徐連秀,狄文慧,吳明達(dá),劉雪瑩,王國慶,胡 江,郝 峰

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院檢驗學(xué)院,吉林 吉林 132013 ； 2. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延邊 133002； 3. 北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 吉林 132013 ； 4. 吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院,吉林 吉林 132013)

鈣激活氯離子通道(Calcium-activated chloride channels，CaCCs)是一種能被Ca2+激活的，可轉(zhuǎn)運人體中含量最高的氯離子通道蛋白，其廣泛表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞、上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞等。研究表明，CaCCs在許多生理活動中扮演著重要角色[1]，如上皮細(xì)胞分泌、平滑肌細(xì)胞收縮、神經(jīng)和心臟興奮性等。2008年3個研究小組發(fā)現(xiàn)陰離子通道1(Anoctamin 1, ANO1)是鈣激活氯離子通道的編碼基因，其與許多疾病的發(fā)生密切相關(guān)[2-4]。ANO1在乳腺癌、前列腺癌和肺癌等多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)[5-7]；ANO1的表達(dá)和活性增加是肺動脈高壓血管收縮和重構(gòu)的重要病理機制[8-9]；ANO1是多種惡性腫瘤、高血壓、哮喘、慢性阻塞性肺病和病毒性腹瀉等疾病的潛在靶點[10-13]。因此，ANO1一直以來都是科學(xué)家們研究的熱點，但是ANO1是否可以直接被Ca2+激活？是通過怎樣的途徑被激活？在激活狀態(tài)下電流是否隨時間推移發(fā)生變化？仍是亟待解決的問題。本試驗成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，并構(gòu)建了ANO1生理特性的模型，結(jié)合電生理技術(shù)驗證，系統(tǒng)性研究ANO1轉(zhuǎn)運陰離子、調(diào)節(jié)劑對ANO1的調(diào)控作用、ANO1電流受Ca2+的調(diào)控作用、ANO1的Run-down現(xiàn)象等生理特性。本試驗結(jié)果不僅可用于ANO1生理特性的研究，也為后續(xù)ANO1調(diào)節(jié)劑篩選、ANO1關(guān)鍵堿基和氨基酸的發(fā)現(xiàn)、ANO1與某些生理活動和病理機制的內(nèi)在聯(lián)系等研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Lipofectamine 2000脂質(zhì)體、博萊霉素(Zeocin)和新霉素(G418)、卡西霉素(Calcimycin)、離子霉素(Ionomycin)、腺苷5′-三磷酸二鈉鹽(Adenosine 5′-triphosphate disodium salt, ATP)、5′-三磷酸鳥苷三鈉(Guanosine 5′-triphosphate trisodium salt, GTP)、碳酰膽堿(Carbamoylcholine chloride, Carbachol)和毒胡蘿卜素(Thapsigargin, TG)，均購自Invitrogen公司；尼氟滅酸(Niflumic acid, NFA)和5-硝基-2-苯酚丙胺苯甲酸鹽[5-nitro-2(3-phenylpropylamino) benzoate, NPPB]，購自Sigma公司；大鼠甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞(Fischer rat thyroid, FRT)由本實驗室保存。

1.2 主要儀器 Fluo star多功能酶標(biāo)儀(德國BMG)，膜片鉗(德國HEKA)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon)，流式細(xì)胞儀(美國BD)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞模型的構(gòu)建

1.3.1.1 最適抗生素濃度的選擇 將狀態(tài)較好FRT鋪到96孔板中，16 h后細(xì)胞密度達(dá)到70%～90%，分別加入濃度為1 000、800、600、400、200 μg/L和100 μg/L的Zeocin，2周后細(xì)胞全部死亡的濃度即為Zeocin抗生素篩選的最適濃度。G418應(yīng)用相同的方法選擇最適濃度。

