史丹丹， 賀細菊， 盧 敏， 劉幸卉， 王漢琴

1湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，十堰 442000 2湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬隨州醫(yī)院(隨州市中心醫(yī)院)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心，隨州 441300

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)是引起特發(fā)性炎性肌病骨骼肌功能障礙的一種非免疫介導(dǎo)機制[1]。其是真核細胞一種保護性應(yīng)激，通過激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)以減少胞內(nèi)蛋白異常聚集，從而保護細胞。而長期、嚴(yán)重的ERS則會誘導(dǎo)細胞凋亡或死亡[2]。ERS屬于一種骨骼肌的適應(yīng)性反應(yīng)，其誘發(fā)的UPR信號通路在決定肌細胞命運上起關(guān)鍵作用[3]。但骨骼肌持續(xù)而嚴(yán)重的ERS則可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性凋亡途徑或自噬溶酶體途徑，引起蛋白合成代謝障礙，并直接影響肌肉含量[4-7]。

肌炎患者肌細胞高表達MHC-Ⅰ分子，而高表達的MHC-Ⅰ分子可引起肌纖維內(nèi)部持續(xù)的UPR[6]，持續(xù)的UPR可能引起肌組織免疫耐受的缺失，但參與調(diào)節(jié)這種免疫耐受缺失的機制尚不明確。UPR將導(dǎo)致Ca2+代謝異常[7-8]，Ca2+作為骨骼肌細胞興奮-轉(zhuǎn)錄偶聯(lián)的關(guān)鍵分子[9]，即Ca2+-鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)依賴性信號傳導(dǎo)(例如，通過CaM依賴性磷酸酶、鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、CaM依賴性激酶CaMKⅡ、CaMKⅣ等)可調(diào)節(jié)肌肉中活性基因表達，其代謝異常將觸發(fā)一系列生化反應(yīng)，影響細胞的生存和代謝[10]。那么，骨骼肌Ca2+/CaM信號是否參與UPR引起的自身免疫耐受的缺失？內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為肌細胞內(nèi)重要的細胞器，是肌纖維Ca2+儲存和蛋白質(zhì)合成、折疊、組裝的主要場所。多種生理和病理條件下，其代謝紊亂、失衡會直接導(dǎo)致ERS的發(fā)生[7，11]。但是，目前Ca2+/CaM信號通路與骨骼肌損傷ERS相關(guān)性自噬的關(guān)系尚缺乏研究。我們推測，肌損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活躍，鈣調(diào)蛋白可能介導(dǎo)ERS引起細胞自噬而調(diào)節(jié)肌修復(fù)。為此，本研究利用心毒素(CTX)肌肉注射誘導(dǎo)急性小鼠肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，并以衣霉素(tunicamycin，TM)化學(xué)誘導(dǎo)C2C12細胞分化的肌管ERS，然后采用CaM激動劑/拮抗劑，人為激活/抑制CaM信號，檢測損傷后ERS-UPR反應(yīng)關(guān)鍵通路分子、ERS相關(guān)性自噬關(guān)鍵分子的表達，以期闡明Ca2+/CaM信號對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細胞自噬的影響及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及樣品準(zhǔn)備

選取6～8周清潔級C57BL/6(B6)小鼠，購自湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心。分別采用3種方式建模：①單側(cè)脛骨前肌注射CTX 50 μL(50 μg/mL，Sigma公司)制備野生小鼠肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，未注射一側(cè)作為對照；②采用TM[Cell Signaling Technology(CST)公司]腹腔注射1 mg/kg(5 mg/mL)制備小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型；③采用CTX肌肉注射配合TM腹腔注射制備野生小鼠肌損傷模型。小鼠分別在損傷后第0、4、7天處死。摘取小鼠脛骨前肌，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，肌組織橫向切片(4 μm)，蘇木精-伊紅染色，觀察比較肌組織內(nèi)炎性細胞滲出、肌纖維再生情況。另使用CTX制備野生小鼠肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型，并于損傷后第2、5天，即取材前48 h腹腔注射CALP1(100 μL，50 μg/mL，TOCRIS公司)或R24571(150 μL，25 μg/mL，Santa Cruz公司)干預(yù)肌組織CaM活性，人為激活/抑制CaM信號。所有實驗內(nèi)容均獲得湖北醫(yī)藥學(xué)院動物倫理委員會批準(zhǔn)。收集損傷脛骨前肌，用于RNA和蛋白分析。

