劉韻佳，龐 博，李 妍，2，黃 堅(jiān)，2

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.西南民族大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院，四川 成都 610041)

乳腺腫瘤為母犬高發(fā)的自發(fā)性腫瘤類型之一，其組織學(xué)類型多樣，超過50%的病例為惡性腫瘤，并且有較高的復(fù)發(fā)死亡率[1].不同年齡和品種的犬均有發(fā)病，各種原因?qū)е碌男韵佥S分泌失調(diào)是常見誘因[2]，因而動(dòng)物的發(fā)情障礙和絕育狀況與疾病發(fā)生存在關(guān)系.目前，手術(shù)切除依然是犬乳腺腫瘤首選的治療方式，尤其適用于臨床上未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患犬[3].根據(jù)腫瘤的臨床病理學(xué)特征，可以選擇單一腫瘤切除、區(qū)域性腫瘤切除和乳腺全切除三種手術(shù)治療方式.由于組織病例學(xué)檢查作為術(shù)前診斷存在滯后性[4]，因此手術(shù)方案(腫瘤切除和子宮卵巢摘除手術(shù))通常會(huì)參考術(shù)前對腫瘤性質(zhì)的臨床判斷和一些非手術(shù)因素(如麻醉風(fēng)險(xiǎn)、動(dòng)物福利和經(jīng)濟(jì)等因素)來制定，導(dǎo)致部分腫瘤的實(shí)際切除范圍可能不夠準(zhǔn)確和充分[5]，從而會(huì)對部分惡性腫瘤病例的預(yù)后產(chǎn)生一定影響.因此，回顧性分析患瘤動(dòng)物的疾病背景(如品種、年齡、體型、絕育狀態(tài)等因素)、腫瘤臨床病理學(xué)特征以及治療預(yù)后間關(guān)系將十分必要，可以切實(shí)提高腫瘤臨床診療的準(zhǔn)確性和有效性，為犬乳腺腫瘤的精準(zhǔn)防治提供參考數(shù)據(jù).

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集

樣本采自2018年8月～2020年1月在西南民族大學(xué)教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診和接受犬乳腺腫瘤切除術(shù)的68例雌性患犬(共109例腫瘤病料)，所有病例在手術(shù)前均接受胸部X線檢查，排除可見的器官轉(zhuǎn)移灶.

1.1.2 主要儀器和試劑

病理組織切片機(jī)(德國萊卡)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒)，恒溫培養(yǎng)箱(美國賽默飛)、自動(dòng)呼吸麻醉機(jī)(臺(tái)灣首美達(dá))、X射線成像系統(tǒng)(華東醫(yī)療科技有限公司)；異氟烷(深圳瑞沃德)、醫(yī)用切片石蠟(上海華靈康復(fù)器械廠)；二甲苯、無水乙醇、異丙醇(成都市科隆化工)；蘇木素、伊紅染液(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)；4%多聚甲醛、中性樹膠(武漢博士德).

1.2 方法

1.2.1 樣本處理

腫瘤切除完成后，無菌采集腫瘤組織，同時(shí)記錄患犬的年齡、品種、絕育情況、生育狀況、腫瘤病灶的外觀、發(fā)病部位、腫瘤大小等信息.術(shù)后連續(xù)回訪6個(gè)月以上，記錄動(dòng)物術(shù)后的生存狀況(生存無復(fù)發(fā)、復(fù)發(fā)或死亡).將組織樣本剪切為0.5 cm3大小，置入4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋和制作組織切片，于顯微鏡下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察和評價(jià).

1.2.2 組織石蠟切片制作和H＆E染色

將固定好的組織樣本修整為適當(dāng)大小后依次進(jìn)行脫水、透明、浸蠟和包埋等程序.將制作好的組織蠟塊以4 μm厚度進(jìn)行連續(xù)切片.H＆E染色:組織切片經(jīng)二甲苯透明后經(jīng)梯度乙醇浸洗后，用蘇木素和伊紅分別染色，最后用中性樹膠封片后于顯微鏡下對病例組織切片進(jìn)行觀察和判讀.

