戴瑜來,戴楊鑫,許寶青,林啟存,馬恒甲,蔡麗娟

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024)

維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)是一種人—獸—魚共患的條件致病菌[1]，該菌可感染草魚[2]、鯽[3]、泥鰍[4]、青蝦[5]、中華絨螯蟹[6]、中華條頸龜[7]、達(dá)氏鱘[8]、虹鱒[9]、大黃魚[10]等多種水生動(dòng)物，引發(fā)的疾病發(fā)病快、死亡率高，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究人員發(fā)現(xiàn)，維氏氣單胞菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類(氨芐西林鈉、苯唑西林)、大環(huán)內(nèi)酯類(硫氰酸紅霉素、乙酰螺旋霉素)、喹諾酮類(恩諾沙星)、氨基糖苷類(硫酸新霉素、卡那霉素)、四環(huán)素類(四環(huán)素、強(qiáng)力霉素)、磺胺類(磺胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、磺胺甲噁唑)、氯霉素類(甲砜霉素、氟苯尼考)等抗菌藥均產(chǎn)生了一定的耐藥性[11-15]，且極可能會(huì)隨著抗菌藥的繼續(xù)濫用而在水生動(dòng)物臨床上更加快速且廣泛地傳播。同時(shí)，抗菌藥的廣譜性會(huì)破壞水體環(huán)境及養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中正常微生物群系的平衡，影響?zhàn)B殖魚類的生長(zhǎng)發(fā)育，進(jìn)而造成水產(chǎn)養(yǎng)殖效率低下。因此，尋找安全、高效、環(huán)保的生物抑菌劑具有重要意義。噬菌體(Baceriophage)是一類能夠感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋菌等微生物的病毒總稱，它具有裂解宿主專一性強(qiáng)、研發(fā)時(shí)間短，不影響正常菌群，對(duì)人和動(dòng)物安全，耐藥風(fēng)險(xiǎn)低且無環(huán)境污染等優(yōu)點(diǎn)，其在細(xì)菌病防控領(lǐng)域的應(yīng)用研究呈逐年上升趨勢(shì)[16]。目前，已報(bào)道用于水生動(dòng)物細(xì)菌病防控的噬菌體研究數(shù)量有限，為了豐富水產(chǎn)致病菌的噬菌體庫，篩選具有潛在應(yīng)用價(jià)值的菌株，本試驗(yàn)以維氏氣單胞菌為宿主菌，分離篩選烈性噬菌體，研究其生物學(xué)特性，旨在為進(jìn)一步探索噬菌體防控技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 維氏氣單胞菌(XJJYCA01)分離自發(fā)病鯽魚，LB斜面保存于4 ℃。

1.2 試劑與儀器 試劑耗材：LB培養(yǎng)基、SM液、接種環(huán)、5 mL注射器、0.22 μm過濾頭、一次性培養(yǎng)皿等，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。儀器：UV-2600紫外分光光度計(jì)、離心機(jī)(Eppendorf Centrifuge 5427R和Hermle Z323K)、HS-2恒溫水浴鍋、Hitachi H-7650型電子顯微鏡、JJ-Y系列電子天平、生化培養(yǎng)箱等。

1.3 噬菌體分離與純化 參照王志麗[17]的雙層平板法進(jìn)行維氏氣單胞菌的富集、篩選、純化，略作修改。步驟如下：(1)無菌操作解剖，取發(fā)病鯽魚腸道置于滅菌培養(yǎng)皿中，用生理鹽水洗脫腸道內(nèi)容物，4 000 r/min離心10 min后過0.22 μm濾頭備用；(2)挑取維氏氣單胞菌(XJJYCA01)單菌落接種到含有5 mL LB液體培養(yǎng)基的試管中，28 ℃ 120 r/min搖床上過夜培養(yǎng)；翌日，將其轉(zhuǎn)到含25～30 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28 ℃ 120 r/min震蕩培養(yǎng)3 h，使其達(dá)到對(duì)數(shù)期(OD值0.4～0.6)，然后向菌液中加入5 mL病魚腸道洗脫液，再28 ℃振蕩培養(yǎng)48 h。之后將混合液以12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至另一無菌螺旋離心管后備用；(3)取100 μL分離液與200 μL對(duì)數(shù)期的宿主菌混合，放置5～15 min后加到融化并冷卻至45 ℃的半固體培養(yǎng)基中，混勻立即倒入底層瓊脂平板上，鋪勻，28 ℃ 倒置培養(yǎng)24 h。翌日觀察噬菌斑的生成情況；(4)用滅菌牙簽挑取單個(gè)噬菌斑，接到5 mL液體培養(yǎng)基中富集10 min，然后向其中加入200 μL宿主菌菌液，28 ℃培養(yǎng)2～3 h至液體澄清后，12 000 r/min離心取上清，即得到高效價(jià)的噬菌體。