1.2 CaM化學(xué)干擾分化肌管

C2C12細胞(CRL-1772，ATCC公司)常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細胞生長于接近70%～80%匯合后，改用分化培養(yǎng)液(含2%馬血清)誘導(dǎo)72 h，將細胞分化為多核肌管。之后，TM(1 μg/mL)刺激誘導(dǎo)肌管內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，添加R24571(1.5 μmol/L)或CALP1(10 μmol/L)以調(diào)節(jié)培養(yǎng)體系中CaM活性，刺激24 h后收集細胞，分別提取RNA和蛋白，待用。

1.3 qRT-PCR檢測損傷肌UPR信號通路相關(guān)分子mRNA表達

分別于0、4、7 d摘取小鼠脛骨前肌，收集CaM化學(xué)干擾分化肌管后的細胞，檢測肌損傷后肌組織內(nèi)及應(yīng)用化學(xué)干擾CaM后損傷肌管細胞內(nèi)UPR信號通路相關(guān)分子的mRNA表達。Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)法提取肌組織或細胞總RNA，使用cDNA合成試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)逆轉(zhuǎn)錄。實時熒光定量PCR使用特定引物，SYBR熒光染料/ROX標(biāo)記的qPCR混合液試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司)，BIO-RAD CFX96 touch熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)，根據(jù)說明書配制PCR反應(yīng)液，采用兩步法PCR擴增標(biāo)準(zhǔn)程序。檢測各組肌組織UPR信號通路相關(guān)分子(BiP、XBP1-S和ATF6)的mRNA表達情況(引物序列見表1)，用GAPDH作為內(nèi)參對照。結(jié)果用Bio-Rad CFX Manager Software v3.1(Bio-Rad公司)軟件分析。引物序列根據(jù)GenBank上小鼠堿基序列，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。采用2-ΔΔCt法確定特定熒光域值對應(yīng)循環(huán)數(shù)的Ct值，對每個目標(biāo)進行基因定量。實驗重復(fù)至少3次，取平均值。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.4 Western blot檢測UPR-自噬通路關(guān)鍵分子表達

全蛋白提取采用蛋白提取試劑盒(南京凱基生物公司)，以BCA測定試劑盒(南京凱基生物公司)測定蛋白質(zhì)含量后分裝。蛋白提取物煮沸3～5 min，經(jīng)6%～12%SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)膜，用TBST配制含5%脫脂奶粉的封閉液分別稀釋抗GAPDH抗體(1∶4000，杭州弗德生物公司)、抗eIF2α抗體(1∶1000，CST公司)、抗p-eIF2α抗體(1∶1000，CST公司)、抗IRE1α抗體(1∶1000，CST公司)、抗p-IRE1α抗體(1∶1000，CST公司)、抗ATF6抗體(1∶1000，CST公司)、抗LC3Ⅱ/Ⅰ抗體(1∶1000，CST公司)，一抗4 ℃孵育過夜，次日TBST洗膜，用相應(yīng)辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗(杭州弗德生物公司)室溫孵育1.5 h，最后以ECL發(fā)光法檢測蛋白表達情況，用Image J軟件進行分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 急性損傷肌組織HE染色觀察肌組織損傷情況