1.2.3 腫瘤大小分級和組織學(xué)惡性分級

根據(jù)M.Goldschmidt等人的病理分級標(biāo)準(zhǔn)[6]對腫瘤大小(Tumor Volume，TV)進(jìn)行臨床分級，T1級:TV≦27 cm3；T2級:28 cm3≦TV≦127cm3；T3級:TV≧128 cm3.

根據(jù)腺管形成程度(1～3分)、細(xì)胞核多形性(1～3分)和核分裂象(1～3分)進(jìn)行描述性計(jì)數(shù)，以三項(xiàng)加合的總分對惡性腫瘤進(jìn)行惡性程度的分級.3～5分:I級(低度惡性，分化良好)；6～7分:II級(中度惡性，分化程度中等)；8～9分:III級(高度惡性，分化程度差).

1.2.4 手術(shù)切除方式

動(dòng)物采用吸入式麻醉進(jìn)行術(shù)前準(zhǔn)備，根據(jù)腫瘤分布、大小以及臨床評級對腫瘤患犬分別實(shí)施單個(gè)乳腺腫瘤切除術(shù)、局部乳腺腫瘤切除術(shù)(第1～2乳區(qū)和或第3～5乳區(qū))和乳腺全切除術(shù)(單側(cè)或雙側(cè))(見圖1).部分患犬同時(shí)進(jìn)行子宮卵巢切除術(shù)和腋下淋巴結(jié)或腹股溝淋巴結(jié)掃除術(shù).在數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)時(shí)，同一只犬不同部位的腫瘤病灶可能分別選擇了單個(gè)切除和區(qū)域切除手術(shù)，因此每一個(gè)部位的腫瘤按照實(shí)際接受的手術(shù)操作進(jìn)行單獨(dú)計(jì)數(shù).

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以±s表示.組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用x2檢驗(yàn)分析臨床病理學(xué)特征分類下各組的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系.采用Graphpad prism 8.0繪制圖柱，p＜0.05表示差異顯著，p＜0.001表示差異極其顯著.

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病犬的體型和品種分布

在68只患犬中，小型犬占比(56/68，82.35%)明顯高于中大型犬(12/68，17.65%).此外，貴賓犬為主要的小型品種(22/68，32.35%)，其他品種犬則零散發(fā)病(見表1).

表1 乳腺腫瘤發(fā)病犬的體型和品種分布Table 1 Distribution of body sizes and breeds in dogs suffering mammary tumor

2.2 發(fā)病犬年齡與絕育狀況關(guān)系

患犬的平均年齡為10.2±2.9歲，其中以6～9歲和10～13歲兩個(gè)年齡段的分布較為集中.在不同年齡段中，患犬術(shù)前的絕育比例不等(12.50%～50.00%)，總體的絕育犬?dāng)?shù)量和比例(20/68，28.41%)不高.此外，各年齡段患犬的生育史比例均較高(62.50%～80.00%)(見表2)，但發(fā)病年齡與生育史和絕育狀況間無統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系(p＝0.245).

表2 乳腺腫瘤發(fā)病犬年齡與絕育狀況的關(guān)系Table 2 Relationship between tumor incidence and neutering condition in dogs bearing mammary tumor

2.3 不同部位乳腺的腫瘤發(fā)病率

在68例患犬中，單發(fā)腫瘤患犬39例，多發(fā)腫瘤患犬29例，總計(jì)腫瘤數(shù)為109例.左右兩側(cè)的各對乳腺都存在一定的腫瘤發(fā)生幾率，其中第3～5對乳腺的平均腫瘤發(fā)病率(82/109，75.23%)要高于第1～2對乳腺(25/109，24.77%)(見圖1)，而且左右兩側(cè)的第5乳腺的腫瘤發(fā)病率均為同側(cè)最高.數(shù)據(jù)分析顯示右側(cè)與左側(cè)乳區(qū)的整體腫瘤發(fā)病率存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.047).