1.4 噬菌體效價(jià)的測(cè)定 采用噬斑法測(cè)定噬菌體效價(jià)。吸取100 μL純化的噬菌體液進(jìn)行10倍稀釋，將稀釋的噬菌體液分別與200 μL的XJJYCA01混合，利用雙層平板法觀察噬菌斑的個(gè)數(shù)。效價(jià)(PFU/mL)=噬菌斑數(shù)×10×稀釋倍數(shù)。

1.5 噬菌體的電鏡觀察 參照Ramíre-orozco等[18]的方法，采用磷鎢酸負(fù)染法，用Hitachi H-7650型電子顯微鏡進(jìn)行電鏡觀察。

1.6 噬菌體最適感染復(fù)數(shù)(MOI)測(cè)定 培養(yǎng)XJJYCA01至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600≈0.5，約為1×108CFU/mL)，按照不同的感染復(fù)數(shù)(1 000，100，10，1，0.1，0.01，0.001)各取0.2 mL混合，并加入1.6 mL的LB液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)4 h。經(jīng)培養(yǎng)后，9 000 r/min離心10 min，0.22 μm過濾。收集上清，測(cè)定噬菌體效價(jià)，以產(chǎn)生最高噬菌體效價(jià)的MOI為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.7 一步生長(zhǎng)曲線 參照柏琴琴[19]并略作修改。具體操作如下：將XJJYCA01培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將噬菌體SJTJYCA01效價(jià)濃度稀釋到1×108PFU/mL。1 mL噬菌體稀釋液和10 mL宿主菌細(xì)菌懸液混合于錐形瓶P1中，混合10 min后，取0.1 mL加入到含有10 mL LB培養(yǎng)液的錐形瓶P2中，混合均勻，再從錐形瓶B2中取0.2 mL至含有20 mL液體培養(yǎng)基的P3中，混合均勻后在28 ℃及180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。從0開始每隔一段時(shí)間取樣。所取樣品經(jīng)9 000 r/min離心2 min，取上清液用雙層平板法測(cè)定過濾液中噬菌體的效價(jià)。以取樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制一步生長(zhǎng)曲線。裂解量=裂解期平均噬菌體數(shù)/潛伏期平均噬菌體數(shù)。

1.8 熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性 將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，分裝到3個(gè)5 mL 離心管中，每管各裝3 mL。將離心管分別放置于40 ℃、60 ℃、80 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔20 min測(cè)定各管中噬菌體的效價(jià)，直至測(cè)到60 min。以SM液為介質(zhì)，用NaOH和HCl調(diào)節(jié)pH(3～11)。將噬菌體SJTJYCA01裂解液稀釋至1×1010PFU/mL，取10 μL加入到990 μL不同pH的SM液中，28 ℃水浴2 h后測(cè)定各離心管中噬菌體的滴度。每個(gè)pH試驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體分離與純化 從發(fā)病鯽魚腸道中獲得的分離液經(jīng)雙平板法后在平板上可見有大量噬菌斑產(chǎn)生，圖1A可見噬菌斑呈圓形，中間透明，邊緣清晰整齊，無暈環(huán)，但大小不一，分布不均勻，直徑在0.2～1.1 mm，噬菌斑的存在說明腸道分離液中有宿主菌的噬菌體存在。噬菌體經(jīng)純化增殖后，梯度稀釋，用雙層平板法計(jì)數(shù)，該噬菌體的效價(jià)可達(dá)3.0×1012PFU/mL，噬菌體命名為SJTJYCA01。

圖1 噬菌體的噬菌斑(A)和超微形態(tài)圖(B)Fig.1 Plaque morphology (A) and TEM image (B) of phage

2.2 噬菌體的超顯微形態(tài) 通過電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)分離的噬菌體為有尾噬菌體，屬于尾病毒目短尾噬菌體科，頭部直徑在45～60 nm，尾部長(zhǎng)在16～26 nm，見圖1B。

2.3 最適感染復(fù)數(shù) 噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的MOI為0.1時(shí)的效價(jià)最高(效價(jià)值達(dá)2.55×109)，說明噬菌體SJTJYCA01和宿主菌XJJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1。見表1。

表1 噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)Table 1 Determination of optimal MOI of SJTJYCA01

2.4 一步生長(zhǎng)曲線 一步生長(zhǎng)曲線的結(jié)果見圖2，噬菌體SJTJYCA01的潛伏期為20 min，裂解期達(dá)40 min，裂解量為裂解期平均噬菌體數(shù)(14 458 PFU/mL)/ 潛伏期平均噬菌體數(shù)(255 PFU/mL)=57。

2.5 熱穩(wěn)定性 在40 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率不隨時(shí)間的增加而減少；在60 ℃條件下，噬菌體SJTJYCA01的存活率大幅下降，作用20 min后存活率僅為原噬菌體的3%；在80 ℃條件下，各個(gè)時(shí)間段均未見有噬菌體存活。見圖3。

圖2 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線Fig.2 One-step growth curve of phage

