李 樺，黎增權(quán)，屈 倩，劉 翠，郭世寧，石達(dá)友

(1. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，廣東 廣州 510260 ; 2. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

熱應(yīng)激的機(jī)制被認(rèn)為是由中樞神經(jīng)系統(tǒng)而不是周圍器官的紊亂引起的，對(duì)腸道功能的理解也集中在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收上[1-2]。補(bǔ)益類中藥所含多糖成分對(duì)于腸道益生微生物有扶植作用，其所產(chǎn)的代謝物又對(duì)致病微生物的生長(zhǎng)有間接抑制作用[3-5]?？诜兴幈粰C(jī)體腸道菌群代謝后，產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物具有高效藥理作用[6-8]。多糖、皂苷、黃酮類等物質(zhì)是中藥藥效的基礎(chǔ)成分，在宿主腸道菌群或與宿主共代謝的條件下，可促進(jìn)乳酸桿菌、雙歧桿菌的繁殖，導(dǎo)致大腸桿菌等腸道致病菌繁殖受阻[9]。本試驗(yàn)旨在探討大鼠熱應(yīng)激與腸道菌群變化的關(guān)系，并為中藥復(fù)方和益生素干預(yù)熱應(yīng)激的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開展[許可證號(hào)：SYXK(粵)2019—0136]。7周齡SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，(180±10) g，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)：440021000005777。

1.2 試驗(yàn)藥品與制備 中藥復(fù)方由紫錐菊、黃芩、藿香、香薷、石膏、陳皮、白術(shù)、甘草8味中藥組成，其中香薷、藿香和陳皮加8倍量水泡0.5 h，提取揮發(fā)油5 h，收集揮發(fā)油備用，蒸餾后的水溶液另器收集。藥渣與其余5味藥材加10倍量水煎煮3次，每次2 h，合并煎液，濾過，減壓濃縮至含量為1.12 g/mL生藥，濾過，即得。益生素：上海申亞動(dòng)物保健有限公司，批號(hào)：5405201506HF。大鼠血清HSP70試劑盒，南京建成生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：DZE30341。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 20只成年Wistar雄性大鼠，隨機(jī)分成4個(gè)組，每組5只，常溫空白組(Normal temperature control group, NC group)、中藥組(Traditional Chinese medicine group, TCM group)、益生素組(Probiotic group, Pro group)和熱應(yīng)激組(Heat stress group, HS group)。常溫空白組于溫度20～26 ℃環(huán)境下飼養(yǎng)；其余3個(gè)組用室內(nèi)加熱器將環(huán)境溫度保持在35～38 ℃，濕度在50%～60%。中藥組在熱應(yīng)激下，每天按7 mg/(kg·bw)灌服中藥，灌服濃度和體積按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量計(jì)算[10]，益生素組灌服與中藥組等體積0.04%益生素，熱應(yīng)激組和常溫空白組分別于熱應(yīng)激下和常溫下灌胃等量生理鹽水，自由飲水、采食，試驗(yàn)期7 d。分別在熱應(yīng)激3 h、1 d、3 d和7 d后，麻醉后腹主動(dòng)脈采血，用于檢測(cè)血清HSP70蛋白，采用抗大鼠 HSP70 單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的 HSP70與單抗結(jié)合的雙抗體夾心 ABC-ELISA法。收集盲腸內(nèi)容物約5 g，提取總DNA，進(jìn)行16S rDNA v3～v4段測(cè)序和盲腸腸道微生物群分析。

1.4 生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)分析 剔除小于200 bp且不明確的堿基標(biāo)記，合并相同或重復(fù)的序列，檢查并移除嵌合體序列。α多樣性包括Chao 1指數(shù)、Shannon指數(shù)和稀釋曲線。通過單樣本分析(α多樣性)可以反映微生物群落的豐度和多樣性，包括一系列統(tǒng)計(jì)分析指標(biāo)來估計(jì)環(huán)境群落物種的豐度和多樣性。β多樣性分析包括主成分分析(PCA)和主坐標(biāo)分析(PCOA)，樣本間的差異和距離可以通過PCA用方差分解來反映，如樣品的組成比較相似，反映出PCA圖中距離越近。通過PCOA分析得到不同樣本的距離矩陣信息。群落功能預(yù)測(cè)與分析是將每個(gè)試驗(yàn)組的腸道微生物基因集與基因組數(shù)據(jù)庫(KEGG)進(jìn)行比較，通過構(gòu)建測(cè)序基因組的功能基因獲得16S rDNA測(cè)序中的物種組成信息。

