范世成，朱元全，馮偉，李勝斌，王波，唐香，崔慶鵬*

(云南省第三人民醫(yī)院，云南 昆明 650011；2.曲靖市第二人民醫(yī)院，云南 曲靖 655500)

0 引言

腎臟作為機(jī)體的高灌注器官，腎缺血再灌注損傷(renal ischemia reperfusion injury，RIRI)是臨床上急性腎功能衰竭(Acute renal failure,ARF)的重要環(huán)節(jié)，也是腎臟遠(yuǎn)期纖維化導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因[1,2]。目前缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，通常認(rèn)為：氧自由基、鈣超載、炎癥介質(zhì)、細(xì)胞凋亡及多種信號(hào)通路參與了IRI的病理演變過(guò)程[3]。但隨著研究的深入，細(xì)胞能量代謝障礙及由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，首先感受到能量的變化從而影響各種凋亡蛋白的表達(dá)，在缺血再灌注損傷中扮演著重要角色，因而成為目前研究缺血再灌注損傷的熱點(diǎn)[4-6]。 線粒體功能的表達(dá)是通過(guò)位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，MPTP是維持線粒體穩(wěn)定及細(xì)胞功能的必要條件，是線粒體與細(xì)胞質(zhì)進(jìn)行物質(zhì)交換和信號(hào)傳導(dǎo)的重要通道[7]。

親環(huán)蛋白D(Cyclophilin D,Cyp-D)屬于肽脯氨酰順反異構(gòu)酶(peptidyl-prolyl-cis-transisomerases,PPIase)親環(huán)蛋白家族，是Ppif基因編碼的產(chǎn)物，主要定位于線粒體基質(zhì)，是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，在細(xì)胞凋亡及蛋白翻譯、折疊、運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用[8]。大量的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CYP-D是引起細(xì)胞死亡的關(guān)鍵性損傷蛋白，是反應(yīng)線粒體損傷及功能障礙的指標(biāo)。CYP-D表達(dá)水平與MPTP開放數(shù)量呈顯著正相關(guān)，CYP-D過(guò)度表達(dá)促進(jìn)MPTP開放，組織損傷加重，而通過(guò)基因敲除或使用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)能抑制CYP-D表達(dá)或活性，從而減少M(fèi)PTP開放，減輕組織損傷，從而認(rèn)為CYP-D是抑制缺血再灌注損傷的重要靶點(diǎn)。

Caspase家族是存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶，與線蟲(caenorbditis elegans)的死亡基因Ced-3同源，根據(jù)其在細(xì)胞凋亡過(guò)程中的結(jié)構(gòu)及功能，分為炎癥有關(guān)、凋亡啟動(dòng)及凋亡效應(yīng)三個(gè)亞類，其中Caspase-3是主要的凋亡效應(yīng)蛋白，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然發(fā)生[9]。

我們通過(guò)采用不同熱缺血時(shí)間建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，通過(guò)親環(huán)蛋白D介導(dǎo)的線粒體功能障礙研究腎臟IRI的作用機(jī)制，以及與Caspase-3的探明作用關(guān)系，同時(shí)作為MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子CYP-D，可能是抑制缺血再灌注損傷的作用靶點(diǎn)，將為臨床防止腎臟IRI和藥物研究提供新的策略。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

健康成年雄性SD大鼠40只、無(wú)創(chuàng)血管夾、兔抗小鼠Cyp-D一抗、兔抗小鼠caspase-3一抗、組織線粒體分離試劑盒、Trizol PCR 試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組

健康雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為4個(gè)組：假手術(shù)組(Con組)、I-R20min組、I-R30min組和I-R45min組，每組10只，每組于2個(gè)時(shí)間點(diǎn)(再灌注后24h及28d)處死取腎，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5只，共有8個(gè)小組。

1.2.2 模型建立

實(shí)驗(yàn)組通過(guò)手術(shù)暴露雙側(cè)腎蒂后用無(wú)創(chuàng)血管夾夾閉，根據(jù)不同亞組時(shí)間分別阻斷(20分鐘、30分鐘、45分鐘)，恢復(fù)血供后可見腎臟迅速恢復(fù)鮮紅色，造模成功。假手術(shù)組僅游離腎蒂，但不夾閉腎蒂，其余操作方法相同。造模成功24h及28d后，切取腎臟行矢狀位切，放入液氮中速凍后，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于Western blot及RT-PCR檢測(cè)。