圖1 不同部位乳腺的腫瘤發(fā)病率R1-5:右側(cè)第1-5乳腺區(qū)；L1-5:左側(cè)第1-5乳腺區(qū)；虛線:根據(jù)淋巴管分支對乳腺進(jìn)行的局部區(qū)域劃分Fig.1 Tumor incidence in different mammary gland locationR1-5:No.1-5 mammary gland locations of right flank；L1-5:No.1-5 mammary gland locations of left flank；Dotted line:regions of mammary gland defined by lymphatic branches

2.4 腫瘤病灶數(shù)量分布與腫瘤大小的關(guān)系

根據(jù)同只患犬乳腺腫瘤發(fā)病個(gè)數(shù)分組，將109份腫瘤樣本分為單瘤組(Single tumor，ST):39瘤/39犬、雙瘤組(Double tumors，DT):38瘤/19犬和多瘤組(Multiple tumors，MT):32瘤/10犬.其中，T1級腫瘤39例，T2級腫瘤32例，T3級腫瘤38例.各組間的T1級腫瘤分布較為集中，而T2和T3級腫瘤的分布相對分散(見圖2).T1分級下ST組腫瘤的平均體積更大，各組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＝0.002)，而T2和T3分級下的各組腫瘤大小無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(見表3).

圖2 各組腫瘤(體積)的數(shù)量分布ST:單瘤組；DT:雙瘤組；MT:多瘤組Fig.2 Quantitative distribution of tumor lesions according to tumor size(tumor volume)in each groupST:Single tumor group；DT:Double tumors group；MT:Multiple tumors group

表3 腫瘤病灶數(shù)量分布與腫瘤大小的關(guān)系Table 3 Relationship between quantitative distribution of tumor lesions and tumor sizes

2.5 腫瘤的外觀形態(tài)、組織學(xué)分類與惡性分級

對109份腫瘤樣本進(jìn)行組織性質(zhì)評價(jià)，其中良性腫瘤35份(共屬27只犬)和惡性腫瘤74份(共屬54只犬).T1級腫瘤中良性腫瘤27例，惡性腫瘤12例；T2級腫瘤中，良性腫瘤8例，惡性腫瘤24例；38例T3級腫瘤均為惡性腫瘤.良性腫瘤的外觀形態(tài)特征為皮膚組織無明顯的紅腫，外觀完整平滑(見圖3A1)，腫瘤與皮下深部筋膜組織無緊密聯(lián)系，有一定游離性.單個(gè)腫瘤的體積多數(shù)為T1級.質(zhì)地稍硬，觸壓無明顯疼痛反應(yīng)(非反應(yīng)期).包膜完整，組織切面相對平整，出血少(見圖3A2)；惡性腫瘤的外觀形態(tài)特征為局部皮膚腫脹或瘤體表面不平滑，甚至有破潰和繼發(fā)感染(見圖3B1和3C1).部分腫瘤與皮下深部筋膜組織存在緊密聯(lián)系.質(zhì)地存在變化，反應(yīng)期觸壓存在明顯的疼痛反應(yīng).包膜完整或不完整，多數(shù)組織切面不平整(囊狀或分隔狀)，血管供應(yīng)豐富，容易出血(見圖3B2).部分腫瘤的中央?yún)^(qū)存在明顯的壞死或感染灶(圖3C2).

35份良性乳腺腫瘤病料包括了16例導(dǎo)管腺瘤、7例肌上皮瘤、8例復(fù)雜性腺瘤和4例混合瘤(見圖3A3)；74例惡性腫瘤病料包括了20例惡性肌上皮瘤、實(shí)性癌19例、混合性癌8例、導(dǎo)管癌8例、復(fù)雜性癌7例、炎性癌7例、2例導(dǎo)管乳頭狀癌、2例富脂癌、1例未分化癌(見圖3B3和3C3).對74惡性腫瘤進(jìn)行組織學(xué)惡性分級，其中23例為I級，26例為II級，25例為III級(見表4).在部分犬只中，同只患犬的多發(fā)腫瘤灶在組織學(xué)性質(zhì)和惡性分級上不完全一致.