構(gòu)建易于觀察、可控制、可復(fù)制的動物損傷模型是研究骨骼肌損傷的首要環(huán)節(jié)[12]。本研究最初選用3種不同方法構(gòu)建了肌損傷小鼠模型，通過HE染色結(jié)果，可以觀察到與對照組(control組)比較，單純脛骨前肌注射心毒素(CTX組)和CTX肌內(nèi)注射聯(lián)合衣霉素(CTX+TM組)腹腔注射小鼠均于損傷后4 d出現(xiàn)脛骨前肌肌纖維壞死和潰變，且伴大量炎性細胞浸潤；損傷肌纖維逐漸被中央核的再生肌纖維替代，且在損傷后7 d肌纖維再生顯著，炎性細胞滲出明顯減少(圖1)。與其他兩組不同，衣霉素腹腔注射(TM組)小鼠則表現(xiàn)為炎性滲出與再生均不明顯。與正常對照組比較，TM組則可見肌細胞間隙增大，偶有炎性細胞滲出(圖1)。這說明單純CTX注射和CTX聯(lián)合TM注射均可引起典型的肌肉損傷。

圖1 3種小鼠肌損傷模型蘇木精-伊紅染色結(jié)果(標(biāo)尺=50 μm)Fig.1 HE staining for three mouse models of muscle injury(scale bar=50 μm)

2.2 qRT-PCR檢測損傷肌UPR關(guān)鍵分子mRNA水平

為了確認UPR在肌組織損傷再生修復(fù)過程中是否被激活，采用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測肌損傷后4、7 d各組脛骨前肌UPR關(guān)鍵分子Bip、ATF6和XBP1-S mRNA水平。結(jié)果顯示：與control組相比，損傷后4 d，CTX組和CTX聯(lián)合TM注射組Bip、ATF6和XBP1-S mRNA水平均顯著上調(diào)；CTX組UPR關(guān)鍵分子mRNA水平隨再生修復(fù)過程而逐漸下降；而TM組Bip和ATF6 mRNA水平則隨損傷修復(fù)而逐漸升高(圖2)。

1：control；2：CTX d4；3：TM d4；4：CTX+TM d4；5：CTX d7；6：TM d7；7：CTX+TM d7；A：Bip mRNA水平；B：ATF6 mRNA水平；C：XBP1-S mRNA水平；與control組比較，*P<0.05圖2 損傷后各組肌組織UPR信號通路相關(guān)分子mRNA水平Fig.2 The mRNA levels of UPR pathway related molecules in muscle tissues after injury

2.3 CaM對肌損傷后肌內(nèi)UPR標(biāo)志物mRNA表達水平的影響

為了探究Ca2+/CaM信號是否參與肌損傷后UPR標(biāo)志物表達，我們選用CTX誘導(dǎo)肌損傷模型，取材前48 h腹腔注射CaM激動劑CALP1或抑制劑R24571干預(yù)肌組織CaM活性水平，人為激活/抑制Ca2+/CaM信號通路，qRT-PCR檢測肌損傷后4、7 d各組脛骨前肌UPR關(guān)鍵分子mRNA水平。結(jié)果顯示(圖3)：與control組比較，CTX誘導(dǎo)肌損傷后4 d，Bip、ATF6和XBP1-S mRNA水平顯著上調(diào)(均P<0.05)；損傷后7 d轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，除XBP1-S與control組無差異外，Bip和ATF6轉(zhuǎn)錄水平仍顯著高于control組(P<0.05)。與CTX組比較，不論肌損傷后4 d還是7 d，CALP1處理均可上調(diào)損傷肌內(nèi)UPR標(biāo)志物mRNA水平，R24571均可降低損傷肌內(nèi)UPR標(biāo)志物mRNA水平(P<0.05)。這提示Ca2+/CaM信號可能參與了肌損傷后UPR標(biāo)志物的表達。

1：control；2：CTX d4；3：CTX+CALP1 d4；4：CTX+R24571 d4；5：CTX d7；6：CTX+CALP1 d7；7：CTX+R24571 d7；A：Bip mRNA水平；B：ATF6 mRNA水平；C：XBP1-S mRNA水平；與control組比較，*P<0.05；與同時點CTX組比較，#P<0.05圖3 CaM干擾影響損傷肌組織內(nèi)UPR標(biāo)志分子mRNA表達Fig.3 CaM interference affects the mRNA expression of UPR marker molecules in injured muscle

