季 佳，黃小蘭，尹紅斌，李素華，黃景軍，欒云鵬

(1. 西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224 ； 2. 云南省動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南 昆明 650051)

胎盤是母體與胎兒之間進行物質交換的唯一器官，通過臍帶和胎兒相連，胎兒需要的鈣全部來自母體。由于胎兒血液鈣濃度高于母體，母體-胎兒鈣轉運是經(jīng)胎盤的主動轉運過程[1]。瞬時性受體電位通道香草酸受體5、6[Transient receptor potential vanilloid 5、6(TRPV5,TRPV6)]是鈣離子高度選擇性通道，廣泛表達于多種哺乳動物組織中[2]。課題組前期研究顯示[3]，TRPV5高表達于妊娠胎盤的迷路區(qū)合體滋養(yǎng)層細胞，TRPV6高表達于妊娠胎盤的連接帶海綿滋養(yǎng)層細胞，且二者在妊娠最后5 d的胎盤組織中維持著高表達量，此時期與高效母體-胎兒鈣轉運一致。研究結果提示，TRPV5和TRPV6可能參與了胎盤介導的母體-胎兒鈣轉運過程，并參與胎兒鈣代謝的調節(jié)。本試驗以小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞為研究對象，通過細胞TRPV5和TRPV6基因的沉默，分析胎盤滋養(yǎng)層細胞鈣轉運功能，揭示TRPV5和TRPV6在母體-胎兒鈣轉運過程中的生理學作用，完善孕期母體和胎兒的鈣轉運機制，為預防胎兒鈣代謝障礙性疾病提供臨床基礎理論。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器 RNA干擾慢病毒載體TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (Mouse)及TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (Mouse),均為Abm生物科技公司產品；TRPV5單克隆抗體為Abcam公司產品；CK7抗體、Vimentin抗體及TRPV6多克隆抗體，均為Santa Cruz公司產品；DMEM高糖培養(yǎng)液為Gibco公司產品；胎牛血清為Hyclone公司產品；Percoll細胞分離液、促轉染劑Polybrene聚凝胺及細胞培養(yǎng)級非離子型表面活性劑Pluronic F-127，均為Sigma-Aldrich公司產品；Rhod-2-AM熒光染料為美國Thermo Fisher公司產品，PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒及SYBR PremixExTaqTM試劑盒，均為TaKaRa公司產品；其他免疫組織學試劑及細胞培養(yǎng)試劑，均為武漢博士德公司或上海碧云天生物技術研究所產品。CS SP5型激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)為德國Leica公司產品；熒光定量PCR儀為美國ABI公司7500型產品；熒光顯微鏡為日本Olympus 公司CX31-32L02型產品。

1.2 胎盤滋養(yǎng)層細胞的分離及鑒定 取發(fā)情期雌性昆明小鼠與雄性昆明小鼠等比例合籠，次日觀察陰道栓，見栓則記為妊娠0.5 d。取妊娠7.5 d的雌性小鼠，無菌分離胎盤組織，用含雙抗的D-Hank’s溶液清洗去除血污，并剪成1 mm3的組織小塊。參考Handschuh等[4]建立的Percoll密度梯度離心法，并進行改良。含0.125%胰蛋白酶和50 U的I型DNA酶的混合酶溶液消化組織小塊60 min，加入含血清的細胞培養(yǎng)液終止消化。收集消化液，使用200目的無菌不銹鋼篩網(wǎng)過濾，收集濾液，500 g離心10 min，無血清DMEM高糖培養(yǎng)基懸浮細胞，加至35%、40%、45%、50%和55%五種不連續(xù)的Percoll密度梯度液中，1 000 g離心30 min，吸取40%和45%密度層之間的細胞。加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基中，500 g離心10 min清洗細胞后，以10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種于25 cm2細胞瓶，倒置顯微鏡下每天觀察細胞形態(tài)和生長狀態(tài)。參考已報道的方法[5]，利用免疫熒光細胞化學法對小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞進行鑒定。將稀釋至1×105個/mL的細胞懸液接種于含蓋玻片的12孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長成單層，取出蓋玻片，制成細胞爬片。D-Hank’s溶液清洗細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min后，滴加足量以1∶100比例稀釋的CK7抗體或Vimentin抗體，4 ℃冰箱孵育過夜。D-Hank’s溶液清洗細胞，加入1∶50稀釋的FITC標記的羊抗小鼠IgG二抗，室溫孵育2 h。 D-Hank’s溶液再次清洗細胞后，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 慢病毒轉染胎盤滋養(yǎng)層細胞 細胞轉染試驗分為3個組，即siTRPV5組[細胞轉染載體TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (Mouse)]，siTRPV6組[細胞轉染載體TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (Mouse)]以及Control組(細胞無Lentivirus載體轉染的空白對照組)。每組設4個重復。昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液制成細胞懸液，每孔5×104個細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當細胞匯合度達30%～40%后，更換新鮮的含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液，每孔1 mL。siTRPV5組和siTRPV6組各孔分別加入TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus、TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus 10 μL，感染復數(shù)(Multiple of infection,MOI)為20，Control組各孔無慢病毒載體添加；同時向各孔中加入2 μL無菌超純水溶解的5 μg/μL Polybrene液(終濃度為10 μg/mL)。在37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h后，更換新鮮含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，細胞匯合度達90%時，按1∶2傳代細胞。

