 添加水解抑制物后ORP調(diào)控對菌株1710發(fā)酵的影響Fig.3 Effect of ORP regulation on fermentation of 1710 after adding hydrolysis inhibitor

2.4 水解抑制物存在時恒定通氣對菌株1710發(fā)酵性能的影響

恒定通氣是通過空氣流量計調(diào)節(jié)發(fā)酵罐通氣量,是實現(xiàn)微量通氣的另一種簡單易行的方法。我們采用不同的通氣量研究添加水解產(chǎn)生的發(fā)酵抑制物情況下的混合糖發(fā)酵情況,與ORP控制策略進行對比。1710菌種接種到含有發(fā)酵培養(yǎng)基2的發(fā)酵罐中,分別設定發(fā)酵通氣量為0.5、1.0、1.5、2.0 vvm。從發(fā)酵結(jié)果來看,隨著通氣量的提高,葡萄糖消耗速率基本不變,葡萄糖耗盡需要24 h,木糖耗盡需要36 h。但是隨著通氣量的提高,糖醇轉(zhuǎn)化率分別為0.39、0.32、0.23、0.19 g/g,且生物量表現(xiàn)出逐步增多的現(xiàn)象。說明隨通氣量的增加,更多的底物用于細胞生長從而降低了乙醇得率。對比2.3實驗結(jié)果可知,當ORP值設定為-110 mV時,葡萄糖和木糖發(fā)酵時間與0.5 vvm通氣量條件下基本一致,但是ORP控制策略下的糖醇轉(zhuǎn)化率0.47 g/g 要遠高于恒定通氣條件下的0.39 g/g。因此,對于菌株1710發(fā)酵,ORP調(diào)控策略要優(yōu)于恒定通氣策略。

a-0.5 vvm；b-1.0 vvm；c-1.5 vvm；d-2.0 vvm圖4 添加水解抑制物后恒定通氣對菌株1710發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of constant aeration on fermentation of 1710 strain after adding hydrolytic inhibitor

2.5 最優(yōu)ORP控制時培養(yǎng)基pH對1710發(fā)酵性能的影響

由前述實驗可知,采用ORP調(diào)控策略并設定ORP值為-110 mV能夠顯著提高1710在添加木質(zhì)纖維素水解抑制物時的發(fā)酵效果。曾有文獻報道,高溫滅菌時,會發(fā)生美拉德反應抑制發(fā)酵過程。因此糖濃度比較高的培養(yǎng)基滅菌時,通常會采用糖溶液單獨滅菌后再混合的方法進行,但增加了操作步驟和染菌的可能性。本實驗室之前的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),滅菌時將pH設定在pH 2.5～3.5,會減弱美拉德反應,可能會進一步提高菌株1710的發(fā)酵能力。但酵母發(fā)酵的最適pH一般選取5,因此滅菌前調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為3,滅菌完成后加NaOH調(diào)節(jié)pH為5進行發(fā)酵,ORP值為-110 mV,結(jié)果如圖5-a所示。1710對葡萄糖和木糖共發(fā)酵,發(fā)酵時間由48 h減少到24 h,縮短了一半,而且糖醇轉(zhuǎn)化率仍然保持不變。但如果pH 3滅菌后不再調(diào)節(jié)pH,直接進行發(fā)酵,則基本無法進行(圖5-b)。由上結(jié)果可見,麥拉德反應產(chǎn)物和pH對酵母的木糖發(fā)酵都存在重要的影響,并且可以推測pH對酵母發(fā)酵的影響大于麥拉德反應的抑制作用。因此,在纖維素水解液發(fā)酵時,如果能進行水解液的不脫毒、不滅菌直接發(fā)酵,在降低成本的同時,還能大大提高發(fā)酵效率。

a-pH=5；b-pH=3圖5 ORP控制時培養(yǎng)基pH對1710發(fā)酵混合糖的影響Fig.5 Effect of initial pH under ORP control with mixture sugar and inhabitor

3 結(jié)論

本研究考察了2種通氣策略下,S.passalidarum對添加有多種木質(zhì)纖維素水解抑制物的混合糖(葡萄糖和木糖)的發(fā)酵能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn),適當通氣可提高S.passalidarum對添加有多種木質(zhì)纖維素水解抑制物的混合糖發(fā)酵能力,并且ORP調(diào)控通氣策略要優(yōu)于恒定通氣策略。當ORP控制在-110 mv時,發(fā)酵速度和糖醇轉(zhuǎn)化率達到最優(yōu),發(fā)酵時間48 h,糖醇轉(zhuǎn)化率達0.47 g/g。在此基礎(chǔ)上,通過調(diào)整滅菌前培養(yǎng)基的pH為3,滅菌后調(diào)整pH為5時,在保持糖醇轉(zhuǎn)化率不降低的情況下,發(fā)酵時間縮短到24 h,生產(chǎn)效率提高1倍,為纖維素水解液的生產(chǎn)燃料乙醇提供了新的解決方案。