于志海,岳利容,王青,伍佳勝,鐘小祥,劉曉柱,黃名正

(貴州理工學(xué)院 食品藥品制造工程學(xué)院,貴州 貴陽,550003)

刺梨(RosaroxburghiiTratt.)系薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布于我國西南地區(qū)，因其全身布刺且果實呈梨狀得名。刺梨果實富含多糖[1]、黃酮、維生素C、維生素P和超氧化物歧化酶[2]等多種功能物質(zhì)，具有降血糖血脂[2]、抗氧化[3]、抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵入[4]、抗細(xì)胞凋亡[5]、抗輻射[6]和防止DNA損傷[7]等功能，具有較大的開發(fā)潛力。但刺梨的適口性差(酸、澀、苦)[8]，單果重低(15 g 左右)[9]、采收期短，不宜儲藏，嚴(yán)重影響了鮮果的銷售。刺梨露酒的制作和食用在貴州民間具有悠久的歷史。利用刺梨釀造果酒具有優(yōu)勢[10]。實驗室前期的調(diào)研結(jié)果顯示,刺梨果實香氣獨特持久，受發(fā)酵過程影響較小，酒體果香突出，易形成穩(wěn)定而清澈的酒體[8]。

目前釀造刺梨酒所使用的均為葡萄來源的商業(yè)釀酒酵母，未見到刺梨來源的釀酒酵母，而實際上刺梨果酒的發(fā)酵急需優(yōu)質(zhì)釀酒酵母。如何從刺梨中分離到優(yōu)質(zhì)釀酒酵母成為行業(yè)內(nèi)的一個突出問題。當(dāng)前對刺梨中酵母的研究較少，僅局限于非釀酒酵母。如劉曉柱等[11]對刺梨自然發(fā)酵過程中非釀酒酵母生物多樣性的變化進行了研究，從刺梨中分離到了3株能對刺梨自然發(fā)酵過程香氣成分進行調(diào)節(jié)的非釀酒酵母，1株是高產(chǎn)β-糖苷酶的嗜殺酵母C4[8]，另2株分別為葡萄有孢漢遜酵母F13[12]和F119[13]。到目前為止尚未見到從刺梨中分離釀酒酵母的報道。本研究擬從刺梨果實中分離出與葡萄來源的商業(yè)化釀酒酵母具有同等發(fā)酵效力的釀酒酵母，并進行深入研究，以利于刺梨果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

貴農(nóng)5號刺梨購自貴州省龍里縣；YPD、WLN培養(yǎng)基，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司；對照菌株ZYMAFLORE X16 ，Laffort公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，貴州博奧瑞杰生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UH5300紫外分光光度計，日本日立公司；雷磁 PHSJ-3F 型pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CKX41倒置顯微鏡，日本奧林巴斯公司；SA402B電子舌味覺系統(tǒng)，日本INSENT公司；TQ8040 NX氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津儀器有限公司。

1.3 菌株的分離與鑒定

稱取100 g新鮮成熟的刺梨果肉和果皮的混合物,移入250 mL無菌錐形瓶中,封口后置于28 ℃下自然發(fā)酵,分別于3、4、5 d取樣,直接在YPD固體平板上劃線,28 ℃培養(yǎng)48 h。隨后繼續(xù)挑取每個平板上的單克隆,劃線于YPD固體平板上,直至為純的單克隆為止。

挑取單克隆,分別劃線于YPD固體平板和鑒定培養(yǎng)基WLN固體平板[14]上,28 ℃培養(yǎng)5 d后,觀察菌株的生長狀態(tài)。

利用PCR擴增ITS序列,使用ITS1-ITS4通用引物對[15],反應(yīng)體系為2×Taq PCR Master Mix 25 μL,10 μmol/L ITS1引物和ITS4引物各2 μL,菌液2 μL,補水至總體積25 μL。結(jié)束后取8 μL PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測后,剩余部分送上海生工測序,結(jié)果在NCBI上進行BLAST同源序列搜索比對。利用目標(biāo)ITS序列,使用MEGA 7[16]構(gòu)建鄰接樹,1 000次Bootstrap自檢。同時利用DNAMAN軟件比較CZ和X16的ITS序列差異。