1.4 RT-PCR TRIzol法提取細胞RNA，參考文獻[6]報道的方法，分別合成TRPV5和TRPV6基因的上下游特異性引物，利用TaKaRa公司PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒，通過傳統(tǒng)RT-PCR試驗擴增TRPV5和TRPV6基因。根據(jù)試劑盒操作說明書，反轉錄體系為20 μL∶0.5 μL兩步法反轉錄酶、4 μL 5×緩沖液、0.5 μL RNA酶抑制劑、1 μL dNTP混合液、1 μL Oligo dT引物、2 μL模板RNA以及11 μL無RNA酶水；在PCR儀上進行42 ℃反轉錄反應10 min， 95 ℃失活反應5 min后進行PCR反應。PCR反應體系：5 μL反轉錄反應液、0.5 μLExTaq酶、5 μL 10×PCR緩沖液、2 μL dNTP混合液、特異上下游引物各0.5 μL以及36.5 μL無菌水補充體系至50 μL；PCR擴增30個循環(huán)，循環(huán)程序：94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸40 s。

1.5 實時熒光定量RT-PCR 傳統(tǒng)RT-PCR驗證為陽性的樣本，參照文獻[7]合成TRPV5和TRPV6基因實時熒光定量RT-PCR反應的特異性引物，利用TaKaRa公司SYBR PremixExTaqTM試劑盒，實時熒光RT-PCR法監(jiān)測TRPV5/6 mRNA相對定量。按照試劑盒操作說明書，反應體系為25 μL∶12.5 μL 2×SYBR PremixExTaq酶、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、2 μL cDNA模板、0.5 μL ROX參考染料以及9 μL ddH2O；反應程序:95 ℃預變性15 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 40 s，40次循環(huán)。采用相對定量，以β-actin為內參，按照公式RQ=2-△△Ct[ΔCt=Ct(目的基因)-Ct(內參基因)，ΔΔCt=ΔCt(樣品)- ΔCt(定標組)，本試驗以Control組作為定標組]，進行基因定量分析[8]。

1.6 Western Blot 裂解細胞，取上清液測定蛋白質濃度。調整待檢樣品濃度定為相同值，SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀電轉至PVDF膜，脫脂牛奶室溫封閉2 h后，加入抗體稀釋液稀釋的一抗(TRPV5 1∶10 000稀釋；TRPV6 1∶5 000稀釋；β-actin 1∶2 000稀釋)，4 ℃孵育過夜，室溫下二抗(HRP偶聯(lián)的羊抗兔IgG)孵育2 h。ECL發(fā)光底物顯色，暗室中采用KODAK X-OMAT BT膠片曝光。經(jīng)顯影、定影的膠片進行掃描，用Image J軟件處理分析目標帶灰度值，β-actin條帶灰度值進行校正，以各條帶的相對灰度值代表蛋白的相對表達量。

1.7 激光共聚焦顯微鏡鈣成像 共聚焦成像培養(yǎng)碟預先用20 μL明膠鋪底，干燥2 h。分別取Control組、siTRPV5組和siTRPV6組處于對數(shù)生長期細胞，制成4×104個/mL的細胞懸液，每碟1 mL接種培養(yǎng)碟。37 ℃、5%CO2孵育32 h后加入1 mL新鮮的成像緩沖液(NaCl 140 mmol/L，KCl 2.5 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl21 mmol/L，HEPES 20 mmol/L，pH 7.4)。將50 μg Rhod-2-AM溶于100 μL 成像緩沖液、8 μL DMSO及2 μL 濃度為50% Pluronic F-127制成的混合溶液中，制成Rhod-2-AM工作液，加入培養(yǎng)碟中，完全覆蓋細胞，置于5%CO2培養(yǎng)箱，37 ℃孵育1 h。然后加入5倍體積的含10%胎牛血清的Hank’s液，繼續(xù)培養(yǎng)40 min，棄去培養(yǎng)液，用無Ca2+、Mg2+的Hank’s液清洗2次，洗脫未結合的熒光物質。使用TCS SP5 激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)進行掃描檢測，掃描參數(shù)：激發(fā)波長552 nm，發(fā)射波長581 nm，20倍物鏡下檢測綠色熒光，儲存鈣熒光圖像，應用Kinetics-Image Analysis數(shù)據(jù)分析軟件，分析細胞內熒光強度，每組至少計數(shù)10個典型細胞視野，給出相應的熒光強度值。

