鄧 云

(福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建 南平 354200)

小麥赤霉病是世界性病害[1-2]，廣泛分布于我國溫暖潮濕或半潮濕地區(qū)，多發(fā)于長(zhǎng)江上、中、下游及黃淮南片區(qū)，對(duì)小麥生產(chǎn)的危害甚大.該病不僅會(huì)造成小麥嚴(yán)重減產(chǎn)，而且其產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒性強(qiáng)，食用后會(huì)引起眩暈、發(fā)燒、惡心、嘔吐、腹瀉等急性中毒癥狀，同時(shí)會(huì)降低免疫能力和生育能力等，危害人畜健康.目前，施用化學(xué)殺菌劑是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上控制真菌性病害的主要方法[3]，但是化學(xué)農(nóng)藥容易導(dǎo)致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、植物病菌產(chǎn)生抗藥性等問題.因此，迫切需要更加安全環(huán)保的新型生物農(nóng)藥代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)殺菌劑[4-6].

多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)為芽孢桿菌科(Bacillaceae)類芽孢桿菌屬，是一類重要的根際有益菌[7-9].它的代謝產(chǎn)物中含有多種可利用的生物活性物質(zhì)，如多糖、多肽、蛋白質(zhì)、糖蛋白、核苷類似物、吡嗪類、醇醛酸等，在農(nóng)業(yè)、食品和環(huán)境等方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值.多粘類芽孢桿菌可通過產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)和位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)的作用方式殺死和控制病原菌[10-15]，且該菌是非致病性細(xì)菌,被廣泛應(yīng)用于微生物制劑的研制.此外，該菌具有活性高、環(huán)境污染小以及不易產(chǎn)生抗藥性等特點(diǎn)，具有巨大的生防價(jià)值[16-17].

目前，有關(guān)廣譜抑制真菌的多粘類芽孢桿菌的報(bào)道不多，市面上可用于防治小麥赤霉病的多粘類芽孢桿菌的微生物農(nóng)藥菌種資源也不夠豐富；有關(guān)多粘類芽孢桿菌的主要研究方向?yàn)槠渖锾匦院蛯?duì)土壤及作物的作用機(jī)理[18-23].本研究從常年開展小麥赤霉病抗性鑒定的鑒定圃土壤中分離出一株具有廣譜抑菌效果的多粘類芽孢桿菌DY04，研究其不同施用方法對(duì)防治小麥赤霉病和小麥產(chǎn)量的影響，以期為小麥赤霉病的生物防治提供種質(zhì)資源，并為該生防菌的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 生防菌菌株 菌株DY04分離自福建省南平市建陽區(qū)童游街道南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地的小麥赤霉病抗性鑒定圃土壤.

1.1.2 病原真菌菌株 禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)由本課題組分離；玉米平臍蠕孢(Bipolarissp.)、茶擬盤多毛孢(Pestalotiopsistheae)、玉米莖點(diǎn)霉屬(Phomasp.)、番茄尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)、香蕉枯萎病尖孢鐮刀菌(F.oxysporumf.sp.)、黃萎病鐮刀菌(F.verticillium)、灰霉病菌(Botrytiscinerea)等由福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院魯國東教授提供；玉米紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所陳福如教授、杜宜興副研究員提供.

1.1.3 供試小麥品種 供田間試驗(yàn)的小麥品種揚(yáng)輻麥4號(hào)由揚(yáng)州里下河農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供.

1.1.4 培養(yǎng)基 紅糖豆粉培養(yǎng)基(發(fā)酵液)[20]：紅糖23.3 g·L-1，CaCO34.9 g·L-1，豆粉11.1 g·L-1，KNO38 g·L-1，KH2PO40.5 g·L-1，K2HPO41.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 5 g·L-1，NaCl 3 g·L-1.PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯180～250 g，葡萄糖15～25 g，瓊脂15～20 g，水1 000 mL.

1.1.5 微生物菌液助劑 添加劑配方為分散劑PVA(聚乙烯醇)7.2%、濕潤(rùn)劑D425(烷基磺酸縮聚物)4.8%、穩(wěn)定劑CMC-Na(羧甲基纖維素鈉)2.0%、保護(hù)劑FWA(熒光增白劑)0.1%[24].