1.4 菌株生長曲線和碳水化合物代謝情況的確定

測定生長曲線時,將10 mL YPD液體培養(yǎng)基裝入15 mL玻璃試管中,然后在試管中接種菌液,終濃度為106CFU/mL菌液,混勻,30 r/min,28 ℃培養(yǎng),每20 h取樣一次,測定600 nm處的菌液吸光度(A600),直至80 h[17]。利用A600繪制生長曲線。

配制氮基礎(chǔ)液體培養(yǎng)基(YNB含氨基酸)[0.5%(NH3)2SO3,0.1% KH2PO3,0.01% NaCl,0.05% MgSO3,0.01% CaCl2,0.02%酵母提取物][18]測定菌株對不同碳源的利用能力,在該培養(yǎng)基中分別添加20 g/L的葡萄糖、D-半乳糖、D-木糖、D-阿拉伯糖、核蔗糖、D-麥芽糖、D-棉籽糖、水蘇糖、甘露醇和D-山梨醇,形成不同碳源的測試培養(yǎng)基。接種菌液到不同碳源的測試培養(yǎng)基中,終濃度為106CFU/mL,28 ℃,30 r/min,培養(yǎng)72 h后,測定A600。

1.5 釀酒潛力分析

15 mL的玻璃試管中裝載10 mL YPD液體培養(yǎng)基,接種菌液到該培養(yǎng)基中,終濃度為106CFU/mL,28 ℃,30 r/min,培養(yǎng)72 h后測A600,比較不同因素對菌株生長的影響[19]。

葡萄糖耐受性分析時在上述培養(yǎng)基中添加葡萄糖至終質(zhì)量濃度分別為100、200、400、600 g/L。酒精耐受性測試時添加無水乙醇至其終體積分?jǐn)?shù)分別為5%、9%、13%、17%。酸耐受性測試時用酒石酸/NaOH調(diào)pH分別為2.0、3.5、5.0、6.5。SO2耐受性測試時用偏重亞硫酸鉀將SO2的質(zhì)量濃度分別調(diào)至200、300、400、500 mg/L。

菌株產(chǎn)H2S的能力參照劉曉柱等[13]的方法。絮凝性測試參照楊詩妮等[20]的方法。

1.6 實驗室規(guī)模的發(fā)酵分析

2 L的三角瓶用于發(fā)酵分析,瓶口用自制的水封呼吸器封口。刺梨汁中添加50 mg/L的SO2,經(jīng)果膠酶過夜酶解后,用蔗糖將糖含量調(diào)至264 g/L,用酒石酸/碳酸氫鉀調(diào)pH至3.6。在刺梨汁中接種菌液使菌液終濃度均為106CFU/mL。發(fā)酵溫度控制在16～18 ℃。酒精發(fā)酵結(jié)束后,經(jīng)過約6個月的陳釀期,陳釀期內(nèi)進行倒罐處理,澄清穩(wěn)定后的原酒進行后續(xù)分析。

利用福林酚法[21]測定總酚含量。結(jié)果表示為g/L,多酚為相當(dāng)于沒食子酸的量。利用GB 5009.225—2016規(guī)定的酒精計法和2,6-二氯靛酚滴定法分別測定酒精度、抗壞血酸含量。利用蒽酮比色法測定總碳水化合物的含量[22]。

1.7 刺梨酒的抗氧化活性分析

1.7.1 鐵離子還原能力(ferric reducing antioxidant power,FRAP)法抗氧化活性測定

使用FRAP法測定抗氧化活性[23]。取0.2 mL適當(dāng)稀釋的刺梨酒樣,加入3.9 mL FRAP工作液(由0.3 mol/L醋酸鹽緩沖液,20 mmol/L FeCl3溶液,10 mmol/L TPTZ溶液按體積比10∶1∶1組成),混勻后37 ℃反應(yīng)20 min,測定反應(yīng)液在593 nm處的吸光度。使用0.2 mL不同濃度的FeSO3(0.025、0.2、0.4、0.6、0.8 mmol/L)溶液與3.9 mL FRAP工作液混合,37 ℃,20 min,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0.2 mL的0.4 mg/L的維生素C工作液替代刺梨果酒進行同樣操作。結(jié)果表示為100 mL酒樣相當(dāng)于維生素C的質(zhì)量。

