劉 范, 王 斌, 伍俊為, 武 歡, 劉嘉鵬, 田 娜, 黃玉吉, 程春振,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801)

微生物廣泛存在于植物根系和土壤中，是二者進(jìn)行物質(zhì)循環(huán)轉(zhuǎn)化的重要推動(dòng)者[1].植物通過(guò)根系分泌物引起微生物富集，改變土壤環(huán)境，形成“根系-微生物-土壤”微生態(tài)系統(tǒng)[2-3].根系微生物能調(diào)控植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收能力、參與根系能量代謝以及影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[4]；同時(shí)，根系微生物會(huì)產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物，抑制土壤病原菌的入侵，提高植株對(duì)生物脅迫的抗性[5-6].微生物組成的動(dòng)態(tài)平衡是保證根系微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定、維持植物正常生長(zhǎng)的必要條件[7].因此，探究根系微生物群落結(jié)構(gòu)、分析優(yōu)勢(shì)菌群變化情況對(duì)于了解植物-微生物互作機(jī)理具有重要意義.

香蕉是世界上最重要的果樹(shù)之一.近年來(lái)，香蕉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展受到由尖孢鐮刀菌古巴?；?Fusariurmoxysporumf.sp.cubense,Foc)引起的香蕉枯萎病的嚴(yán)重影響[8].香蕉枯萎病菌是一種土傳性真菌，該病菌潛伏期長(zhǎng)，且能在較低孢子濃度下引起病害，目前尚無(wú)徹底根治該病的方法[9].通過(guò)生物菌肥防控香蕉枯萎病已取得一定進(jìn)展.研究表明，外施含有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、綠色木霉菌(Trichodermaviride)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)的生物有機(jī)肥均能顯著降低香蕉枯萎病的發(fā)生率[10-12].生物菌肥能改善土壤養(yǎng)分和結(jié)構(gòu)，改變優(yōu)勢(shì)菌群的構(gòu)成，提高有益微生物的多樣性，進(jìn)而降低香蕉枯萎病菌的豐度[13].

印度梨形孢(Serendipitaindica)是Verma et al[14]在印度沙漠地區(qū)灌木叢根部分離到的一種類叢枝菌根真菌，其能廣泛定殖于植物根部并與植物形成共生結(jié)構(gòu)，且可以純培養(yǎng).該菌的定殖能提高宿主根系對(duì)養(yǎng)分的吸收能力，促進(jìn)宿主生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)其對(duì)逆境的耐受性[15].Madaan et al[16]將S.indica應(yīng)用于香蕉，發(fā)現(xiàn)其可以顯著促進(jìn)香蕉生長(zhǎng)和提高香蕉產(chǎn)量；Li et al[17]發(fā)現(xiàn)，S.indica能夠促進(jìn)香蕉組培苗生根和葉片光合色素合成；Bodjrenou et al[18]發(fā)現(xiàn)，S.indica可以提高香蕉抗熱性.此外，有研究發(fā)現(xiàn)，S.indica能在一定程度上提高香蕉對(duì)枯萎病的抵抗能力，推遲病癥的顯現(xiàn)時(shí)間[19-20].目前，有關(guān)S.indica對(duì)香蕉枯萎病菌影響的研究主要集中在真菌拮抗、香蕉抗病基因表達(dá)以及轉(zhuǎn)錄組分析等方面[19-20]，針對(duì)S.indica和枯萎病菌對(duì)香蕉根系微生物群落影響的報(bào)道較少.本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)分析了接種S.indica和Foc熱帶4號(hào)小種(FocTR4)后香蕉根系微生物群落結(jié)構(gòu)的差異，以期從宏基因組水平揭示它們對(duì)香蕉根系微生物群落的影響，為進(jìn)一步利用S.indica防控香蕉枯萎病、發(fā)掘生防菌株提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