1.8 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標準差方式表示，以SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理，采用單因素方差分析作差異的顯著性比較，P<0.05表示有顯著差異。

2 結果

2.1 昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 采用Percoll密度梯度離心分離的細胞，培養(yǎng)5 h后可觀察到有細胞開始貼壁生長，20 h后細胞全部貼壁。細胞為單個核，貼壁早期呈現(xiàn)出梭形或紡錘形等多樣形態(tài)(圖1A)，培養(yǎng)72 h后細胞呈片狀鋪展生長(圖1B)。細胞爬片CK7及Vimentin抗體免疫熒光染色結果顯示，所分離細胞CK7染色陽性，而Vimentin蛋白表達極少(圖1C、1D)。結果表明本試驗中所分離到的細胞為胎盤滋養(yǎng)層細胞。

圖1 昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞特征(100×,標尺=200 μm)Fig.1 Characterization of cytotrophoblast from Kunming mice (100×,bar=200 μm)A：分離培養(yǎng)20 h的細胞形態(tài)； B：分離培養(yǎng)72 h的細胞形態(tài)； C：CK7蛋白鑒定陽性； D：Vimentin蛋白鑒定陽性A:Morphology of primary cells after 20 h of incubation; B:Morphology of primary cells after 72 h of incubation; C:Positive expression of cytokeratin 7 by immunofluorescent staining; D:Positive expression of vimentin by immunofluorescent staining

2.2 慢病毒轉染對胎盤滋養(yǎng)層細胞TRPV5/6 mRNA及蛋白表達的影響 傳統(tǒng)RT-PCR結果顯示，各個試驗組細胞均可檢測到TRPV5和TRPV6的預期目的條帶(圖2)。實時熒光定量RT-PCR結果顯示，TRPV5 RNA/shRNA/RNAi Lentivirus轉染48 h后，與Control組相比，siTRPV5組胎盤滋養(yǎng)層細胞的TRPV5 mRNA及蛋白表達量顯著降低(P=0.001 5或P=0.032 0)，且TRPV6蛋白表達量也顯著降低(P=0.022 1)；與Control組相比，TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus轉染48 h后，siTRPV6組胎盤滋養(yǎng)層細胞不僅可見到TRPV6 mRNA及蛋白表達量顯著降低(P=0.001 7或P=0.031 9)，亦可見到TRPV5 mRNA表達水平的顯著降低(P=0.022 5)(圖3)。結果表明，慢病毒顆粒干擾效率較好，可以對相應基因的表達產生良好的表達抑制效果。試驗結果也顯示出TRPV5和TRPV6具有交互作用。

圖2 TRPV5和TRPV6基因擴增產物凝膠電泳檢測Fig.2 Detection of the gene amplification products for TRPV5 and TRPV6 by agarose gel electrophoresis1：陰性對照； 2～4：TRPV5基因RT-PCR產物(301 bp)； 5～8：TRPV6基因RT-PCR產物(312 bp)； M：DNA分子量標準DL2 0001:Negative control; 2-4:RT-PCR product of TRPV5 gene (301 bp); 5-8:RT-PCR product of TRPV6 gene (312 bp); M:DNA marker DL2 000

圖3 昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞TRPV5、TRPV6的 mRNA及蛋白表達水平Fig.3 mRNA and protein expression of TRPV5 and TRPV6 in placental cytotrophoblasts from Kunming miceA：TRPV5 mRNA基因的相對表達量； B：TRPV6 mRNA基因的相對表達量; C:TRPV5蛋白相對表達量； D：TRPV6蛋白相對表達量siTRPV5：細胞轉染載體TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (小鼠)； siTRPV6：細胞轉染載體TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus (小鼠)；Control：細胞無Lentivirus載體轉染；*：差異顯著,P<0.05；下圖同A:Relative expression of TRPV5 mRNA gene; B:Relative expression of TRPV6 mRNA gene; C:Relative expression of TRPV5 protein; D:Relative expression of TRPV6 proteinsiTRPV5:Cells transfected with TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi lentivirus (Mice); siTRPV6:Cells transfected with TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi lentivirus (Mice); Control:Cells without lentivirus transfection; *:Difference was significant,P<0.05. The same as below