1.7.2 DPPH法抗氧化活性測定

DPPH自由基活性清除法測定抗氧化活性[21]。取2 mL稀釋10倍的果酒樣品,與2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液混勻,室溫避光反應(yīng)30 min,在517 nm波長處測定吸光度Ai。同時以無水乙醇分別替代刺梨酒樣和DPPH,進行同樣操作,在517 nm處分別測得Ac和Aj。DPPH自由基清除率/%=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100,酒樣的DPPH自由基清除率按著等量關(guān)系換算成維生素C當(dāng)量,即100 mL刺梨酒樣相當(dāng)于維生素C的質(zhì)量。

1.8 感官及風(fēng)味分析

利用電子舌對刺梨酒進行滋味分析。采樣時間120 s,采樣速度為1 次/s,每個樣品平行測定3次,每個平行重復(fù)采集4次[13]。利用頂空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)和GC-MS分析刺梨果酒的香氣成分,參照劉曉柱等[13]的方法。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

以上所有試驗均重復(fù)3次,以葡萄酒來源的商業(yè)酵母X16作對照菌株[24]。所有數(shù)據(jù)表示為平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。利用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析,使用單因素ANOVA(Games-Howell’s 比較檢驗)比較各平均值的差異,同時利用t-test比較兩組平均數(shù)的差異,Prism 8.0用于繪圖。所有圖中的小寫字母表示平均值間在P<0.05水平上的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母的的篩選與鑒定

WLN培養(yǎng)基鑒定結(jié)果表明,共從刺梨自然發(fā)酵液中分離到14株形態(tài)各異的本地酵母。其中1株的形態(tài)與X16菌株的形態(tài)一致,呈球狀突起,表面光滑,并且菌落的中間呈綠色,周邊白色,在YPD固體培養(yǎng)基上二者也有類似特征(圖1-a),顯微鏡下具有典型的酵母細(xì)胞形態(tài)(圖1-b)。

PCR鑒定結(jié)果表明,目標(biāo)菌株的ITS序列(Accession No.MW453157)與NCBI中的釀酒酵母菌株3879j(Accession No.KP204935.1)的序列相似性高達99.63%,聚類分析結(jié)果顯示目標(biāo)菌株和X16均位于釀酒酵母一支(圖2-b),因此將該酵母菌株鑒定為釀酒酵母,命名為S.cerevisiaeCZ,簡稱“CZ”。CZ的ITS序列的比對分析排除了相互污染的可能(圖2-a)。

a-表觀形態(tài)特征；b-顯微形態(tài)特征圖1 菌落在不同培養(yǎng)基上的形態(tài)特征和經(jīng)美藍染色后 (×1 000)的特征Fig.1 Morphological characteristics of colonies grown on different media and cell with 1 000×amplification under microscope of CZ and X16 after methylene blue staining

a-序列比對；b-進化聚類分析圖2 CZ和X16的ITS序列比對和進化聚類分析Fig.2 The alignment of sequenced ITS between CZ and X16 and evolutionary analysis

2.2 碳源利用情況及其在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線分析

碳源分析結(jié)果表明CZ和X16對同一種碳源的利用情況沒有顯著差異,二者偏好利用葡萄糖、半乳糖、蔗糖和麥芽糖(圖3)。在YPD液體培養(yǎng)基中觀察了CZ和X16的生長曲線,結(jié)果顯示前20 h后,菌體迅速增加,到40 h時增長速度明顯下降,在60～80 h達到平臺期,兩個菌株的表現(xiàn)幾乎一致(圖3-a)。

a-生長曲線；b-單糖；c-多糖；d-糖衍生物圖3 菌株在YPD培養(yǎng)基中的生長曲線和菌株對單糖、多糖以及糖衍生物的利用情況測試Fig.3 The growth curve in YPD broth and carbon metabolism tests for monosaccharides,oligosaccharides, and carbohydrate derivatives

2.3 釀酒潛力分析

在含100 g/L葡萄糖的YPD培養(yǎng)基中,X16的生長顯著優(yōu)于CZ。但在其他濃度葡萄糖的培養(yǎng)基中,二者的生長狀態(tài)卻無顯著差異。另外,從含400 g/L葡萄糖的YPD培養(yǎng)基開始,隨著葡萄糖濃度的增加,對菌株生長的抑制程度也隨著增加(圖4-a)。

