張建梅，黃衛(wèi)平，金素鈺，鄒 桐，黃 林，鄭玉才

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041；2.四川省涼山彝族自治州畜牧科學(xué)研究所，四川 西昌 615042)

線粒體DNA(mtDNA)是重要的核外遺傳物質(zhì)，遵循嚴(yán)格的母系遺傳，具有分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、突變率高、進(jìn)化速率快、幾乎不發(fā)生重組等特征[1]，能保存群體多數(shù)中性突變[2].mtDNA的D-loop區(qū)的序列和長(zhǎng)度變異最大，進(jìn)化速度是其他區(qū)域的5～10倍，在進(jìn)化中積累了較多的突變，如堿基替換、插入或缺失及串聯(lián)重復(fù)序[3-4].因此，mtDNA的D-loop區(qū)是研究畜禽群體間的遺傳分化的理想分子標(biāo)記[5].

有關(guān)豬mtDNA研究所需的基因組DNA一般是從血液中提取[6-8]，乳中體細(xì)胞數(shù)量低于血液中的白細(xì)胞濃度，但仍可用于提取DNA.崔艷華等[9]用高鹽法從50 mL牦牛乳中提取DNA；王一凡等[10]建立了用試劑盒從10 mL牛奶中提取DNA方法；Liu等[11]用丙酮和SDS-苯酚法從13 mL牛乳中提取DNA.綜上所述，目前從乳中提取DNA的方法各異，但都存在耗時(shí)長(zhǎng)、試劑價(jià)格高、樣本需要量大和試劑污染等問(wèn)題.本實(shí)驗(yàn)從四川省涼山州的大約克豬乳中用Chelex-100法提取基因組DNA，并用PCR方法擴(kuò)增其mtDNA D-loop區(qū)部分序列，測(cè)序后分析該區(qū)域序列多態(tài)性，以豐富該豬品種群體遺傳多樣性的研究資料.

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)中健康的大約克豬(n＝30)來(lái)自四川省涼山州某種豬場(chǎng)，個(gè)體間無(wú)親緣關(guān)系.每頭豬肌肉注射10 IU催產(chǎn)素后，分別手工擠奶采集乳樣約5 mL.乳樣冰凍后用冰瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80℃，用于基因組DNA的提取.

1.2 基因組DNA的提取

采用Chelex-100的方法[12]從每頭試驗(yàn)豬全乳中提取基因組DNA，其中乳樣參照羅卉卉等的方法[13]，取樣體積為20 μL.提取的基因組DNA保存于-20℃.

1.3 引物設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增和測(cè)序

擴(kuò)增大約克豬mtDNA D-loop區(qū)的引物序列及PCR程序參照Z(yǔ)hang等的報(bào)道[14]，引物序列:F:5‘-CCAAAAACAAAGCAGAGTGTAC-3‘；R:5‘-CGTTATGAGCTACCGTTATA-3‘，預(yù) 期 擴(kuò) 增 片 段 長(zhǎng)431bp，引物使用前稀釋至10 μmol/L.

PCR擴(kuò)增體系為25 μL:3μL基因組DNA，上下游引物各1 μL，Golden Star T6 Super PCR Mix 20 μL.用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物后，將條帶單一、明亮的PCR產(chǎn)物送生物技術(shù)有限公司進(jìn)行反向測(cè)序.

1.4 數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件排列同源序列，并進(jìn)行人工核對(duì)校正.通過(guò)與GenBank中豬mtDNA Dloop序列(登錄號(hào)AF034253)比對(duì)，用DnaSP 5.0軟件統(tǒng)計(jì)單倍型多樣度(Hd)、核苷酸多樣度(Pi)和平均核苷酸差異度(K)等，并進(jìn)行Tajima’s D檢測(cè).

用Mega 7.0分析所獲序列的單倍型數(shù)、平均堿基組成、多態(tài)位點(diǎn)數(shù)及采用鄰接法(NJ)構(gòu)建大約克豬與GenBank中下載的30個(gè)豬品種mtDNA D-loop序列(表1)進(jìn)化樹(shù)，分析大約克豬與國(guó)內(nèi)外其他豬品種的進(jìn)化關(guān)系.

表1 本研究使用的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬的mtDNA信息Table 1 Information of pig mtDNA in GenBank used in this study

2 結(jié)果

2.1 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)的擴(kuò)增

從乳中提取的大約克豬基因組DNA用PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中19個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶明亮，其他11個(gè)樣本經(jīng)45個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增后，也獲得了明亮的條帶.獲得的PCR產(chǎn)物約430 bp，與預(yù)期的產(chǎn)物大小相符，且特異性良好、亮度較高，可用于后續(xù)的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序(圖1).

圖1 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳注:1～8為不同個(gè)體的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M為DL-2000MarkerFig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products amplifying mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 8 are PCR products of different individuals；M.DL-2000 Marker

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

實(shí)驗(yàn)獲得的PCR產(chǎn)物直接測(cè)序圖清晰，30個(gè)樣本的擴(kuò)增序列去除引物及兩端不準(zhǔn)確區(qū)域后，有效序列為364 bp(圖2)，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)有效擴(kuò)增出大約克豬的mtDNA D-loop區(qū)部分序列.