本試驗(yàn)所用的‘天寶蕉’組培苗及S.indica(DSM11827)和FocTR4菌種均由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所提供.選取四葉一心、長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的培養(yǎng)于苔蘚泥炭土基質(zhì)(PINDSTRUP，丹麥)的‘天寶蕉’移栽苗接種S.indica，即在香蕉根系附近灌入50 mL孢子懸浮液(濃度為1×105個(gè)·mL-1)，為了保證S.indica的定殖率，每隔1 d澆一次菌液，總共3次；對(duì)照組用等體積稀釋相同比例的PDB溶液處理[17].2周后，參照Li et al[17]的方法檢測(cè)S.indica定殖情況.之后將對(duì)照組和S.indica定殖組的香蕉苗進(jìn)一步分為2組：一組參照左存武等[21]的方法接種FocTR4(形成F+、SF組)，每100 g土壤澆孢子濃度為 5×105個(gè)·mL-1的FocTR4懸浮液100 mL；另一組澆等體積稀釋相同比例的PDB溶液(形成CK、S+組).接種2個(gè)月后取根系，將根系置于自來(lái)水下沖洗去除土壤，再使用無(wú)菌水沖洗1 min，沖洗3次，然后將根系放入超聲波清洗機(jī)中洗滌5 min，再用無(wú)菌水沖洗3次后使用無(wú)菌濾紙吸干表面水分[22]，液氮中速凍后保存于-80 ℃冰箱中備用.每個(gè)處理組3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.2 宏基因組提取

為減少植株個(gè)體差異對(duì)宏基因組測(cè)序結(jié)果的影響，本研究參照Kaushal et al[23]的方法將各處理組3個(gè)重復(fù)的香蕉根系混合后采用PowerPlant Pro DNA Isolation Kit試劑盒提取香蕉根系總DNA.通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和微量核酸蛋白檢測(cè)儀分別檢測(cè)完整性和濃度后，送至深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行宏基因組的文庫(kù)構(gòu)建，使用Illumina HiSeqXten測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙末端測(cè)序.

1.3 高通量測(cè)序與數(shù)據(jù)分析

根系宏基因組原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)質(zhì)控和過(guò)濾后，使用SOAPdenovo2和Rabbit軟件進(jìn)行de novo組裝，然后利用MetaGeneMark和CD-Hit軟件進(jìn)行基因預(yù)測(cè)和聚類分析，獲得非冗余基因集；使用Blast程序?qū)λ蓄A(yù)測(cè)到的基因進(jìn)行搜索比對(duì)，得到基因功能注釋信息；通過(guò)MEGAN軟件分析nr數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)結(jié)果，獲得所有基因的物種注釋信息，進(jìn)而得出樣品中物種的豐富程度；同時(shí)，利用Shannon指數(shù)分析各樣品的物種多樣性.

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel(Office 2019)軟件分析數(shù)據(jù).利用TBtools軟件繪制物種豐度熱圖和Venn圖[24].

2 結(jié)果與分析

2.1 香蕉接種S.indica和FocTR4后的表型

接種S.indica2周后，使用臺(tái)盼藍(lán)染色法鑒定S.indica在香蕉根系的定殖情況.從圖1A可知，澆灌S.indica孢子懸浮液的香蕉根系中可觀察到典型的梨形厚垣孢子，表明S.indica已經(jīng)成功定殖于香蕉根系.

接種FocTR4 2個(gè)月后，F(xiàn)+組香蕉植株出現(xiàn)較明顯的枯萎病癥狀，葉鞘呈橙黃色，葉片枯黃；而SF、CK及S+組植株表型差異不大，雖有部分葉片衰老黃化，但未見(jiàn)明顯枯萎病癥狀(圖1B).這說(shuō)明S.indica能推遲香蕉枯萎病癥狀的顯現(xiàn).

A中紅色箭頭標(biāo)記處為S.indica；B中從左到右依次為CK(接種PDB溶液)、S+(接種S.indica懸浮液)、SF(接種S.indica和FocTR4懸浮液)和F+(接種FocTR4懸浮液)組植株.

2.2 香蕉根系宏基因組測(cè)序結(jié)果

經(jīng)宏基因組測(cè)序，CK、S+、F+和SF組分別獲得65 313 994、55 514 680、68 872 022和62 045 516條原始序列，去除不合格序列和宿主序列后分別得到57 836 368、49 726 978、59 298 254和55 451 110條有效序列.各組有效序列比例均高于86.00%，表明樣品測(cè)序結(jié)果良好(表1).將有效序列進(jìn)行de novo組裝獲得contig后用于基因預(yù)測(cè)和基因集的構(gòu)建，得到含有67 194個(gè)基因的非冗余基因集.其中：F+組中預(yù)測(cè)的基因數(shù)量最多，達(dá)42 365個(gè)；S+組中預(yù)測(cè)的基因數(shù)量最少，僅22 218個(gè).