1.3.1.2 構(gòu)建共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的細(xì)胞株 按照Lipofectamine 2000說明書的步驟將ANO1轉(zhuǎn)入FRT細(xì)胞中，48 h后倒置熒光顯微鏡下觀察，應(yīng)用最適濃度的Zeocin抗生素篩選，倒置熒光顯微鏡下挑取細(xì)胞膜上可見綠色熒光的細(xì)胞，2次傳代培養(yǎng)后仍可表達(dá)則為穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株。將YFP-H148Q/I152L轉(zhuǎn)入已表達(dá)ANO1的FRT細(xì)胞中，應(yīng)用最適濃度G418抗生素篩選，挑取倒置熒光顯微鏡下細(xì)胞膜和胞漿均可見綠色熒光的FRT細(xì)胞克隆，具體步驟同上，獲得共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞株。

1.3.1.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞模型純度 將FRT細(xì)胞、FRT-ANO1細(xì)胞和FRT-ANO1-YFP-H148Q/I152L細(xì)胞分別消化，用PBS重懸，圈取細(xì)胞群設(shè)門P1，分別上樣10 000個細(xì)胞，選擇FL2通道，激發(fā)光波長488 nm，發(fā)射光波長575 nm。

1.3.2 熒光淬滅動力學(xué)試驗鑒定細(xì)胞模型的有效性 將試驗分為試驗組與對照組，鈣鎂PBS洗3遍，加入50 μL鈣鎂PBS，試驗組(共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞)：酶標(biāo)儀加入120 μL含激活劑的碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態(tài)變化；對照組1(共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞)：酶標(biāo)儀加入120 μL碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態(tài)變化；對照組2(僅表達(dá)YFP-H148Q/I152L的FRT細(xì)胞)：具體步驟與試驗組相同。酶標(biāo)儀具體設(shè)置如下：發(fā)射光波長540 nm，激發(fā)光波長500 nm。速度為每秒檢測5個點，動態(tài)檢測相對熒光強度，其中前2 s為基線，2 s后以280 μL/s的速度向目標(biāo)孔中加入碘化鈉PBS 120 μL。

1.3.3 ANO1轉(zhuǎn)運陰離子的特性 選取狀態(tài)較好的細(xì)胞，酶標(biāo)儀加入120 μL含激活劑的碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態(tài)變化。

1.3.4 不同調(diào)節(jié)劑對ANO1的調(diào)控作用 向狀態(tài)良好的細(xì)胞中加入不同濃度的Ionomycin、Calcimycin、GTP、ATP、Carbachol、TG激活劑及NFA和NPPB抑制劑，加入120 μL碘化鈉PBS，記錄相對熒光強度動態(tài)變化。應(yīng)用Fluo-4法，檢測加入激活劑前及加入激活劑后的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度。

1.3.5 應(yīng)用膜片鉗檢測Run-down現(xiàn)象 應(yīng)用內(nèi)面外向式(Inside-out)膜片鉗技術(shù)，將FRT細(xì)胞消化傳代到小玻片上，電極入水前給予正壓，入水時電極電阻3～5 MΩ，給負(fù)壓形成6 GΩ以上高阻封接，形成Inside-out記錄模式。鉗制電壓為-50 mV。在分別給予含0、0.6 μmol/L和1 μmol/L Ca2+溶液，檢測對ANO1的電流作用。全細(xì)胞(Whole-cell)膜片鉗技術(shù)，將狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)染ANO1的FRT細(xì)胞接種到玻片上，電極入水后電阻為4～6 MΩ，給予負(fù)壓形成GΩ高阻抗封接后，快速給予負(fù)壓使電極尖端的細(xì)胞膜破裂，形成Whole-cell記錄模式。初始鉗制電壓為0 mV，記錄10 ms后，給予階梯式電壓刺激，電壓從-80 mV到+80 mV，每增加20 mV，各記錄800 ms，800 ms后電壓變?yōu)? mV，繼續(xù)記錄100 ms。參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行電極液配制。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 ANO1對I-的轉(zhuǎn)運速度用相對熒光強度數(shù)值與時間變化曲線反映，相對熒光強度變化的初始速度乘以熒光強度的變化與I-轉(zhuǎn)運速度的常數(shù)0.002，即為ANO1對I-的轉(zhuǎn)運速度[15]。以SPSS 22.0軟件分析，組間比較用單因素方差分析和Student-Newman-Keuls檢驗。以P<0.05為差異顯著，P>0.05為差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 ANO1細(xì)胞模型 倒置熒光顯微鏡下觀察到ANO1表達(dá)在FRT細(xì)胞的細(xì)胞膜，YFP-H148Q/I152L表達(dá)在FRT細(xì)胞的胞漿(圖1)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，ANO1穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率大于90%(圖2B)，ANO1-YFP-H148Q/I152L共轉(zhuǎn)細(xì)胞系純度大于80%(圖2C)。以上結(jié)果說明共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