圖2 大約克豬mtDNA D-loop部分區(qū)測(cè)序峰圖Fig.2 Sequencing map of partial mtDNA D-loop of a Yorkshire pig

2.3 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)遺傳多樣性

對(duì)本次實(shí)驗(yàn)所測(cè)30個(gè)大約克豬mtDNA D-loop區(qū)序列(364 bp)進(jìn)行了比對(duì)，界定了Hap1～Hap7共7種單倍型(表2)，其中特有單倍型為3種(Hap1、Hap6、Hap7)，共享單倍型為4種(Hap2、Hap3、Hap4、Hap5)，Hap3所占比例最高；發(fā)現(xiàn)了11個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其中簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)9個(gè)，單一多態(tài)位點(diǎn)2個(gè)，表現(xiàn)出較豐富的多態(tài)性；mtDNA D-loop序列中4種堿基T、C、A和G的平均含量分別為25.0%、25.7%、37.6%和11.7%，其中A＋T含量(62.6%)明顯高于C＋G含量(37.4%)，符合mtDNA D-loop區(qū)富含A/T堿基的特征.

表2 大約克豬7種單倍型mtDNA D-loop區(qū)變異位點(diǎn)Table 2 Mutations in mtDNA D-loop region in 7 haplotypes of Yorkshire pigs

在本研究中，1頭豬mtDNA D-loop為Hap1單倍型，其中存在11個(gè)堿基(CTTATAAAACA)組成的重復(fù)序列，重復(fù)1次(圖3).30個(gè)大約克豬mtDNA D-loop區(qū)單倍型多樣度(Hd)為0.618，核苷酸多樣度(Pi)為0.00860，平均核苷酸差異度(K)為3.103.對(duì)大約克豬mtDNA D-loop區(qū)序列進(jìn)行中性檢測(cè)，其Tajima’s D值為0.37882，差異不顯著(P＞0.10).

圖3 大約克豬mtDNA D-loop的Hap1單倍型中11 bp重復(fù)序列注:1～12為不同個(gè)體的序列Fig.3 A 11 bp repeat in Hap1 haplotype of mtDNA D-loop of Yorkshire pigs Notes:1 to 12 are sequences of different individual

2.4 大約克豬mtDNA D-loop區(qū)單倍型的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

本研究利用Mega 7.0軟件采用鄰接法(NJ)以豬獾(HM106329)和河馬(AP003425)的mtDNA Dloop序列為外群，構(gòu)建大約克豬與國(guó)內(nèi)外30個(gè)豬品種的mtDNA D-loop序列分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4).所測(cè)樣本分為2個(gè)明顯相對(duì)獨(dú)立的支系:第一支以國(guó)外豬品種為主，東北野豬、DLY三元豬、漢普郡豬、杜洛克豬和皮特蘭豬聚為一類；第二支以中國(guó)地方品豬種為代表的亞洲類群聚為一類.其中大約克豬有3個(gè)單倍型(Hap4、Hap6、Hap7)與中國(guó)地方豬品種隆林豬、陸川豬、民豬和屯昌豬聚在一起.

圖4 試驗(yàn)大約克豬7個(gè)單倍型和國(guó)內(nèi)外30個(gè)豬品種基于mtDNA D-loop部分序列構(gòu)建的NJ分子進(jìn)化樹(shù)Fig.4 NJ molecular evolutionary tree constructed based on mtDNA D-loop partial sequences of 7 haplotypes of the experimental Yorkshire pigs and 30 domestic and foreign pig breeds

3 討論

本研究建立了從大約克豬乳中快速提取基因組DNA擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)的方法.在30個(gè)樣品中，有19個(gè)樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖電泳檢測(cè)顯示擴(kuò)增條帶明亮，另外11個(gè)樣本的擴(kuò)增條帶亮度較低.這可能與個(gè)體差異有關(guān)，不同樣品提取的基因組DNA含量或質(zhì)量不同.張軍偉[15]比較從荷斯坦牛乳樣和血樣中提取基因組DNA效果，發(fā)現(xiàn)以乳樣或血樣提取的DNA為模板，PCR擴(kuò)增效果一樣，只是不同個(gè)體的乳樣提取的基因組DNA濃度相差較大.本研究對(duì)11個(gè)PCR條帶亮度較低的，將PCR循環(huán)數(shù)增加到45個(gè)循環(huán)后，發(fā)現(xiàn)條帶亮度得到明顯改善，PCR產(chǎn)物可滿足直接測(cè)序的要求.雖然在生產(chǎn)實(shí)踐中從組織和血液中提取DNA是一項(xiàng)比較成熟的技術(shù)，但會(huì)對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)而產(chǎn)生一些弊端.本研究建立了從大約克豬乳中提取基因組DNA擴(kuò)增mtDNA D-loop區(qū)的方法，具有取樣方便、程序簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn).但也存在一些不足，例如，提取的基因組DNA濃度不穩(wěn)定，PCR擴(kuò)增時(shí)需根據(jù)實(shí)際情況對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行調(diào)整，且該方法僅適合泌乳動(dòng)物.Amills等從乳中提取基因組DNA擴(kuò)增基因時(shí)，也對(duì)不同基因使用的PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行過(guò)調(diào)整[12].

本實(shí)驗(yàn)中對(duì)30頭大約克豬mtDNA D-loop區(qū)進(jìn)行分析，單倍型多樣度(Hd)及核苷酸多樣度(Pi)分別為0.618和0.00860，顯示出其母系遺傳多樣性較為豐富.張冰等[16]研究的大約克豬Hd和Pi分別為0.762和0.00763，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明該群體大約克豬遺傳多樣性較高.通過(guò)mtDNA序列構(gòu)建發(fā)育樹(shù)為大約克豬的選育提供參考.本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的NJ樹(shù)顯示，以中國(guó)地方豬品種和國(guó)外豬品種為代表的幾個(gè)豬品種分別聚為兩個(gè)獨(dú)立的分支，并且東北野豬沒(méi)有與國(guó)內(nèi)豬品種聚為一類，而是與歐洲豬品種親緣關(guān)系較近，這可能與東北地理位置有關(guān)，種群間存在基因交流[17]，這與前人研究結(jié)果一致[18-20].