表1 香蕉根系宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)1)

2.3 物種注釋分析和群落多樣性

將CK、S+、F+和SF組的基因與nr蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，分別有30 595、18 962、33 922和34 448個(gè)基因注釋到蛋白功能(表2).通過(guò)MEGAN分析各組基因的物種信息發(fā)現(xiàn)，CK組的物種種類最多(1 610種)，SF組次之(1 531種)，S+組物種種類最少(1 112種).Shannon指數(shù)反映微生物群落的多樣性，指數(shù)越大，說(shuō)明物種越多樣.各組樣品的Shannon指數(shù)排序?yàn)镃K(2.07)>S+(1.83)>F+(1.63)>SF(1.23).

表2 香蕉根系宏基因組物種注釋統(tǒng)計(jì)1)

2.4 香蕉根系優(yōu)勢(shì)菌群組成

2.4.1 門(mén)分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群 在門(mén)分類水平上，CK組含有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(占比≥0.50%)數(shù)量最多，高達(dá)9個(gè)；S+組次之，有8個(gè)；而SF組僅含有變形菌門(mén)(Proteobacteria)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)和放線菌門(mén)(Actinobacteria)4個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(表3).在各組根系中，變形菌門(mén)(35.11%～86.68%)、放線菌門(mén)(0.82%～46.17%)和厚壁菌門(mén)(1.21%～27.22%)占比均較高，但不同樣品之間差異明顯；而藍(lán)菌門(mén)(Cyanobacteria，0.40%～7.47%)、纖維桿菌門(mén)(Fibrobacteres，0.03%～3.67%)、擬桿菌門(mén)(0.31%～8.03%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia，0.05%～1.06%)、螺旋體門(mén)(Spirochaetes，0.04%～0.61%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes，0.04%～0.54%)和綠藻門(mén)(Chlorophyta，0.03%～0.76%)占比均較低，且不同樣品之間差異小.

表3 門(mén)分類水平上優(yōu)勢(shì)微生物群落組成及其占比1)

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，接種S.indica和FocTR4明顯改變了香蕉根系優(yōu)勢(shì)菌門(mén)占比.變形菌門(mén)在CK組占比為35.11%；而在S+和F+組占比分別達(dá)到43.70%和41.27%，為CK組的1.24和1.18倍；在SF組占比最高(86.68%)，約為CK組的2.47倍.這說(shuō)明接種S.indica和FocTR4均提高了變形菌門(mén)的相對(duì)豐度，同時(shí)接種這兩種真菌時(shí)變形菌門(mén)富集最顯著.放線菌門(mén)在SF組的占比最低，僅為0.82%，但在CK組和F+組的占比分別高達(dá)25.03%和46.17%.厚壁菌門(mén)在S+組(27.22%)的占比約為CK組(13.82%)的1.97倍，而在F+和SF組的占比分別比CK組降低了66.93%和91.20%.這說(shuō)明接種S.indica可以提高厚壁菌門(mén)在香蕉根系中的相對(duì)豐度，而接種FocTR4會(huì)降低該菌門(mén)的相對(duì)豐度.

2.4.2 屬分類水平上的優(yōu)勢(shì)菌群 在屬分類水平上，香蕉根系微生物群落的優(yōu)勢(shì)菌屬(占比≥0.50%)有25個(gè)，分布于8個(gè)門(mén)(表4，圖2).S+組的優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量最多，達(dá)到15個(gè)；F+和CK組次之，分別為11和10個(gè)；而SF組的優(yōu)勢(shì)菌屬數(shù)量最少，為9個(gè).擬無(wú)枝菌酸菌屬(Amycolatopsis，0.01%～12.21%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，0.96%～26.24%)、鏈霉菌屬(Streptomyces，0.58%～44.38%)和根瘤菌屬(Rhizobium，0.73%～58.91%)在各組中是主要的分類群.其中：CK組的擬無(wú)枝菌酸菌屬占比最高，達(dá)到12.21%，而該屬在其他組中占比均低于0.50%；葡萄球菌屬在S+組的占比最高(26.24%)，但接種FocTR4后該屬的占比顯著降低(僅占0.96%)；鏈霉菌屬在F+組為最優(yōu)勢(shì)菌屬，占比高達(dá)44.38%，為CK組(8.28%)的5.36倍；根瘤菌屬在SF組的占比達(dá)到58.91%，遠(yuǎn)高于該處理組中的其他優(yōu)勢(shì)菌屬.