圖3 不同類型腫瘤的形態(tài)外觀、組織切面以及組織病理學(xué)特征

表4 不同組織學(xué)亞型腫瘤的惡性分級Table 4 Malignant grade of CMTs in different histological subtypes

2.6 手術(shù)切除范圍與惡性腫瘤類型、組織惡性等級及預(yù)后的關(guān)系

在良性腫瘤病例中，10只犬接受了單個(gè)腫瘤切除術(shù)，4只犬接受了區(qū)域乳腺切除術(shù)(其6只犬同時(shí)進(jìn)行了子宮卵巢切除).在惡性腫瘤病例中，18只犬接受了單個(gè)腫瘤切除(其中7例同時(shí)接受子宮卵巢切除)、25只犬接受了局部乳腺切除(其中10例同時(shí)接受子宮卵巢切除)和11只犬接受了乳腺全切除(其中8例同時(shí)接受了子宮卵巢切除).局部切除和乳腺全切的腫瘤比例(56/74，75.68%)要高于單個(gè)切除的比例(18/74，24.32%)，惡性I級腫瘤的以單個(gè)切除(10/23，43.49%)和局部切除(8/23，34.78%)為主，而II-III級的腫瘤則以局部切除(10/51，41.18%)和乳腺全切(10/51，43.49%)為主.54例犬在術(shù)后的無病存活率(33/54，64.71%)高于復(fù)發(fā)死亡率(21/51，35.29%)，但是單個(gè)切除組患犬的無病存活率(8/18，44.44%)均低于局部切除(17/25，68.00%)和乳腺全切組(8/11，72.73%).腫瘤的手術(shù)切術(shù)范圍與腫瘤組織學(xué)類型(p＝0.000)、惡性分級(p＝0.049)有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)系，與預(yù)后無關(guān)(見表5).

表5 手術(shù)切除范圍與惡性腫瘤類型、惡性分級及預(yù)后的關(guān)系(74瘤/54犬)Table 5 Relationship between tumor subtypes and resection areas，malignant grade，prognosis in CMMTs(74 tumors/54 dogs)

3 討論

乳腺腫瘤在不同年齡和品種的犬中均見發(fā)病，其中絕大多數(shù)為雌性犬，但也有少數(shù)雄性犬罹患乳腺腫瘤的病例報(bào)道.Komazawa.S等人調(diào)查發(fā)現(xiàn)日本岐阜縣的查理王小獵犬、馬爾濟(jì)斯犬、貝靈頓犬、八哥犬、波美拉尼亞犬和約克夏梗犬等小型犬為高發(fā)乳腺腫瘤的品種[7].在韓國首爾地區(qū)，Jung-Hyang Sur等人的調(diào)查結(jié)果顯示馬爾濟(jì)斯犬、約克夏梗犬、西施犬、貴賓犬和可卡犬為多發(fā)該病的犬種[8].國內(nèi)部分地區(qū)的流行病學(xué)分析顯示雜交犬、北京犬、西施犬、貴賓犬、可卡犬為排名前列的發(fā)病品種[9-10]，與上述亞洲其他地區(qū)和歐美國家(貴賓犬、可卡犬、雪納瑞犬和約克夏梗犬更為高發(fā))[11-12]的流行情況相近.而本研究所涉對象均為城區(qū)內(nèi)飼養(yǎng)的觀賞犬只，其中以貴賓犬和雜交犬為主要代表品種，既體現(xiàn)了當(dāng)?shù)氐娘曫B(yǎng)偏好選擇，也反映出現(xiàn)階段這些小型犬種仍為常見的高發(fā)病品種.同時(shí)，考慮到城市養(yǎng)犬的條例限制，小型犬有更大的飼養(yǎng)基數(shù)，因此其發(fā)病數(shù)量和發(fā)病率也比中大型犬高.此外，不同的調(diào)查結(jié)果也提示大于7歲的雌性犬有較高的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而8～11歲為高發(fā)年齡段[8-10，12]，與本研究的結(jié)果基本一致，說明老年動(dòng)物依然為高發(fā)乳腺腫瘤的群體.

犬乳腺腫瘤的發(fā)病因素與雌激素的分泌紊亂有關(guān)，尤其雌激素的持續(xù)高水平分泌，可刺激乳腺導(dǎo)管上皮的增生，尤其對于存在發(fā)情異常(如假孕、頻繁發(fā)情和過度繁殖)的動(dòng)物而言，存在極高的腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[2].因此，國內(nèi)外的臨床共識(shí)是提倡對性成熟的非繁殖犬進(jìn)行早期絕育，而這一措施可顯著降低乳腺腫瘤發(fā)生幾率[12].在本研究的發(fā)病犬中，未進(jìn)行早期絕育的犬只數(shù)量和比例仍比較高，而且大多數(shù)犬只均有生育史，這與傳統(tǒng)的飼養(yǎng)觀念(繁衍后代)和動(dòng)物福利有關(guān)，因此犬只有獲得性發(fā)情障礙的風(fēng)險(xiǎn)，這也是促成乳腺腫瘤持續(xù)高發(fā)的原因之一.