2 結(jié)果

2.1 大鼠不同時(shí)期血清HSP70濃度的變化 由表1可知，熱應(yīng)激各時(shí)期，熱應(yīng)激組血清HSP70濃度均極顯著升高(P<0.01)；熱應(yīng)激3 h到熱應(yīng)激3 d，中藥組和益生素組大鼠血清HSP70濃度差異不顯著(P>0.05)。

表1 大鼠不同時(shí)期血清HSP70濃度Table 1 Serum HSP70 concentration in rats at different stages (ng/L,n =5)

2.2 熱應(yīng)激對(duì)大鼠腸道菌群α多樣性指數(shù)的影響熱應(yīng)激3 h、1 d、3 d和7 d各試驗(yàn)組之間的多樣性指數(shù)分別如表2～5所示。由表2可知，熱應(yīng)激3 h時(shí)，中藥組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)與熱應(yīng)激組相比顯著升高(P<0.05)，中藥組PD_whole_tree極顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.01)，常溫空白組Shannon指數(shù)顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.05)；由表3可知，熱應(yīng)激試驗(yàn)1 d時(shí)，各組多樣性指數(shù)無顯著差異(P>0.05)；由表4可知，熱應(yīng)激3 d時(shí)，熱應(yīng)激組Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)顯著低于中藥組(P<0.05)和常溫空白組(P<0.05)，各組PD_whole_tree指數(shù)無顯著差異(P>0.05)，中藥組Shannon指數(shù)與益生素組相比顯著升高(P<0.05)；由表5可知，熱應(yīng)激7 d時(shí)，益生素組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)分別與熱應(yīng)激組相比顯著和極顯著升高(P<0.05和P<0.01)，而熱應(yīng)激組Chao1指數(shù)和PD_whole_tree指數(shù)分別與常溫空白組相比也顯著和極顯著降低(P<0.05和P<0.01)，各試驗(yàn)組Shannon指數(shù)無顯著差異(P>0.05)?？梢?，大鼠盲腸腸道微生物的多樣性因處熱應(yīng)激環(huán)境而降低，通過中藥復(fù)方口服液和益生素，可使熱應(yīng)激下腸道菌群物種多樣性處于高于正常水平，從而抵御熱應(yīng)激對(duì)腸道的損傷。

表2 熱應(yīng)激3 h各試驗(yàn)組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 2 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 3 hours of heat stress

表3 熱應(yīng)激1 d各試驗(yàn)組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 3 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 1 day of heat stress

表4 熱應(yīng)激3 d各試驗(yàn)組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 4 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 3 days of heat stress

表5 熱應(yīng)激7 d各試驗(yàn)組腸道菌群多樣性指數(shù)Table 5 Intestinal microflora diversity index of each experimental group after 7 days of heat stress

2.3 熱應(yīng)激對(duì)大鼠腸道微生物群β多樣性指數(shù)的影響 本試驗(yàn)采用了主成分分析(PCA)和基于UniFrac距離上對(duì)各試驗(yàn)組之間進(jìn)行加權(quán)(Weighted)和非加權(quán)(Unweighted)的主坐標(biāo)分析(PCoA)。見圖1，代表2個(gè)樣本的點(diǎn)的距離越近其樣本組成越相似。在熱應(yīng)激3 h階段，各試驗(yàn)組組內(nèi)數(shù)據(jù)比較集中，各組內(nèi)個(gè)體差異較小，中藥組、益生素組和熱應(yīng)激組的腸道菌群開始出現(xiàn)差異性，說明在經(jīng)歷熱應(yīng)激3 h時(shí)各組大鼠盲腸腸道菌群開始出現(xiàn)變化，與常溫大鼠的腸道菌群多樣性相比，這種變化由中藥復(fù)方、益生素引起；到了熱應(yīng)激7 d，各試驗(yàn)組組內(nèi)散點(diǎn)基本聚在一起，說明各組內(nèi)個(gè)體差異較小，常溫空白組與其余3個(gè)組的散點(diǎn)、熱應(yīng)激組與其余3個(gè)組散點(diǎn)，還有常溫空白組與熱應(yīng)激組散點(diǎn)完全分開，而中藥組與益生素組的散點(diǎn)基本交疊，表明大鼠經(jīng)歷了7 d熱應(yīng)激后，未經(jīng)治療的熱應(yīng)激大鼠腸道菌群多樣性與常溫大鼠相比已有明顯差異，這是由熱應(yīng)激帶來的損傷引起的；7 d熱應(yīng)激過程中，一直用中藥復(fù)方和益生素治療確實(shí)對(duì)大鼠盲腸腸道菌群多樣性差異帶來顯著影響，而中藥和益生素產(chǎn)生的積極影響相似。

