李 孛， 王小勇， 鄭冰倩

肺癌是中國最常見的惡性腫瘤和腫瘤相關性死因[1]，其中肺鱗癌(lung squamous cell cancer，LUSC)約占2/3。60%以上的肺癌患者初診時已處于中晚期[2]，常發(fā)生骨轉移，約占35%[3]。肺癌骨轉移的骨骼相關事件，如病理性骨折、骨痛、脊髓壓迫癥狀和高鈣血癥等，嚴重降低患者的生活質量[4]。雙膦酸鹽的使用雖然在一定程度上延遲了骨骼的破壞，但因無法促進新骨骼形成，治療效果并不理想[5]。因此，尋找與肺癌骨轉移相關的無創(chuàng)標記物，以預測LUSC的骨轉移風險和預后，并探討其機制，可為肺癌骨轉移的治療提供理論參考。

基于高通量測序技術進行分子靶標篩選，尋求肺癌骨轉移的個體化標記物，是目前的熱點議題[6]。但關于該領域的研究均基于組織水平，尚缺乏無創(chuàng)血漿標記物的高通量測序探索。此外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 nt的非編碼RNA，可從表觀遺傳調(diào)控、轉錄調(diào)控以及轉錄后調(diào)控等水平參與癌癥的發(fā)生。目前有較多關于lncRNA在肺癌中預后預測價值的探索[7]，但尚無關于lncRNA在肺癌骨轉移中的相關組學研究。本研究首先通過血漿lncRNA測序篩選LUSC骨轉移的相關無創(chuàng)分子標記物，并選擇MIR4697HG進行驗證，通過生物信息學手段初步鑒定其預后預測價值和生物學機制。

1 對象與方法

1.1 對象 回顧性收集2014年2月-2020年10月就診的LUSC患者58例，男性41例，女性17例，中位年齡52歲(24～76歲)，美國東部腫瘤合作組(eastern cooperative group, ECOG)評分均<2分，無骨轉移41例，骨轉移17例，其中無骨轉移組均無其他部位轉移；骨轉移組5例為單處骨轉移，12例為多處骨轉移，最常見轉移部位為肋骨(8例，47.1%)，合并其他部位轉移13例(76.4%)。納入標準：(1)經(jīng)病理確診LUSC；(2)血漿標本質量合格。排除標準：(1)其他病理類型的肺癌；(2)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤。

1.2 方法

1.2.1 試劑和設備 基因芯片[nrStarTMHuman Functional lncRNA PCR Array，中國數(shù)譜(上海)生物科技有限公司]；全波長酶標儀(Multiskan Sky，美國Thermofisher公司)；實時定量PCR儀(MA-6000，中國蘇州雅睿生物技術有限公司)；反轉錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)、熒光定量試劑盒(SYBR Premix ExTaq II Kit)(日本TaKaRa公司)。

1.2.2 lncRNA芯片檢測和RT-PCR驗證 采集患者清晨空腹外周血5 mL作為血漿標本加入離心管。首先選擇3對骨轉移與非骨轉移標本進行l(wèi)ncRNA測序，4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，吸取上清轉至1.5 mL EP管中，按照TRIzol試劑盒說明書提取血漿樣本總RNA，并定量測定RNA濃度和純度。當OD260 nm/OD280 nm為1.9～2.1時進行進一步分析，差異lncRNA的標準為P<0.05。進一步挑選MIR4697HG在血漿樣本中進行qRT-PCR驗證。根據(jù)反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒說明書逆轉錄提取RNA后進行RT-PCR，以GAPDH為內(nèi)參。

1.2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫分析和預測 登錄GEPIA在線網(wǎng)站，對TCGA數(shù)據(jù)庫進行可視化分析，觀察MIR4697HG在人體組織中的表達分布情況，并進行泛癌癥分析，觀察MIR4697HG在不同癌癥中的差異表達情況，最后驗證MIR4697HG在LUSC中的預后預測價值，并基于TCGA矩陣篩選與MIR4697HG存在共表達的基因(前200名)進行靶基因預測。

1.2.4 lncRNA靶基因信號通路分析 采用DAVID Bioinformatics Resources 6.8數(shù)據(jù)庫對MIR4697HG的共表達基因進行信號通路富集分析[8]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用χ2檢驗。通過繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)，判斷血漿MIR4697HG表達水平對骨轉移LUSC的預測效能，并通過計算約登指數(shù)，尋找血漿MIR4697HG預測肺癌骨轉移的最佳截點。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線圖，并采用log-rank法進行比較。P<0.05為差別有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 lncRNA測序 對3對骨轉移與非骨轉移標本進行l(wèi)ncRNA測序，共篩選出456個差異lncRNA(表1)，其中上調(diào)lncRNA 156個，下調(diào)lncRNA 300個。選擇P值最低的MIR4697HG(log2FC：-3.331 52)進一步分析。

表1 血漿lncRNA表達譜差異分析(排名前10位的基因)

2.2 MIR4697HG的低通量外部驗證 qPCR驗證結果提示，無骨轉移組的血漿MIR4697HG表達水平高于骨轉移組[(0.13±0.04)vs(0.08±0.03)，P<0.000 1，圖1]。ROC曲線分析提示，血漿MIR4697HG表達水平預測骨轉移的曲線下面積為0.876，靈敏度為92.7%，特異度為76.5%，陽性預測值為79.8%，陰性預測值91.3%，計算約登指數(shù)決定最佳截點為0.087 9(圖2)。