圖1 ANO1細(xì)胞模型Fig.1 Cell model of ANO1A：ANO1表達(dá)在FRT細(xì)胞的細(xì)胞膜； B：YFP-H148Q/I152L表達(dá)在FRT細(xì)胞的胞漿A: ANO1 expression on FRT cell membrane; B: YFP-H148Q/I152L expression on FRT cell cytoplasm

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞模型的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Detection of stable transfection efficiency of cell model by flow cytometryA：未經(jīng)轉(zhuǎn)染的FRT細(xì)胞系； B：穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ANO1的FRT細(xì)胞系； C：共表達(dá)ANO1和YFP-H148Q/I152L FRT細(xì)胞系A(chǔ): Untransfected FRT cell line; B: FRT cell line stably transfected with ANO1; C: Co-expressing ANO1 and YFP-H148Q/I152L FRT cell line

2.2 熒光淬滅動力學(xué)試驗鑒定細(xì)胞模型的有效性 結(jié)果顯示：試驗組加入含激活劑的碘化鈉PBS后，相對熒光強度顯著下降，提示ANO1蛋白通道開放，I-內(nèi)流(圖3A)；對照組1中加入碘化鈉PBS后，檢測到相對熒光強度無顯著變化，提示ANO1蛋白通道不開放(圖3B)；對照組2中加入含激活劑的碘化鈉PBS后，相對熒光強度不發(fā)生變化，提示FRT細(xì)胞自身無ANO1蛋白的表達(dá)(圖3C)。試驗組碘離子轉(zhuǎn)運速度為(0.10±0.01)d[I]/dt mM/s，對照組(0.01±0.001)d[I]/dt mM/s，試驗組碘離子轉(zhuǎn)運速度顯著高于對照組，具有顯著性差異(P<0.05)。上述結(jié)果表明，本試驗成功獲得了可用于研究ANO1生理特性的細(xì)胞模型。

圖3 熒光淬滅動力學(xué)試驗鑒定細(xì)胞模型的有效性Fig.3 Result of fluorescence quenching kinetics A:試驗組； B:對照組1； C:對照組2A: Experimental group; B: Control group 1; C: Control group 2