圖1 各試驗(yàn)組大鼠腸道菌群多樣性差異的PCA分析Fig.1 PCA analysis of differences in intestinal flora diversity among each experimental groupA:熱應(yīng)激3 h后; B: 熱應(yīng)激7 d后； 黑色：中藥組； 紅色：益生素組； 綠色：熱應(yīng)激組； 藍(lán)色：常溫空白組A:3 h after heat stress； B:7 d after heat stress; Black:Traditional Chinese medicine group; Red:Probiotic group; Green:Heat stress group; Blue:Normal temperature control group

如圖2所示，在熱應(yīng)激3 h，基于UniFrac分析的非加權(quán)和加權(quán)差異分析，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為13.99%、8.71%和52.76%、12.92%，各試驗(yàn)組組內(nèi)出現(xiàn)比較明顯的分離，但試驗(yàn)組間趨向于不同象限，說明大鼠盲腸腸道微生物的多樣性差異因熱應(yīng)激環(huán)境以及口服中藥與益生素發(fā)生變化。如圖3所示，在熱應(yīng)激7 d，第1主成分和第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為29.21%、18.84%和9.67%、8.68%，各試驗(yàn)組散點(diǎn)完全分離，組間象限分布趨勢(shì)較試驗(yàn)3 h時(shí)明顯，其中熱應(yīng)激組和常溫空白組分離的距離最遠(yuǎn)，中藥組和益生素組介于中間，但分離距離與常溫空白組靠近。說明隨著熱應(yīng)激的進(jìn)行，各試驗(yàn)組腸道菌群多樣性的差異較在熱應(yīng)激3 h明顯，隨著熱應(yīng)激下口服中藥復(fù)方和口服益生素，熱應(yīng)激大鼠腸道微生物多樣性有趨向于正常大鼠的變化。

圖2 熱應(yīng)激3 h后的加權(quán)(A)和非加權(quán)(B)分析Fig.2 Weighted(A) and Unweighted(B) analysis charts after 3 hours of heat stress紅色：中藥組； 深藍(lán)色：熱應(yīng)激組； 青色：益生素組； 綠色：常溫空白組；下圖同Red:Traditional Chinese medicine group; Dark blue:Heat stress group; Cyan:Probiotic group; Green:Normal temperature control group. The same as the following figures

圖3 熱應(yīng)激7 d后的加權(quán)(A)和非加權(quán)(B)分析圖Fig.3 Weighted(A) and Unweighted(B) analysis after 7 days of heat stress

2.4 物種豐度與群落組成分析 本試驗(yàn)采用Pynast軟件和Greengenes數(shù)據(jù)庫，比較各試驗(yàn)組已知序列屬水平相對(duì)豐度。如圖4，試驗(yàn)在熱應(yīng)激3 h時(shí)，益生素組梭菌屬與熱應(yīng)激組相比顯著降低(P<0.05)，熱應(yīng)激組梭菌屬也顯著高于常溫空白組(P<0.05)，中藥組顫螺旋菌屬(Oscillospira)均極顯著高于其余3個(gè)試驗(yàn)組(P<0.01)，益生素組的瘤胃球菌屬顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.05)，中藥組的擬桿菌屬也顯著高于常溫空白組(P<0.05)；熱應(yīng)激1 d時(shí)只有4個(gè)菌屬顯著變化，其中中藥組乳酸桿菌屬(Lactobacillus)均極顯著高于各試驗(yàn)組(P<0.01)，益生素組的乳酸桿菌屬也顯著高于熱應(yīng)激組，中藥組毛螺菌屬含量顯著低于益生素組和熱應(yīng)激組(P<0.05)；在熱應(yīng)激3 d時(shí)，有15個(gè)菌屬有顯著性差異，其中熱應(yīng)激組與常溫空白組相比乳酸桿菌屬極顯著降低(P<0.01)，中藥組擬桿菌屬(Bacteroides)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)與常溫空白組相比顯著升高(P<0.05)，益生素組顫螺旋菌屬(Oscillospira)也顯著高于常溫空白組；而到了熱應(yīng)激7 d時(shí)，菌屬的差異性變化有18個(gè)，隨著熱應(yīng)激的進(jìn)行，常溫空白組的擬桿菌屬(Bacteroides)與各試驗(yàn)組相比均極顯著升高(P<0.01)，與熱應(yīng)激組相比，各試驗(yàn)組顫螺旋菌屬和瘤胃球菌屬均極顯著升高(P<0.01)，中藥組糞球菌屬(Coprococcus)顯著高于常溫空白組(P<0.05)，各試驗(yàn)組毛螺菌屬顯著高于熱應(yīng)激組(P<0.05)，但中藥組、益生素組和熱應(yīng)激組3個(gè)試驗(yàn)組的梭菌屬比常溫組的顯著升高(P<0.05)。說明熱應(yīng)激下腸道微生物的一些優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了變化，中藥與益生素的治療在熱應(yīng)激階段對(duì)腸道優(yōu)勢(shì)菌屬有一定的積極作用。