1.2 室內(nèi)測(cè)定方法

1.2.1 染菌大麥粒誘導(dǎo)分離拮抗菌株DY04 將蒸過或煮過的大麥粒裝入培養(yǎng)瓶高溫滅菌后冷卻至室溫，向裝有大麥粒的瓶中接種禾谷鐮刀菌菌塊，并在25～26 ℃條件下培養(yǎng)5～6 d，其間搖動(dòng)培養(yǎng)瓶2～3次，使大麥粒充分長(zhǎng)滿禾谷鐮刀菌.使用若干塊無菌紗布分別包裹數(shù)顆已長(zhǎng)滿禾谷鐮刀菌的大麥粒，并逐份扎口、系好標(biāo)簽，將其掩埋在鑒定圃土壤10～20 cm的深度誘導(dǎo)拮抗菌附著在染菌大麥粒上，20 d后取出，并分別裝入滅菌后的玻璃瓶?jī)?nèi)，做好標(biāo)記待用.取出大麥粒洗凈消毒后，置于PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～5 d，觀察染菌大麥粒菌絲發(fā)展情況.挑取沒有明顯菌絲擴(kuò)張的培養(yǎng)皿內(nèi)的拮抗菌，進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，得到拮抗菌株DY04[25].

1.2.2 拮抗菌株DY04對(duì)病原真菌的防效測(cè)定 采用平板對(duì)峙法[26]進(jìn)行測(cè)定.將蒸過或煮過的大麥粒裝入培養(yǎng)瓶高溫滅菌后冷卻至室溫，向裝有大麥粒的瓶中接種拮抗菌DY04菌塊，并在28 ℃條件下培養(yǎng)1～2 d，讓拮抗菌侵染全部大麥粒.將病原真菌的菌絲塊接到PDA培養(yǎng)基(9 cm培養(yǎng)皿)的中央，在距離中央2.5 cm的左右兩側(cè)各嵌入一粒攜帶拮抗菌株DY04的大麥粒，以中央只接種真菌菌塊的PDA平板為對(duì)照，所有培養(yǎng)皿封口后于28 ℃下培養(yǎng)5～7 d，觀察生長(zhǎng)情況.每個(gè)處理3次重復(fù)，當(dāng)對(duì)照菌絲長(zhǎng)滿整個(gè)培養(yǎng)皿時(shí)，測(cè)定每個(gè)培養(yǎng)皿真菌菌落直徑，計(jì)算抑制率.抑制率/%=(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100.

1.2.3 菌落形態(tài)特征鑒定 挑取菌株DY04培養(yǎng)24 h，用100 μL無菌水制成菌懸液[20]，然后劃線于PDA平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，觀察菌落的形態(tài)特征.

1.2.4 16S rDNA序列同源性測(cè)定 提取拮抗菌株DY04的DNA，由生工生物工程(上海)股份有限公司提取并測(cè)序，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性，PCR所用的引物融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的V3-V4通用引物341F(上游引物5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′，下游引物5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和805R(上游引物5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′，下游引物5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′).PCR 反應(yīng)體系：2×Taq master Mix 15 μL，Bar-PCR primer F(10 μmol·L-1)1 μL，Primer R(10 μmol·L-1)1 μL，Genomic DNA 10～20 ng，H2O加至 30 μL.PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共設(shè)置25次循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫(http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp)中進(jìn)行BLAST比對(duì).

1.2.5 拮抗菌株DY04發(fā)酵液的抑菌效果測(cè)定 挑取DY04菌株在紅糖豆粉培養(yǎng)基發(fā)酵液中培養(yǎng)2 d后，在12 000 r·min-1條件下離心10 min，兩次收集上清，上清液過0.22 μm無菌濾膜后分別稀釋至2、4、8、16、32倍，取20 μL發(fā)酵液采用牛津杯對(duì)峙法[26]觀察抑菌效果.

1.3 田間試驗(yàn)方法

1.3.1 小麥播種 試驗(yàn)于2020年11月16日—2021年4月15日在福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行.該基地為全國冬小麥國家區(qū)試赤霉病自然抗性鑒定點(diǎn)，赤霉病每年自然穩(wěn)定發(fā)生，無需接種赤霉病菌.冬小麥于11月16日采用條播法播種，行距為26 cm，畦寬1 m，畦長(zhǎng)20 m，溝深30 cm，基肥施用小麥專用復(fù)合肥900 kg·hm-2、鈣鎂磷肥600 kg·hm-2，播種后覆土并灌跑馬水增加土壤濕度，保證小麥整齊出芽.灌水后立即施用丁草胺除草劑封閉除草，12月10日分蘗盛期施用二甲四氯鈉防治雙子葉雜草，12月25日人工培土除雜草，次年2月2日施用拔節(jié)肥.