2.4 CaM對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌管內(nèi)UPR信號相關(guān)分子mRNA表達水平的影響

為了進一步分析Ca2+/CaM信號對肌細胞本身內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下活化的UPR信號的影響，在TM刺激分化的肌管中，我們采用CaM激動劑CALP1或抑制劑R24571人為激活/抑制Ca2+/CaM信號，qRT-PCR檢測各組肌管內(nèi)UPR關(guān)鍵分子mRNA水平。結(jié)果表明(圖4)：與馬血清(horse serum，HS)誘導(dǎo)分化的肌管比較，TM誘導(dǎo)ERS后，UPR標(biāo)志分子Bip、ATF6和XBP1-S的mRNA水平顯著上調(diào)；與TM組比較，CALP1處理均可上調(diào)ERS肌管UPR標(biāo)志物mRNA水平，R24571則可下調(diào)其mRNA水平。這些結(jié)果提示：Ca2+/CaM信號參與了肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后UPR信號相關(guān)分子表達的調(diào)整。

1：HS；2：TM；3：TM+CALP1；4：TM+R24571；A：各組肌細胞形態(tài)(×40)；qRT-PCR檢測各組肌管內(nèi)UPR關(guān)鍵分子Bip(B)、ATF6(C)和XBP1-S(D)mRNA水平；與HS組比較，*P<0.05；與TM組比較，#P<0.05圖4 CaM干擾影響TM刺激分化肌管中UPR信號相關(guān)分子mRNA表達Fig.4 CaM interference affects the mRNA expression of UPR pathway related molecules in differentiated myotubes stimulated by TM

2.5 CaM對損傷肌UPR-自噬通路關(guān)鍵分子表達的影響

為探究Ca2+/CaM信號是否介導(dǎo)損傷肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)自噬，采用CTX誘導(dǎo)B6小鼠肌損傷，于取材前48 h腹腔注射CaM激動劑CALP1或抑制劑R24571人為激活/抑制Ca2+/CaM信號，Western blot檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR-自噬通路關(guān)鍵分子eIF2α、IRE1α和ATF6的表達情況。結(jié)果顯示(圖5)：與對照組比較，肌損傷4 d后，UPR-自噬通路關(guān)鍵分子eIF2α、IRE1α磷酸化顯著增加，ATF6表達明顯上調(diào)(P<0.05)，除ATF6外，其上調(diào)趨勢持續(xù)至損傷后7 d；CALP1或R24571處理可進一步促進或抑制此反應(yīng)(均P<0.05)。這提示，Ca2+/CaM信號與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR-自噬通路存在相關(guān)性，參與了UPR引起的自噬。

1：control；2：CTX d4；3：CTX+CALP1 d4；4：CTX+R24571 d4；5：CTX d7；6：CTX+CALP1 d7；7：CTX+R24571 d7；A：Western blot檢測CaM干擾后損傷肌UPR-自噬通路關(guān)鍵分子eIF2α、IRE1和ATF6的表達；B：蛋白灰度值統(tǒng)計圖；與control組比較，*P<0.05；與同時點CTX組比較，# P<0.05圖5 CaM干擾影響損傷肌UPR-自噬通路關(guān)鍵分子Fig.5 CaM inference affects the expression of key molecules of UPR-autophagy pathway in injured muscles

2.6 CALP1對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌管自噬蛋白的影響

為進一步明確Ca2+/CaM信號是否對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌管自噬蛋白表達有影響，在TM刺激下，采用CaM激動劑CALP1人為激活Ca2+/CaM信號，Western blot檢測各組肌管內(nèi)ERS相關(guān)自噬關(guān)鍵分子eIF2α、IRE1α和ATF6及自噬蛋白LC3的表達。結(jié)果(圖6)顯示：TM誘導(dǎo)肌細胞ERS后，肌管內(nèi)ERS相關(guān)自噬關(guān)鍵分子eIF2α、IRE1α磷酸化增加，ATF6及自噬蛋白LC3的表達顯著增多，CALP1處理可進一步增強此效應(yīng)。這提示肌細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，可能通過啟動ERS相關(guān)性自噬來促進肌修復(fù)。