圖3 噬菌體SJTJYCA01的熱穩(wěn)定性Fig.3 Thermal stability of SJTJYCA01

2.6 pH穩(wěn)定性 噬菌體SJTJYCA01對(duì)強(qiáng)酸強(qiáng)堿均較為敏感，在pH 5～10時(shí)較為穩(wěn)定；噬菌體SJTJYCA01的最適pH 7。見圖4。

圖4 噬菌體SJTJYCA01的pH穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of SJTJYCA01

3 討論

近年來，國內(nèi)外有關(guān)維氏氣單胞菌病例的報(bào)道逐年增多，其流行呈明顯上升趨勢(shì)，并已成為一種危害嚴(yán)重的人—獸—魚共患病原菌[20]。噬菌體作為一種新興的生物抑菌劑日漸受到學(xué)者們的關(guān)注[21]。目前，國內(nèi)外關(guān)于維氏氣單胞菌噬菌體的研究鮮有報(bào)道，僅可見Taruna等[22]從池水中分離到維氏氣單胞菌的噬菌體VTCCBPA5和呂孫建等[23-24]從中華鱉養(yǎng)殖塘中分離得到的非特異性寬譜噬菌體NTHP01(以嗜水氣單胞菌為宿主分離獲得)。

本試驗(yàn)以鯽魚源維氏氣單胞菌為宿主菌，從發(fā)病鯽魚的腸道中分離獲得噬菌體SJTJYCA01。該噬菌體在宿主菌上可形成圓形、透亮，具有典型烈性噬菌體特征的噬菌斑[25]；參照《病毒分類——國際病毒分類委員會(huì)第九次報(bào)告》，對(duì)噬菌體SJTJYCA01的形態(tài)進(jìn)行觀察分析，結(jié)果可判定該噬菌體為尾病毒目短尾噬菌體科噬菌體(頭徑45～60 nm，尾長(zhǎng)16～26 nm)，此與Taruna等[22]分離獲得的VTCCBPA5同屬于短尾噬菌體科(頭徑56 nm，尾長(zhǎng)5 nm)，卻有別于呂孫建等[24]分離獲得的肌尾噬菌體科噬菌體NTHP01(頭徑60～145 nm，尾長(zhǎng)80～455 nm)。因此，這是鯽魚源維氏氣單胞菌短尾科烈性噬菌體在中國的首次報(bào)道。

感染復(fù)數(shù)是研究噬菌體與宿主之間量化與產(chǎn)出的重要生物學(xué)指標(biāo)，在不同感染復(fù)數(shù)條件下，噬菌體感染宿主菌后分裂得到的噬菌體子代的數(shù)量不同，因此，確定最適感染復(fù)數(shù)對(duì)于噬菌體進(jìn)一步的應(yīng)用研究具有重要作用。本試驗(yàn)獲得噬菌體SJTJYCA01的最適感染復(fù)數(shù)為0.1，與王志麗[17]分離的鱉源氣單胞菌噬菌體的最適感染復(fù)數(shù)相同，說明該噬菌體裂解效率較高，少量的噬菌體侵染宿主菌即可產(chǎn)生噬菌體子代；噬菌體感染宿主菌的潛伏期和裂解期的長(zhǎng)短及裂解量的大小通常與噬菌體、宿主菌及生長(zhǎng)條件有關(guān)，從潛伏期可得知噬菌體吸附于細(xì)胞并釋放出子代噬菌體的最短時(shí)間，潛伏期和裂解量則是噬菌體增殖的2個(gè)特征性指標(biāo)。噬菌體SJTJYCA01潛伏期和裂解期分別為20 min、40 min， 較噬菌體VTCCBPA5(潛伏期35 min)[22]、泥鰍源氣單胞菌的噬菌體pAh1(潛伏期30 min)[26]和鱉源氣單胞菌的噬菌體(潛伏期50 min)[17]要短，遠(yuǎn)小于噬菌體NTHP01(潛伏期150 min)[23]，且同樣對(duì)宿主菌具有較高的裂解量。

目前，氣單胞菌屬細(xì)菌(包括維氏氣單胞菌)能造成多種水生動(dòng)物發(fā)生運(yùn)動(dòng)性氣單胞菌敗血癥[27]，該病在浙江、湖南、湖北、江西等地的發(fā)病高峰期為每年的6～9月(養(yǎng)殖水溫在20～30 ℃，pH一般呈弱堿或弱酸性)，常常出現(xiàn)急性暴發(fā)病，嚴(yán)重時(shí)的死亡率可達(dá)90%以上。本試驗(yàn)分離獲得的噬菌體SJTJYCA01在溫度低于40 ℃時(shí)能保持較好的穩(wěn)定性和活性，并在pH 7附近最為穩(wěn)定。因此，噬菌體SJTJYCA01能很好的適應(yīng)水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境，在水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病防控中應(yīng)用具有極大的可能性。本試驗(yàn)篩選獲得的維氏氣單胞菌烈性噬菌體，不僅豐富了水產(chǎn)致病菌噬菌體的菌種資源，并將為噬菌體作為生物抑菌劑的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。