1.3.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 共設(shè)置5個(gè)處理：(1)灌根，在小麥?zhǔn)妓肫谟棉卓咕闐Y04的原液灌根處理一次；(2)穗部噴灑原液，分別在小麥?zhǔn)妓肫凇⑹蓟ㄆ诤褪⒒ㄆ谠谒氩繃姙⑥卓咕闐Y04的原液(含助劑)各一次；(3)穗部噴灑發(fā)酵液，分別在小麥?zhǔn)妓肫?、始花期和盛花期在穗部噴灑拮抗菌株DY04的發(fā)酵液(含助劑)各一次；(4)農(nóng)藥對(duì)照，分別在小麥?zhǔn)妓肫?、始花期和盛花期在穗部噴?0%戊唑多菌靈水分散粒劑(河北冠龍農(nóng)化有限公司)各一次；(5)空白對(duì)照(CK)，分別在小麥?zhǔn)妓肫?、始花期和盛花期在穗部噴灑清水各一?每個(gè)處理3次重復(fù)，共15個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)20 m2.穗部噴灑的拮抗菌原液(NB培養(yǎng)液培養(yǎng))和發(fā)酵液(紅糖豆粉培養(yǎng)液培養(yǎng))有效成分含量為150 000億個(gè)·hm-2,灌根處理的有效成分含量為300 000億個(gè)·hm-2.

1.3.3 調(diào)查方法 于小麥黃熟期病害穩(wěn)定時(shí)采用5點(diǎn)取樣法調(diào)查赤霉病發(fā)病情況.每點(diǎn)調(diào)查40穗，每小區(qū)調(diào)查200穗，記錄小麥的病穗數(shù)和病小穗數(shù)，計(jì)算病穗率、病小穗率和防效，防效/%=(空白對(duì)照小區(qū)的病小穗率-處理小區(qū)的病小穗率)/空白對(duì)照小區(qū)的病小穗率×100[27].同時(shí)，于收獲期調(diào)查有效穗數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)，測(cè)千粒重，計(jì)算理論產(chǎn)量和增產(chǎn)率.單位面積理論產(chǎn)量/(kg·hm-2)=平均每穗實(shí)粒數(shù)×千粒重(g)×每公頃有效穗數(shù)×10-3.

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用IBM SPSS Statistics 19軟件選擇單因素方差分析處理數(shù)據(jù).

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)

多粘類芽孢桿菌是一種革蘭氏陽性菌，好氧或兼性厭氧生活[8].顯微鏡(鳳凰光學(xué)PH100-3A41L-EP)下觀察到DY04菌體呈桿狀，菌體大小為(0.5～1.0)μm×(2.0～8.0)μm，在PDA固體培養(yǎng)基上菌落呈白色透明、圓形，邊緣整齊，表面濕潤(rùn)、光滑、微隆起(圖1).形態(tài)特征與多粘類芽孢桿菌相吻合.

圖1 菌株DY04菌落(左)及菌體形態(tài)(右)(×1 000)

2.2 16S rDNA序列比對(duì)結(jié)果

菌株DY04的16S rDNA的序列長(zhǎng)度為1 490 bp.經(jīng)同源性鑒定，該菌株為類芽孢桿菌屬(Paenibacillus).由系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)可以看出，菌株DY04與Paenibacilluspolymyxa(多粘類芽孢桿菌)聚為一個(gè)分支.結(jié)合形態(tài)特征，將其鑒定為多粘類芽孢桿菌.

圖2 菌株DY04的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株DY04的抑菌效果

通過平板對(duì)峙法測(cè)定了菌株DY04對(duì)10種真菌的抑菌活性，結(jié)果(圖3、表1)表明，該菌株對(duì)10種病原真菌均有不同程度的拮抗作用，表現(xiàn)出廣譜抗病原真菌的特性.其中：對(duì)禾谷鐮刀菌和稻瘟病菌的抑制率都達(dá)到80%以上；對(duì)茶擬盤多毛孢、番茄尖孢鐮刀菌、灰霉病菌和玉米紋枯病菌的抑菌活性也較強(qiáng)，抑制率達(dá)到60%以上；對(duì)玉米平臍蠕孢的抑制率最低，為46.27%.