2.3 ANO1蛋白轉(zhuǎn)運陰離子的特性 加入含有激活劑的碘化鈉PBS后，熒光信號顯著下降，提示ANO1蛋白通道開放，I-內(nèi)流(圖3A)。表明ANO1蛋白具有轉(zhuǎn)運陰離子的特性。

2.4 調(diào)節(jié)劑對ANO1蛋白的調(diào)控作用 加入Ionomycin、Calcimycin、GTP、ATP、Carbachol后，結(jié)果提示，激活劑對ANO1通道的開放起調(diào)控作用且呈劑量依賴關(guān)系，其半數(shù)最大活化作用的化合物濃度(Compound concentration of half-maximal activating efect, EC50)分別為7.52、12.75、69.94、145.60 μmol/L和490.60 μmol/L，F(xiàn)luo-4檢測到Ca2+濃度迅速升高。加入TG熒光強度不發(fā)生變化(圖4A)，F(xiàn)luo-4檢測到Ca2+濃度緩慢升高。加入抑制劑后，結(jié)果提示，抑制劑對ANO1的開放有抑制作用且呈劑量依賴關(guān)系，其半數(shù)最大抑制作用的化合物濃度(Compound concentration of half-maximal inhibitory efect, IC50)分別為35.75 μmol/L和102.40 μmol/L(圖4B)。表明ANO1調(diào)節(jié)劑對ANO1有調(diào)控作用且呈劑量依賴關(guān)系，迅速升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度可以激活A(yù)NO1蛋白通道，緩慢升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度不能激活A(yù)NO1蛋白通道。

2.5 膜片鉗檢測Run-down 應(yīng)用Inside-out膜片鉗技術(shù)記錄到，在加入Ca2+溶液時有明顯的電流變化，加入無Ca2+溶液時無電流，加入1 μmol/L Ca2+溶液后，記錄到電流隨時間推移逐漸減小，出現(xiàn)明顯的Run-down現(xiàn)象，加入0.6 μmol/L Ca2+溶液時記錄到的電流明顯弱于加入1 μmol/L Ca2+時的電流，且記錄到的電流較穩(wěn)定，不出現(xiàn)Run-down現(xiàn)象(圖5B1)。應(yīng)用Whole-cell膜片鉗技術(shù)記錄到，初始電壓0 mV時和1 μmol/L游離Ca2+存在時，電流為0 mV，但隨著電壓的增加電流逐漸增大，即電流與電壓和時間呈正相關(guān)(圖5B1)。1 min后在相同的電壓條件下記錄到的電流明顯減小(圖5B2)，對圖5B1和圖5B2進(jìn)行整理和分析得出電流與電壓的關(guān)系圖(I/V曲線圖)，曲線呈明顯的外向整流特性(圖5B3)。表明ANO1具有Run-down現(xiàn)象、時間、電壓和 Ca2+依賴性以及外向整流特性。ANO1是鈣依賴的氯離子通道，有Ca2+可以激活，無Ca2+則不激活，并且Ca2+可直接作用于ANO1。證實本試驗記錄的ANO1電流屬于經(jīng)典的鈣激活氯離子電流，ANO1具有經(jīng)典的鈣激活氯離子通道的生理特性。

圖4 ANO1激活劑及抑制劑的劑量依賴曲線Fig.4 Dose-dependent curve of ANO1 activator and inhibitorA：ANO1激活劑的劑量依賴曲線； B：ANO1抑制劑的劑量依賴曲線A: Dose-dependent curve of ANO1 activator; B: Dose-dependent curve of ANO1 inhibitor

圖5 膜片鉗記錄ANO1電流Fig.5 Patch clamp recorded ANO1 currentA：應(yīng)用Inside-out膜片鉗技術(shù)記錄1 μmol/L和0.6 μmol/L Ca2+激活A(yù)NO1電流； B：應(yīng)用Whole-cell膜片鉗 技術(shù)記錄1 μmol/L Ca2+激活A(yù)NO1的電流； B1：記錄初始時間的電流； B2：記錄1 min后的電流； B3：電流-電壓關(guān)系，曲線顯示典型的外向整流特征； B4：未轉(zhuǎn)染ANO1的FRT細(xì)胞電流記錄A: Application of inside-out patch clamp technology to record 1 μmol/L and 0.6 μmol/L Ca2+ activated ANO1 current; B: Applying the whole-cell patch clamp technology to record 0.6 μmol/L Ca2+ activated ANO1 current; B1: Recorded the current at the initial time; B2: Recorded the current after one minutes; B3: Current-voltage relationship, the curve showed typical outward rectification characteristics; B4: FRT cell current recording of ANO1 not transfected