表4 屬分類水平上優(yōu)勢(shì)微生物群落組成及其占比1)

聚類分析發(fā)現(xiàn)，香蕉根系優(yōu)勢(shì)菌屬主要分為5個(gè)分支(圖2).鏈霉菌屬、鞘脂菌屬(Sphingobium)、玫瑰色半光合菌屬(Roseateles)、黃單胞桿菌屬(Xanthomonas)和寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)5個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬主要在F+組富集.SF組中根瘤菌屬、農(nóng)桿菌屬(Agrobacterium)、噬幾丁質(zhì)菌屬(Chitinophaga)、鞘脂桿菌屬(Pedobacter)和中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)的相對(duì)豐度較高.擬無(wú)枝菌酸菌屬、纖維桿菌屬(Fibrobacter)、Chitinispirillum和堆囊菌屬(Sorangium)在CK組富集.葡萄球菌屬、伯克霍爾德菌屬(Burkholderia)、硫堿弧菌屬(Thioalkalivibrio)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、艾克曼菌屬(Akkermansia)、Rudaea、桿狀病毒屬(Badnavirus)和鹽藻屬(Dunaliella)8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬主要集中在S+組.假單胞菌屬(Pseudomonas)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和新鞘氨醇桿菌屬(Novosphingobium)在各組中的相對(duì)豐度無(wú)明顯差異.

CK:接種PDB溶液;S+:接種S.indica懸浮液;F+:接種FocTR4懸浮液;SF:接種S.indica和FocTR4懸浮液.同一行上，橘色色塊代表相對(duì)豐度較高，藍(lán)色色塊代表相對(duì)豐度較低.

進(jìn)一步以各處理?xiàng)l件下菌屬的種類與數(shù)量繪制韋恩圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)CK、S+、F+和SF組根系菌屬的數(shù)量分別為746、590、678和715個(gè).其中，4組共有菌屬數(shù)為472個(gè)，占總屬數(shù)的19.92%.Candidatus、Saccharimonas、異球藻屬(Xenococcus)和棒桿菌屬(Corynebacterium)等58個(gè)屬只存在于CK組；S+組特有菌屬為韋榮氏球菌屬(Veillonella)、Methylocapsa、Ottowia和Methanoregula；F+組含有黃桿菌屬(Thermomonas)、Batrachochytrium和共球藻屬(Trebouxia)等87個(gè)特有菌屬；Mucinivorans、離蠕孢屬(Bipolaris)和炭團(tuán)菌屬(Annulohypoxylon)等42個(gè)屬僅存在于SF組.與CK組相比，S+和F+組分別有35和130個(gè)特有菌屬(CK組分別有191和198個(gè)特有菌屬)，說(shuō)明接種S.indica和FocTR4均會(huì)導(dǎo)致根系原有的特有菌屬數(shù)量下降；與S+組相比，SF組特有菌屬為172個(gè)(S+組為47個(gè))，說(shuō)明S+組經(jīng)FocTR4處理后根系特有菌屬數(shù)量明顯增加.

CK:接種PDB溶液;S+:接種S.indica懸浮液;F+:接種FocTR4懸浮液;SF:接種S.indica和FocTR4懸浮液.

3 討論

3.1 接種S.indica和FocTR4均會(huì)降低香蕉根系微生物多樣性

本研究發(fā)現(xiàn)，3個(gè)處理組的物種種數(shù)和Shannon指數(shù)均低于CK組，表明接種S.indica和FocTR4均會(huì)降低香蕉根系微生物多樣性.這可能是由于S.indica和FocTR4與根系原有微生物相互競(jìng)爭(zhēng)，促進(jìn)了特定相關(guān)菌類的生長(zhǎng)，抑制了其他菌類的生長(zhǎng)發(fā)育，并破壞了原有的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[25-26].

根系微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其能根據(jù)外界環(huán)境的改變而產(chǎn)生適應(yīng)性調(diào)整，并且這種調(diào)整主要體現(xiàn)在優(yōu)勢(shì)菌群變化方面[27-28].本研究通過(guò)分析香蕉根系微生物物種組成和相對(duì)豐度發(fā)現(xiàn),在門(mén)分類水平上，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為各組優(yōu)勢(shì)菌的主要類群，但接種S.indica和FocTR4會(huì)改變其占比.與對(duì)照相比，S.indica和FocTR4能分別增加厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)的占比，同時(shí)接種兩者能提高變形菌門(mén)的豐度.在屬分類水平上，共有25個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬，形成5個(gè)分支，不同程度地聚集在每組樣本內(nèi).其中，葡萄球菌屬主要在S+組富集，F(xiàn)+組中鏈霉菌屬占比最高，根瘤菌屬則是SF組的最優(yōu)勢(shì)菌屬.此外，接種S.indica和FocTR4會(huì)導(dǎo)致根系菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生改變.S.indica處理后香蕉根系中厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)以及葡萄球菌屬的相對(duì)豐度顯著提高，這與球囊霉屬的叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi, AMF)能增加水稻根際土壤中金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌和熒光假單胞桿菌(Pseudomonasfluorescens)數(shù)量，提高土壤細(xì)菌豐富度的報(bào)道[29]類似.