2.3 激光共聚焦顯微鏡鈣離子成像檢測細胞內鈣離子濃度的變化 經(jīng)TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus、TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus分別轉染昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞，熒光染料Rhod-2-AM負載后，激光共聚焦顯微鏡進行熒光強度掃描，細胞的鈣成像形態(tài)見圖4。結果顯示，與Control組相比，siTRPV5組(P=0.042 1)、siTRPV6組(P=0.008 8)熒光強度降低，慢病毒轉染的2個組的細胞熒光強度未見顯著差異(P=0.070 1)(圖5)。結果說明沉默昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的TRPV5、TRPV6基因可降低細胞內鈣離子濃度，影響細胞的鈣轉運功能。

圖4 昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞Ca2+的激光共聚焦顯微鏡技術成像Fig.4 Ca2+ imaging by laser confocal microscopy in placental cytotrophoblasts from Kunming mice

圖5 昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的Ca2+熒光強度Fig.5 Ca2+ fluorescence intensity in placental cytotrophoblasts from Kunming mice

3 討論

已有研究證實，鈣離子的主動轉運過程需要鈣離子通路、鈣結合蛋白以及鈉鈣交換器等蛋白質的參與[9-10]。妊娠后期的昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞存在高水平的TRPV5和TRPV6，提示TRPV5和TRPV6可能介導了這種母體-胎兒鈣轉運，且胎盤滋養(yǎng)層細胞可能是介導鈣轉運發(fā)生的細胞。

本試驗采用TRPV5 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus、TRPV6 siRNA/shRNA/RNAi Lentivirus轉染細胞以此構建TRPV5、TRPV6基因表達沉默的細胞模型。通過實時熒光定量RT-PCR及Western Blot分別檢測TRPV5、TRPV6的mRNA及蛋白質表達，結果顯示，細胞內TRPV5、TRPV6 mRNA及蛋白水平在慢病毒轉染的胎盤滋養(yǎng)層細胞中表達均下調，提示試驗采用的慢病毒顆粒對TRPV5、TRPV6基因具有沉默效果。本試驗還發(fā)現(xiàn)，TRPV6基因的沉默在mRNA水平對TRPV5具有抑制效果，而TRPV5基因的沉默對TRPV6蛋白具有顯著的抑制效果，這些結果提示，TRPV5、TRPV6在mRNA水平具有互作效應。研究顯示，TRPV5和TRPV6氨基酸序列與瞬時電位受體家族的其他成員僅有30%～40%的同源性，但是二者本身卻高度同源[11-12]。在蛋白質結構方面，TRPV5和TRPV6均顯示出典型的拓撲結構特征，包括龐大的N-和C-末端結構域以及6個跨膜區(qū)域，5-6跨膜結構間存在1個短的疏水片段，被認為是鈣孔隙形成區(qū)[11-12]。二者在結構上的共同性提示基因間存在互作的可能性。

激光共聚焦顯微鏡鈣離子成像試驗顯示，昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞內TRPV5、TRPV6基因表達沉默后，細胞內鈣離子濃度降低，結果說明，TRPV5、TRPV6在胎盤鈣轉運過程中發(fā)揮著積極的作用，可以促進妊娠期母體-胎兒的鈣傳遞。本試驗得到的TRPV6在胎盤鈣轉運這一生理過程中的生物學作用與Yoshiro等[13]的結論一致。

深入分析本試驗結果提示：單一基因的沉默也能導致細胞生理學功能的障礙。筆者認為，昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞的鈣轉運功能可能是由TRPV5和TRPV6共同完成，TRPV5和TRPV6異四聚體構型可能是介導細胞這一功能的形式。TRPV5和TRPV6可形成低聚復合物的研究已有報道。有學者通過蔗糖梯度沉淀TRPV5、TRPV6復合物，經(jīng)交聯(lián)研究、免疫共沉淀試驗和分子質量測定已經(jīng)表明在腎臟遠端小管上皮細胞上存在有TRPV5和TRPV6異四通道復合物[14-15]。目前，研究者正在深化關于異聚復合物的認識，以證明這種復合物改變了經(jīng)典瞬時受體電位通道 (Transient receptor potential canonical channel,TRPC) 家族成員的活性，如TRPC1和TRPC3形成的雜低聚物賦予了這些通道不同的特性[14-15]。筆者推測，昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞內鈣離子濃度的降低可能是TRPV5或者TRPV6沉默導致的某一蛋白亞單位缺失，使得TRPV5和TRPV6的低聚四聚體形成障礙所致。因此課題組下一步研究計劃揭示昆明小鼠胎盤滋養(yǎng)層細胞上所表達的TRPV5及TRPV6蛋白的亞單位類型，借此進一步完善TRPV5和TRPV6對胎盤鈣轉運的影響機制。