3 討論

20世紀(jì)80年代，Barish于非洲爪蟾卵母細(xì)胞上首次記錄到鈣激活氯離子通道電流[16]，自此研究者開始對鈣激活氯離子通道進(jìn)行探索。研究發(fā)現(xiàn)，ANO1是鈣激活氯離子通道的編碼基因，在跨上皮液體轉(zhuǎn)運和平滑肌細(xì)胞收縮等生理活動中發(fā)揮著重要作用[1]；其在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的作用[5-7]，并且與高血壓[8-9]、囊性纖維化[10]等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)；研究驗證，抑制小腸上皮細(xì)胞中ANO1的表達(dá)能有效的減輕腹瀉[17]。ANO1在多種疾病中扮演著重要角色，因此，ANO1生理特性的研究是探索ANO1與其相關(guān)疾病關(guān)系必不可少的過程，在后續(xù)ANO1相關(guān)研究中發(fā)揮著重要作用。

本試驗驗證了ANO1與細(xì)胞內(nèi)的Ca2+之間的調(diào)控關(guān)系，應(yīng)用Whole-cell膜片鉗技術(shù)檢測到，加入高濃度Ca2+時，電流隨電壓增大而增大，具有經(jīng)典的外向整流的特性，隨著時間的推移電信號明顯減弱，證明ANO1存在著Run-down現(xiàn)象。為了確保試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，進(jìn)一步應(yīng)用Inside-out膜片鉗技術(shù)進(jìn)行驗證，使通道脫離細(xì)胞環(huán)境，持續(xù)加入高濃度Ca2+，記錄到明顯Run-down現(xiàn)象，而當(dāng)加入低濃度的Ca2+時，未記錄到Run-down現(xiàn)象。結(jié)果表明，ANO1中存在著Run-down現(xiàn)象且只有在高Ca2+時出現(xiàn)，低Ca2+時不出現(xiàn)。本試驗認(rèn)為，Ca2+可直接作用于ANO1使其激活，Inside-out結(jié)果表明通道脫離細(xì)胞環(huán)境時仍記錄到電流變化，且無Ca2+條件下無電流變化，此結(jié)果表明，ANO1是鈣依賴的氯離子通道，在有Ca2+條件下可以被激活，無Ca2+不激活且Ca2+是直接作用于ANO1。而其是否還受到其他途徑的調(diào)控還有待研究。本試驗結(jié)果還表明，在0.6 μmol/L Ca2+存在下檢測到的結(jié)果較準(zhǔn)確，記錄的電流較穩(wěn)定，不隨時間變化，而在1 μmol/L Ca2+存在下，記錄到的電流隨時間推移逐漸減小即Run-down現(xiàn)象，基于此項結(jié)果，本試驗認(rèn)為關(guān)于Ca2+激活的氯離子通道的相關(guān)研究應(yīng)在低濃度Ca2+條件下進(jìn)行，為后續(xù)Ca2+激活氯離子通道的相關(guān)研究提供了適宜Ca2+激活濃度。因此，本試驗成功構(gòu)建了可用于研究的細(xì)胞模型，其具有操作簡單，經(jīng)濟(jì)適用，特異性強，靈敏度高等優(yōu)點。同時，為后續(xù)進(jìn)行通道調(diào)節(jié)劑的篩選提供了更簡單、高效的篩選方法，以及進(jìn)行高通量篩選等試驗打下了良好的基礎(chǔ)。

綜上，ANO1展示了經(jīng)典的鈣激活氯離子通道特性。本試驗構(gòu)建的細(xì)胞模型不僅可以應(yīng)用于其生理特性的研究，也可用于小分子藥物的篩選，內(nèi)環(huán)境調(diào)節(jié)等的研究，是醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域必不可少的研究過程。還為后續(xù)其他陰離子通道的研究及ANO1與某些生理活動和病理機制的內(nèi)在聯(lián)系等研究提供了科學(xué)依據(jù)。