患犬的第4～5對乳區(qū)有更高的腫瘤發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，這可能與腹股溝豐富的淋巴導(dǎo)管供應(yīng)有關(guān)，有利于腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移[14]，因此在進(jìn)行腫瘤大范圍切除時(shí)會(huì)進(jìn)行局部淋巴結(jié)的掃除.相較于左側(cè)乳區(qū)，右側(cè)乳區(qū)似乎更常發(fā)生腫瘤，與多個(gè)報(bào)道結(jié)果相一致[1，15]，而這一原因尚不清楚.此外，患犬中存在雙瘤或多瘤發(fā)生的情況也較為普遍，這與多乳腺動(dòng)物的生理特點(diǎn)有關(guān).T1級腫瘤中存在一定比例(12/39，30.77%)的惡性腫瘤，而T2級中也有一部分良性腫瘤(8/32，25%)，這可能與腫瘤的發(fā)展階段、腫瘤的異質(zhì)性和腫瘤組織類型有關(guān)[3，16]，因此僅通過腫瘤大小進(jìn)行腫瘤性質(zhì)的判定可能并不準(zhǔn)確.雖然T1級中的良性腫瘤比例較高(27/39，69.23%)，但部分腫瘤可能在較長時(shí)間內(nèi)(幾個(gè)月或數(shù)年)處于非反應(yīng)期，并未能在早期引起足夠的重視或接受早期的干預(yù)治療，從而出現(xiàn)腫瘤的持續(xù)增大和惡變.

對腫瘤外觀形態(tài)以及惡性生長行為進(jìn)行評價(jià)有助于初步鑒別腫瘤的性質(zhì)(良性或惡性)[17]，當(dāng)然仍需要通過組織病理學(xué)檢查進(jìn)行最終確認(rèn).在109例腫瘤樣本中，良性乳腺腫和惡性腫瘤的組織類型顯示出多樣性，而且惡性腫瘤的比例(67.89%)仍居高位.此外，同只患犬的多發(fā)性腫瘤的性質(zhì)和組織惡性程度也不盡相同，因此不同部位采取的手術(shù)切除方式也存在差異[18].根據(jù)ángela Alonso-Diez等人的調(diào)查結(jié)果顯示，大多數(shù)惡性肌上皮瘤為單發(fā)的大腫瘤，轉(zhuǎn)移率較低，術(shù)后存活率較高[16].此外，Roberta Rasotto等人的研究結(jié)果也表明，混合性癌、復(fù)雜性癌和單純導(dǎo)管癌患犬的術(shù)后存活期更長，而實(shí)體癌、導(dǎo)管乳頭狀癌、肉瘤患犬的術(shù)后復(fù)發(fā)率和病死率較高[19].以上結(jié)果提示，對于某些組織類型的腫瘤，手術(shù)切除方式或許并不是影響患犬預(yù)后的唯一因素.在本研究中，大范圍切除(區(qū)域切除和乳腺全切除)為乳腺腫瘤手術(shù)治療的主要選擇，尤其適合用于高惡性等級的腫瘤切除，總體預(yù)后也要好于單一腫瘤切除.

因此，對犬乳腺腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、致病因素以及腫瘤的臨床評估仍將是疾病預(yù)防和臨床治療選擇的有效路徑

4 結(jié)論

犬乳腺腫瘤的發(fā)病顯示出年齡、品種、體型和部位偏好.組織學(xué)外觀和大小有助于腫瘤性質(zhì)的初步判定，但結(jié)果與組織學(xué)分類和惡性分級不完全一致.手術(shù)切除依然是犬乳腺腫瘤有效的治療方法，大范圍切除適用于高惡性等級的腫瘤治療，獲得的預(yù)后更好.