1.2.3 Western blot

取腎組織線粒體，加入適量勻漿緩沖液(每100mg加入1mL緩沖液)于冰上勻漿10min，經(jīng)6000×g離心5min離心后取上清液，用考馬斯亮藍(lán)試劑盒經(jīng)紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳，凝膠電泳結(jié)束后，將凝膠上分離到的蛋白條帶通過(guò)轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)印至固相支持物上，然后分別用非標(biāo)記一抗及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗對(duì)其進(jìn)行孵育、檢測(cè)。

1.2.4 RT-PCR

用Trizol提取組織樣本中總RNA。取5μLRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。用TIANScript RT KIT進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用熒光定量PCR儀，采用2-△△CT法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)用均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組內(nèi)比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cyp-D 及Caspase-3的Western blot 檢測(cè)結(jié)果

圖2 Western blot 檢查不同熱缺血時(shí)間大鼠腎缺血再灌注28d Cyp-D及Caspase-3蛋白的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

圖4 不同熱缺血時(shí)間大鼠腎再灌注28d Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

Cyp-D的Western blot 檢測(cè)結(jié)果示，Con組Cyp-D含量少，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(見圖1、2)。Caspase-3的Western blot檢測(cè)結(jié)果示，Con組Caspase-3含量少，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(見圖1、2)。

圖1 Western blot 檢查不同熱缺血時(shí)間大鼠腎缺血再灌注24h Cyp-D及Caspase-3蛋白的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

2.2 Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

Cyp-D 及Caspase-3的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果示，Con組Cyp-D及Caspase-3 mRNA含量少，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加。與Con組比較，I-R20min組Cyp-D及Caspase-3 mRNA表達(dá)上未見明顯差異(P＞0.05)，I-R30min組與I-R45min組表達(dá)增加(P＜0.05)且I-R45min組增加明顯(圖3、4)。

圖3 不同熱缺血時(shí)間大鼠腎再灌注24h Cyp-D、Caspase-3 mRNA的表達(dá)(a：P＞0.05，b：P＜0.05)

3 討論

腎臟作為機(jī)體的高灌注器官，在器官移植、阻斷腎臟血流的手術(shù)、休克、心肺復(fù)蘇等中IRI均不可避免[10]，是臨床上急性腎功能衰竭的重要環(huán)節(jié)，也是腎臟遠(yuǎn)期纖維化導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因[1,2]。因此盡早恢復(fù)組織灌流是減少缺血性腎損傷的根本措施，但在臨床實(shí)踐中，為了保證手術(shù)治療目的，常需阻斷腎臟血流，所以對(duì)腎臟組織無(wú)明顯影響的熱缺血時(shí)間一直是泌尿外科及器官移植鄰域的研究熱點(diǎn)，但由于選用動(dòng)物模型、實(shí)驗(yàn)條件及檢測(cè)指標(biāo)的不同，得出的結(jié)論不完全一致，甚至相互矛盾，且大多數(shù)實(shí)驗(yàn)未能使用同一指標(biāo)同時(shí)研究IRI對(duì)腎臟近期及遠(yuǎn)期損傷的影響，因此仍有必要研究IRI對(duì)腎臟組織細(xì)胞的影響并探討安全的熱缺血時(shí)間。隨著研究的深入，細(xì)胞能量代謝障礙及由此導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，首先感受到能量的變化從而影響各種凋亡蛋白的表達(dá)，在缺血再灌注損傷中扮演著重要角色，因而成為目前研究缺血再灌注損傷的熱點(diǎn)[4-6]。線粒體是真核細(xì)胞重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞進(jìn)行氧化磷酸化、呼吸鏈電子傳遞、合成ATP的重要場(chǎng)所，其功能的表達(dá)是通過(guò)位于線粒體內(nèi)、外膜之間的非特異性孔道線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeability transition pore, MPTP)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，親環(huán)蛋白D(CyP-D)是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，在細(xì)胞死亡及蛋白翻譯、折疊、運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用[8]，是反應(yīng)線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論再灌注早期及遠(yuǎn)期均可發(fā)現(xiàn)，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Cyp-D蛋白及mRNA的表達(dá)均有不同程度升高，且Cyp-D在蛋白翻譯及所編碼基因轉(zhuǎn)錄水平上的結(jié)果是一致的，與Con組及I-R20min組比較，I-R30min組Cyp-D蛋白及mRNA的表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，且I-R45min組表達(dá)明顯增加。這與劉長(zhǎng)濤等[11]、斯妍娜等[12]在大鼠腎缺血再灌注損傷模型中得到的結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Cyp-D水平逐漸升高，MPTP的開放程度也相應(yīng)增加，腎組織損傷加重，通過(guò)抑制Cyp-D的表達(dá)，可發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。而通過(guò)敲除、沉默Ppif基因[13-17]或使用免疫抑制劑環(huán)孢霉素A (Cyclosporin A, CsA)[18-21]能抑制CYP-D表達(dá)或活性，減少M(fèi)PTP開放，減輕組織損傷，從而認(rèn)為CYP-D是抑制缺血再灌注損傷的重要靶點(diǎn)。所以CYP-D可作為反應(yīng)缺血再灌注損傷程度的指標(biāo)，其理由如下：