3.2 FocTR4侵染會(huì)誘導(dǎo)香蕉根系放線菌門(mén)的富集

大多數(shù)植物體內(nèi)都存在豐富的內(nèi)生微生物，其中，放線菌門(mén)是主要組成部分.內(nèi)生放線菌通過(guò)產(chǎn)生大量天然生物活性產(chǎn)物，促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，抵制病原菌入侵，提高植株的抗性[30].感染菌核病菌的大豆根系內(nèi)放線菌的多樣性優(yōu)于健康植株[31]；抑制性土壤(含有大量拮抗微生物的資源地)中放線菌門(mén)豐度顯著高于非抑制性土壤[32-33].本研究中，F(xiàn)+組的放線菌門(mén)占比最高，表明FocTR4入侵會(huì)激發(fā)香蕉根系防御反應(yīng)，誘導(dǎo)內(nèi)生放線菌門(mén)菌株的富集.研究發(fā)現(xiàn)，健康和抑制性的香蕉土壤中鏈霉菌屬、根瘤菌屬和芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度較高[34-35].其中，鏈霉菌能產(chǎn)生具有抗菌活性的代謝產(chǎn)物，對(duì)多種病原菌表現(xiàn)出抑制效果.蕉園土壤中分離的鏈霉菌YYS-7和CB-75以及香蕉根系分離的鏈霉菌S96均能顯著抑制FocTR4的生長(zhǎng)[36-38].本研究中，F(xiàn)+組中鏈霉菌屬的占比最高.鏈霉菌屬菌株可能通過(guò)多種機(jī)制參與香蕉枯萎病菌的早期防御反應(yīng)，包括競(jìng)爭(zhēng)底物、分泌抗生素和分解酶等，從而協(xié)助根系抵御FocTR4的入侵[39].

3.3 S.indica可能通過(guò)影響根系根瘤菌豐度提高香蕉對(duì)枯萎病的抗性

有研究指出，AMF定殖能增加豆類植物的根瘤數(shù)量，而接種根瘤菌會(huì)降低AMF的定殖率，兩者共同作用可以抑制大豆紅冠腐病的發(fā)生[40-41].Wang et al[42]研究發(fā)現(xiàn),菌根共生缺陷體苜蓿的根際微生物群落中根瘤菌的數(shù)量顯著下降.Sharma et al[43]發(fā)現(xiàn)，S.indica和根瘤菌相互作用能提高大麥幼苗對(duì)白粉病的抗性.本研究發(fā)現(xiàn)：接種FocTR4 2個(gè)月后，F(xiàn)+組的香蕉苗葉片黃化枯萎，枯萎病癥狀明顯，而SF組則未出現(xiàn)明顯癥狀，表明S.indica定殖可以延緩枯萎病癥狀的顯現(xiàn)；同時(shí)，變形菌門(mén)和根瘤菌屬在SF組中占比分別高達(dá)86.68%和58.91%，遠(yuǎn)超其他菌門(mén)和菌屬在該組的占比.這暗示S.indica可能通過(guò)提高根瘤菌屬的豐度增強(qiáng)香蕉對(duì)FocTR4的抗性.

4 結(jié)論

本研究通過(guò)宏基因組測(cè)序技術(shù)研究了S.indica和FocTR4對(duì)香蕉根系微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們均會(huì)影響根系微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，并能提高香蕉根系中變形菌門(mén)、放線菌門(mén)或厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度.此外，本研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌屬和根瘤菌屬分別顯著富集于F+和SF組，推測(cè)這兩種菌屬菌株可能在香蕉根系抵御FocTR4入侵和誘導(dǎo)香蕉對(duì)枯萎病抗性過(guò)程中發(fā)揮重要作用.今后可以通過(guò)研究這些菌株對(duì)香蕉枯萎病發(fā)生率和發(fā)病情況的影響進(jìn)一步揭示其功能.