CZ在含不同乙醇體積分?jǐn)?shù)的YPD培養(yǎng)基中的生長情況與X16一致,各濃度之間存在著顯著差異,在13%或更高乙醇體積分?jǐn)?shù)的培養(yǎng)基中,二者的生長受到顯著抑制(圖4-b)。

兩個菌株的生長在pH為2的YPD液體培養(yǎng)基中受到顯著抑制,而在pH為3.5和5中沒有差異,在pH為6.5中,CZ的生長狀況優(yōu)于X16(圖4-c)。CZ和X16在含0～500 mg/L SO2的YPD培養(yǎng)基中,隨著SO2濃度的升高,除了CZ 在200 mg/L中與空白對照(0 mg/L)沒有顯著差異外,其余濃度下二者的生長狀況均受到顯著抑制(圖4-d)。二者產(chǎn)H2S能力較弱(圖4-e)。CZ和X16均具有高絮凝性,分別為(11.5±4.4)%和(9.6±1.3)%,且二者之間不存在顯著差異。

a～d-耐受性分析；e-H2S產(chǎn)生分析圖4 菌株的釀酒潛力分析Fig.4 Brewing potential analysis of strains,CZ and X16

2.4 實驗室規(guī)模的釀造分析

利用CZ和X16分別釀造的成品酒樣,所測試的指標(biāo)均不存在顯著差異。X16的酒精度(12.85%vol)略高于CZ(12.75%vol)、CZ的pH(3.71)略高于X16(3.66)、CZ的總碳水化合物含量(71.7 g/L)略高于X16(66.9 g/L)、CZ的總酚含量(12.13 g/L)略高于X16(11.53 g/L)、X16的抗壞血酸含量(9.06 g/L)略高于CZ(8.38 g/L)(表1)。

表1 刺梨果酒的理化分析Table 1 Physical and chemical analysis of R.roxbunghii wine

2.5 刺梨酒的抗氧化活性分析

抗氧化活性分析結(jié)果如表2所示?？傮w上,X16釀造的刺梨果酒的抗氧化活性效果均略高于CZ,但二者沒有統(tǒng)計學(xué)差異。刺梨酒對Fe3+的還原能力的結(jié)果顯示,100 mL CZ釀造的刺梨酒相當(dāng)于0.66 μg的維生素C,X16相當(dāng)于0.69 μg。DPPH自由基清除率結(jié)果顯示,兩種酵母釀造的刺梨果酒,100 mL均相當(dāng)于約20 mg維生素C的清除效果。

表2 刺梨酒的抗氧化活性分析Table 2 Antioxidant activity analysis of R.roxbunghii wine

2.6 刺梨果酒的感官及風(fēng)味分析

電子舌分析結(jié)果表明CZ純種發(fā)酵的刺梨果酒與X16,在咸味、酸味、苦味、澀味、鮮味、豐富度、后味A、后味B響應(yīng)值上均無顯著差異(圖5-a)。采用HS-SPME-GC-MS分析,CZ刺梨果酒中共檢出63種,包括酯類31種、醇類13種、酸類6種、醛酮類3種、其他10種；X16刺梨果酒中共檢測到64種,包括酯類32種、醇類12種、酸類8種、醛酮類3種、其他9種(圖5-b)。

a-電子舌；b-HS-SPME-GC-MS分析結(jié)果圖5 刺梨酒的風(fēng)味分析Fig.5 The flavor analysis for R.roxbunghii wine

3 討論與結(jié)論

本項目從刺梨果汁中獲得的CZ釀酒酵母在碳源利用的偏好性、耐酒精、耐酸、耐糖、耐SO2方面具有與商業(yè)酵母X16相似的能力,同時在亞硫酸鉍固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d后所產(chǎn)的H2S比較少,絮凝性優(yōu)于X16,這些結(jié)果均說明CZ具備釀造果酒的潛力。

該菌株完全具備將刺梨果汁變成果酒的能力,無論是在顏色、澄清度、酒精度、風(fēng)味還是在總酚和抗壞血酸的保留方面均與X16無明顯差異。該菌株具有一定的環(huán)境耐受性,可進行小規(guī)模的刺梨果酒發(fā)酵,有一定的應(yīng)用潛能。但是在中試甚至是工業(yè)化生產(chǎn)中的表現(xiàn)特性如何,需要進一步的研究評價。