圖4 各試驗(yàn)組不同時(shí)期腸道菌群屬生物分類水平占比Fig.4 Proportion of intestinal microflora in different periods of each experimental group3 hT、1 dT、3 dT和7 dT:中藥組分別在熱應(yīng)激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hP、1 dP、3 dP和7 dP:益生素組分別在熱應(yīng)激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hH、1 dH、3 dH和7 dH:熱應(yīng)激組分別在熱應(yīng)激3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例； 3 hC、1 dC、3 dC和7 dC:常溫空白組分別在試驗(yàn)3 h、1 d、3 d和7 d腸道菌群屬分類所占比例3 hT,1 dT,3 dT and 7 dT: Proportion of intestinal flora classification of traditional Chinese medicine group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress; 3 hP,1 dP,3 dP and 7 dP: Proportion of intestinal flora classification of probiotic group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress;3 h H,1 dH,3 dH and 7 dH: Proportion of intestinal flora classification of heat stress group at 3 h,1 d,3 d and 7 d of heat stress;3 hC,1 dC,3 dC and 7 dC: Proportion of intestinal flora classification of normal temperature control group at 3 h,1 d,3 d and 7 d

2.5 KEGG群落功能預(yù)測(cè)注釋 本試驗(yàn)通過種屬功能基因構(gòu)成共獲得6 909個(gè)與KEGG數(shù)據(jù)庫有顯著配對(duì)的功能基因，這些途徑被分為5個(gè)主要種類：代謝(Metabolic)、遺傳信息處理(Genetic information processing)、環(huán)境信息處理(Environment information processing)、細(xì)胞過程(Cellular processes)和生物系統(tǒng)(Organismal systems)。5個(gè)功能分類，選出35個(gè)主要的KEGG途徑，主要的KEGG途徑如圖5所示。各試驗(yàn)組生物途徑的變化主要集中在代謝、遺傳信息處理、環(huán)境信息處理和細(xì)胞過程這4類生物途徑，其中熱應(yīng)激組各種生物途徑均比其余3個(gè)試驗(yàn)組活躍，與其他各試驗(yàn)組相比，熱應(yīng)激組在糖代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)和膜轉(zhuǎn)運(yùn)(Membrane transport)的基因表達(dá)活躍，中藥組、益生素組和常溫空白組各生物途徑差異不顯著，且中藥組生物路徑上的基因活動(dòng)最低，益生素組的生物路徑與常溫空白組接近，說明：(1)熱應(yīng)激下，機(jī)體多個(gè)生物功能途徑反應(yīng)劇烈，以糖代謝、氨基酸代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)最為活躍；(2)熱應(yīng)激下通過中藥復(fù)方口服液和益生素的治療，各生物功能途徑趨于正常，其中益生素組與常溫空白組最接近。

圖5 功能基因的KEGG統(tǒng)計(jì)Fig.5 KEGG statistics of functional genes

3 討論

熱休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)被認(rèn)為是機(jī)體受到熱應(yīng)激之后產(chǎn)生的保護(hù)細(xì)胞的蛋白質(zhì)家族，在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激的過程中，其他蛋白的合成受到抑制，熱休克蛋白大量合成。熱休克蛋白可分為不同的蛋白分子，其中的HSP70蛋白家族，在溫度變化等應(yīng)激反應(yīng)下最具有指導(dǎo)意義。

中醫(yī)的陰陽消長(zhǎng)平衡與機(jī)體腸道菌群的平衡有著相似之處。在機(jī)體的腸道菌群活動(dòng)也處于這種消長(zhǎng)的變化中，腸道菌群出現(xiàn)失調(diào)，機(jī)體就會(huì)發(fā)生疾病[11]。采用16S rDNA 的變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術(shù)，對(duì)熱應(yīng)激蛋雞小腸段腸道微生物的多樣性和數(shù)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激下腸道微生物菌株豐富，且對(duì)乳酸桿菌等優(yōu)勢(shì)菌屬有抑制作用[12]。社會(huì)混亂(Social disruption,SDR)應(yīng)激會(huì)降低擬桿菌屬的相對(duì)豐度，增加梭菌屬的相對(duì)豐度[13]。本試驗(yàn)可得出，大鼠盲腸腸道微生物的多樣性由于處在熱應(yīng)激環(huán)境而降低，通過灌服中藥復(fù)方和益生素，可以使熱應(yīng)激下腸道菌群物種多樣性恢復(fù)至高于正常水平，從而抵御熱應(yīng)激對(duì)腸道的損傷。