A：Western blot檢測CALP1干擾后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌管內(nèi)UPR-自噬通路關(guān)鍵分子LC3、eIF2α、IRE1和ATF6的表達；B：蛋白灰度值統(tǒng)計圖；與HS組比較，*P<0.05；與TM組比較，#P<0.05圖6 CALP1影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激肌管自噬蛋白的表達Fig.6 CALP1 impacts the expression of autophagy proteins in ERS myotubes

3 討論

肌肉損傷研究的基礎(chǔ)是構(gòu)建出一種簡便、穩(wěn)定、高效的肌損傷模型[12]。結(jié)合蘇木精-伊紅染色鏡檢和qRT-PCR結(jié)果綜合分析，本研究后續(xù)實驗選擇CTX肌內(nèi)注射建立骨骼肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激模型。Ca2+/CaM信號在免疫和炎癥反應(yīng)中的作用已被廣泛研究，并且臨床中使用的抗炎鈣調(diào)蛋白拮抗劑也有一定的進展，然而肌肉損傷后Ca2+/CaM信號是否參與UPR引起的自身免疫耐受的缺失罕有研究。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是骨骼肌的一種適應(yīng)性機制[6]。在生理或病理情況下，肌纖維可能存在蛋白合成需求增加、鈣離子代謝異?；蛘咤e誤折疊蛋白聚集，肌纖維的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致UPR啟動，以緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并保證肌細胞的生存，而持續(xù)激活的UPR可啟動凋亡、炎癥等信號通路，導(dǎo)致肌組織產(chǎn)生異常病理改變[4-6]。本研究利用CTX誘導(dǎo)肌損傷，檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘發(fā)的UPR標(biāo)志分子Bip、ATF6和XBP1-S mRNA水平?？梢娖溆趽p傷后4 d明顯上調(diào)，隨修復(fù)而逐漸消退，初步證實UPR在肌組織損傷再生修復(fù)過程中是被激活的。這與前人報道是一致的[13-15]。由此可見，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的UPR可促進肌肉修復(fù)。同時，UPR的及時消退有利于組織修復(fù)完成以及炎癥的消退。

為明確Ca2+/CaM信號對肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下活化的UPR信號的影響，本研究進一步利用肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的體內(nèi)外模型，采用CALP1和R24571干擾肌內(nèi)CaM活性。結(jié)果表明，與對照組比較，肌損傷后，Bip、ATF6和XBP1-S mRNA水平顯著上調(diào)；與單純損傷組比較，CALP1處理可上調(diào)損傷肌內(nèi)UPR標(biāo)志物mRNA水平，R24571可下調(diào)損傷肌內(nèi)UPR標(biāo)志物mRNA水平。自噬在維持骨骼肌穩(wěn)態(tài)和功能方面起重要調(diào)控作用[16-17]，ERS時誘發(fā)的UPR信號通路參與了肌細胞自噬的調(diào)控過程[4，6]。C2C12細胞來源于骨骼肌衛(wèi)星細胞，可在2%馬血清作用下誘導(dǎo)分化形成肌管，是理想的研究肌細胞發(fā)育分化的模型[18]。因此體外實驗選擇C2C12細胞分化肌管。在持續(xù)的促炎環(huán)境中，激活的UPR信號分子有助于抑制肌纖維的免疫功能[14]。那么Ca2+/CaM信號是否參與骨骼肌損傷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激UPR相關(guān)性自噬以破壞UPR引起的自身免疫耐受成為關(guān)注的焦點。而我們檢測到肌損傷后，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)性自噬3條通路關(guān)鍵性分子eIF2α、IRE1α磷酸化水平和ATF6蛋白表達水平均顯著變化，提示應(yīng)用CaM干擾劑可以引起通路變化和影響自噬標(biāo)志物L(fēng)C3Ⅱ/Ⅰ水平。

綜上，急性肌損傷后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激活躍，CaM信號參與了UPR，其可能通過調(diào)節(jié)ERS相關(guān)性自噬緩解肌損傷以促進肌修復(fù)的過程。但在此過程中，具體將通過下游哪些信號影響和調(diào)節(jié)自噬還需進一步的實驗驗證。