表1 菌株DY04及其發(fā)酵液的拮抗譜1)

2.4 菌株DY04發(fā)酵液的抑菌效果

采用牛津杯對(duì)峙法測(cè)定了菌株DY04發(fā)酵液對(duì)10種真菌的抑菌活性，結(jié)果(表1)表明：菌株DY04發(fā)酵液稀釋至4倍時(shí)對(duì)10種真菌都有抑制作用；稀釋至16倍時(shí)僅對(duì)禾谷鐮刀菌、玉米莖點(diǎn)霉屬、番茄尖孢鐮刀菌和稻瘟病菌等4種真菌具有抑制效果.

2.5 施藥方法對(duì)菌株DY04防治小麥赤霉病的影響

表2顯示，戊唑多菌靈對(duì)小麥赤霉病的防效最高，達(dá)到83.46%.多粘類芽孢桿菌菌株DY04的3種施藥方法中：灌根處理的防效最高，達(dá)到58.43%；穗部噴灑發(fā)酵液的防效次之，為57.76%；穗部噴灑原液的防效為47.63%.

表2 菌株DY04對(duì)小麥赤霉病的田間防治效果1)

2.6 菌株DY04施用方法對(duì)小麥產(chǎn)量的影響

表3顯示，小麥經(jīng)3種方法施用多粘類芽孢桿菌菌株DY04后，穗實(shí)粒率、穗實(shí)粒數(shù)、千粒重與對(duì)照相比均有顯著增加.灌根處理、穗部噴灑原液和穗部噴灑發(fā)酵液處理的千粒重分別比對(duì)照增加8.83%、5.93%和7.21%；理論產(chǎn)量增產(chǎn)率分別為45.21%、25.29%和29.10%.

表3 菌株DY04施用方法對(duì)小麥產(chǎn)量的影響1)

3 討論

多數(shù)研究者認(rèn)為，多粘類芽孢桿菌為土壤中的活躍菌，容易在土壤中定殖和繁殖，在土壤的物資和能量循環(huán)中發(fā)揮重要作用，其代謝產(chǎn)物能夠有效抑制病害；同時(shí)，該菌具有溶磷和固氮作用，能夠增加土壤肥力和調(diào)節(jié)土壤微生態(tài)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)，進(jìn)而增強(qiáng)植物抵抗力[28-33].本試驗(yàn)中的多粘類芽孢桿菌DY04為土壤中篩選出的微生物菌.本研究表明，與穗部噴灑原液(防效為47.63%)或發(fā)酵液(防效為57.76%)相比，田間采用灌根方式施用多粘類芽孢桿菌DY04，對(duì)小麥赤霉病的防效較好，達(dá)58.43%.雖然在穗部施用時(shí)添加了保護(hù)劑等抗紫外線的助劑，且設(shè)置了連續(xù)施藥3次的處理，但是防效持續(xù)性仍不夠強(qiáng)，原菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)紫外線敏感，且原菌不易定殖于植株穗部，導(dǎo)致穗部噴施的效果不及灌根處理.針對(duì)穗部噴藥持效性弱的問題，今后可嘗試煉化該菌的抗紫外線能力后進(jìn)一步驗(yàn)證其持效性；灌根處理雖然防效較好，但與化學(xué)農(nóng)藥相比仍存在很大的差距，本試驗(yàn)中灌根處理只在抽穗初期進(jìn)行了一次，今后可以通過在分蘗初期至揚(yáng)花期增加灌根次數(shù)測(cè)試其是否能夠提高藥效，同時(shí)觀察該菌在土壤中的定殖能力，為進(jìn)一步分析其控制赤霉病發(fā)生的機(jī)理奠定基礎(chǔ).

赤霉病菌會(huì)造成小麥穗部空癟、籽粒發(fā)紅發(fā)黑、千粒重低，從而降低結(jié)實(shí)率.本研究表明，與穗部噴灑原液或發(fā)酵液相比，灌根處理后小麥產(chǎn)量的增幅最大，千粒重比對(duì)照增加8.83%，理論產(chǎn)量增產(chǎn)率為45.21%.筆者田間觀察發(fā)現(xiàn)，用多粘類芽孢桿菌DY04灌根處理后，灌漿期小麥籽粒外殼部分雖然有紅褐色病斑，但后期受到控制并未影響內(nèi)部健康籽粒；而穗部噴灑原液或發(fā)酵液后，灌漿后期外殼帶菌麥粒并不能被有效控制，赤霉病菌仍向內(nèi)部發(fā)展，從而降低了籽粒品質(zhì).有關(guān)灌根處理對(duì)小麥赤霉病的防治機(jī)理值得深入研究.

致謝：衷心感謝蘇妍、黃繼平、洪紅升、葛桂梅、劉友等同事對(duì)該試驗(yàn)給予的幫助.