通過主成分分析(PCA)和主坐標(biāo)分析(PCoA)對(duì)各試驗(yàn)組在熱應(yīng)激3 h和熱應(yīng)激7 d腸道菌群的組成進(jìn)行了整體的評(píng)價(jià)，可以看出熱應(yīng)激3 h時(shí)，中藥組、益生素組和熱應(yīng)激組的腸道菌群菌落開始出現(xiàn)差異性的趨勢(shì)，熱應(yīng)激7 d后，未經(jīng)治療的熱應(yīng)激大鼠腸道菌群多樣性與常溫大鼠相比已有明顯差異，這是由熱應(yīng)激帶來的損傷引起的，7 d熱應(yīng)激過程中，一直用中藥復(fù)方和益生素治療確實(shí)對(duì)大鼠盲腸腸道菌群多樣性差異帶來顯著影響，而中藥和益生素產(chǎn)生的積極影響相似。

中藥含有的成分多糖、生物堿、皂甙和黃酮等在腸道菌群轉(zhuǎn)化為有活性的生物物質(zhì)，反過來也會(huì)影響腸道菌群的生長(zhǎng)模式[14-16]。本試驗(yàn)中，中藥復(fù)方在熱應(yīng)激發(fā)揮的作用，有可能是復(fù)方中含有黃芩，黃芩苷通過腸道微生物水解成黃芩素，從而在機(jī)體發(fā)揮更重要的生理作用。芳香類藥物的藿香、香薷和陳皮提取揮發(fā)油，其中的藿香揮發(fā)油，可通過抑制細(xì)胞因子TNF-Q(腫瘤壞死因子Q)的合成，減少對(duì)腸道上皮優(yōu)勢(shì)菌群的侵害，從而保護(hù)腸上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)組成與功能，達(dá)到保護(hù)腸屏障功能的作用[17-18]。

本試驗(yàn)中，熱應(yīng)激下腸道微生物的一些優(yōu)勢(shì)菌屬發(fā)生了變化，乳酸菌屬極顯著減少，梭菌屬增加，中藥組的擬桿菌屬和益生素組的乳酸菌屬顯著升高，說明中藥與益生素的治療在熱應(yīng)激階段對(duì)腸道優(yōu)勢(shì)菌屬有一定的積極作用。腸道細(xì)菌可以合成參加反應(yīng)的激素和神經(jīng)遞質(zhì)，乳酸桿菌能產(chǎn)生乙酰膽堿和γ-氨基丁酸(GABA)，雙歧桿菌能產(chǎn)生γ-氨基丁酸，鏈球菌和腸球菌能產(chǎn)生血清素，大腸桿菌能產(chǎn)生去甲腎上腺素、血清素和多巴胺，芽孢桿菌能產(chǎn)生去甲腎上腺素和多巴胺[20]。有研究指出，大腸桿菌和變形菌門的大量增加是由于生理濃度的去甲腎上腺素的釋放，是應(yīng)激反應(yīng)對(duì)感染的直接影響[21]。益生菌和益生素對(duì)腸道的保護(hù)是通過減少腸道通透性，減少腸道對(duì)內(nèi)毒素的吸收，減少炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。中樞神經(jīng)系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)，特別是應(yīng)激反應(yīng)，可能反過來通過改變細(xì)菌種類和細(xì)菌毒力因子的生長(zhǎng)影響腸道微生物群的組成[22]。腸道細(xì)菌及其分泌物影響腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)的神經(jīng)興奮，調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)和感覺傳入向大腦傳遞信號(hào)[23]。KEGG被認(rèn)為是提供一個(gè)系統(tǒng)分析基因功能的基本平臺(tái)，從組裝基因進(jìn)一步預(yù)測(cè)生化途徑[24]。本試驗(yàn)得出，熱應(yīng)激狀態(tài)下，機(jī)體通過糖代謝、氨基酸代謝和膜轉(zhuǎn)運(yùn)的變化來防御外界應(yīng)激[25]，從而影響全身從血液到腸道相互作用的變化。