圖1 血漿MIR4697HG在骨轉移和非骨轉移組的差異表達Fig.1 The differential expression of plasma MIR4697HG between bone metastasis and non bone metastasis groups

圖2 血漿MIR4697HG預測肺癌骨轉移的ROC曲線分析和最佳截點設置Fig.2 ROC curve analysis and optimal cut-off point setting of plasma MIR4697HG in predicting bone metastasis of lung cancer

2.3 MIR4697HG在LUSC的預后價值 采用TCGA數(shù)據(jù)庫進行MIR4697HG的組織分布和泛癌癥分析(圖3)，MIR4697HG主要表達在正常腦組織和結直腸組織中，在正常肺組織和乳腺組織中亦有中度表達。泛癌癥分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG在多種癌癥中呈低表達，可能行使廣泛的抑癌基因角色。

圖3 MIR4697HG的組織分布和泛癌癥分析Fig.3 Tissue distribution and Pan-cancer analysis of MIR4697HG

選擇TCGA數(shù)據(jù)庫中的LUSC數(shù)據(jù)集進一步分析發(fā)現(xiàn)，隨著LUSC分期的升高，MIR4697HG的表達逐漸下降(圖4)，且低表達的肺癌患者，無病生存率和總生存率均較低(圖5)。

圖4 MIR4697HG在不同肺鱗癌分期的表達模式Fig.4 Expression pattern of MIR4697HG in different stages of lung squamous cell carcinoma

A：無病生存率；B：總生存率。圖5 MIR4697HG高表達組和低表達組的生存分析Fig.5 Survival analysis of MIR4697HG high expression group and low expression group

2.4 MIR4697HG的生物學功能初探 通過共表達基因尋找MIR4697HG的靶基因，前200名基因中共70個編碼基因，運用DAVID數(shù)據(jù)庫對MIR4697HG的靶基因進行信號通路分析，結果提示主要富集于細胞外基質受體相互作用信號通路上(P=0.003 4)。

3 討 論

骨轉移是LUSC最常見的轉移部位之一，總體預后較差。一項納入356例肺癌患者的回顧性分析發(fā)現(xiàn)，骨轉移最常見的部位是肋骨，其中位生存率僅12.5個月，1 a生存率僅為50.8%，而肺癌骨轉移數(shù)量、ECOG評分、雙膦酸鹽治療以及血清鈣、血清乳酸脫氫酶和堿性磷酸酶與預后顯著相關[9]。尋找LUSC骨轉移相關的無創(chuàng)預測標記物和預后預測標記物，能夠篩選高?；颊?，進行個體化干預。

Zhang等[10]在組織學水平鑒定了LUSC的差異表達lncRNA、miRNA和mRNA，有助于研究肺癌發(fā)生的分子機制和探索預后生物標志物或治療靶點。本研究通過血漿lncRNA組學分析，高通量鑒定LUSC骨轉移相關的lncRNA，共篩選出456個差異lncRNA，有助于為今后相關分子標記物的研究提供參考。一些排名靠前的標記物lncRNA分子，如TM4SF1-AS1(排名第2)，已被證實能夠激活PI3K/AKT信號通路，促進肺癌細胞的遷移和侵襲[11]；而ABHD11-AS1(排名第3)可被m6a轉移酶METTL3所誘導而上調(diào)，從而促進非小細胞肺癌的Warburg效應[12]。

根據(jù)組學結果，本研究進一步采用MIR4697HG進行擴大樣本低通量驗證。由于回顧性研究難免存在病例脫落現(xiàn)象，納入本研究的58例患者雖為非連續(xù)病例，但患者的基線資料(年齡、性別、ECOG評分、骨轉移率等)與既往文獻報道相仿，具有代表性[4]。本研究進一步證實無骨轉移組血漿MIR4697HG的表達水平高于骨轉移組。ROC曲線分析提示，血漿MIR4697HG表達水平預測骨轉移的曲線下面積為0.876，靈敏度92.7%，特異度76.5%，陽性預測值79.8%，陰性預測值91.3%，具有良好的預測價值和臨床應用前景。目前尚缺乏MIR4697HG在肺癌中的體外研究。Mao等[13]和Bady等[14]發(fā)現(xiàn)，RAD21抑制腫瘤抑制因子MIR4697HG的轉錄，導致膠質瘤的發(fā)生，且RAD21表達與膠質瘤的預后相關。TCGA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG在肺組織中中度表達，其低表達與肺癌患者不良腫瘤學預后有關，提示MIR4697HG在LUSC中扮演抑癌基因角色。進一步的泛癌癥分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG是一個普遍抑癌分子。

本研究的靶基因信號通路分析發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG的靶基因主要富集在細胞外基質受體相互作用信號通路上。細胞外基質受體相互作用信號通路是多種癌癥，包括胃癌[15]、肺癌[16]、肝癌[17]等進行細胞遷移和轉移的重要過程。雖然目前尚無關于MIR4697HG在肺癌中作用機制的相關研究，但Zhang等[18]的體外研究發(fā)現(xiàn)，MIR4697HG敲除可導致基質金屬蛋白酶-9、磷酸化ERK和磷酸化AKT水平下降，提示MIR4697HG可通過影響細胞外基質，調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的遷移和轉移過程。但因本研究樣本量小，故該結論需要設計優(yōu)良的大樣本研究進一步驗證。

綜上，本研究通過本中心血漿樣本和TCGA數(shù)據(jù)庫，篩選了血漿MIR4697HG作為LUSC的預測因子和預后因子。