(1)缺血再灌注時(shí)，Ca+ 超載及大量ROS形成，ATP酶活性降低，ATP合成受阻，導(dǎo)致線粒體通透性改變及線粒體腫脹。線粒體結(jié)構(gòu)及功能的破壞，是細(xì)胞再灌注不可逆損傷的重要標(biāo)志。

(2)線粒體功能的表達(dá)是通過(guò)MPTP來(lái)實(shí)現(xiàn)的，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死常取決于MPTP開放的程度及持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短，MPTP短暫少量開放，引起細(xì)胞凋亡，而嚴(yán)重持續(xù)的開放則導(dǎo)致細(xì)胞壞死。

(3)CYP-D作為MPTP的關(guān)鍵性調(diào)控因子，其表達(dá)水平與MPTP開放數(shù)量呈顯著正相關(guān)，Cyp-D水平升高，MPTP的開放程度也相應(yīng)增加，腎組織損傷加重，通過(guò)抑制Cyp-D的表達(dá)，可發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用，這在很多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均可發(fā)現(xiàn)。

(4)通過(guò)敲除、沉默Ppif基因或使用免疫 CsA能抑制CYP-D表達(dá)或活性，從而減少M(fèi)PTP開放，減輕組織損傷，認(rèn)為Cyp-D是引起細(xì)胞損傷的關(guān)鍵性蛋白。

(5)典型的大鼠IRI模型中術(shù)后一周腎功能恢復(fù)正常，腎小管上皮細(xì)胞完全恢復(fù)則需要4周或更長(zhǎng)時(shí)間，此時(shí)與腎損傷相關(guān)的細(xì)胞因子也回到基線水平，

劉長(zhǎng)濤等[11]認(rèn)為缺血損傷后面神經(jīng)元內(nèi)Cyp-D水平逐漸升高，7d達(dá)到最高，后逐漸降低，21d基本達(dá)到正常組織水平，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在出入，術(shù)后28dCyp-D仍有表達(dá)，且較24h有不同程度增加，可以推測(cè)其可能參與了細(xì)胞凋亡過(guò)程，這有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

Caspase家族是存在于細(xì)胞質(zhì)中的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase)，參與調(diào)節(jié)和執(zhí)行細(xì)胞凋亡最重要的蛋白酶，其中Caspase-3是主要的凋亡效應(yīng)蛋白，是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，是細(xì)胞凋亡蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，被稱為“死亡執(zhí)行蛋白酶”，Caspase-3一旦活化，凋亡必然發(fā)生[9]。

本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論再灌注早期及遠(yuǎn)期均可發(fā)現(xiàn)，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)均有不同程度升高，且其表達(dá)與Cyp-D表達(dá)同步。當(dāng)缺血或缺氧時(shí)，CYP-D過(guò)度表達(dá)促進(jìn)MPTP開放，線粒體腫脹破裂，釋放膜間隙的促凋亡蛋白如細(xì)胞色素C、AIF等，激活下游的caspase家族，從而產(chǎn)生一系列凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，此即經(jīng)典的經(jīng)線粒體凋亡途徑，結(jié)合既往的實(shí)驗(yàn)研究[10,22]，本實(shí)驗(yàn)將Caspase-3的表達(dá)作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)志，由此推測(cè)Cyp-D介導(dǎo)的線粒體功能障礙除早期引起細(xì)胞損傷外，并促進(jìn)遠(yuǎn)期細(xì)胞凋亡的發(fā)生。有研究表明細(xì)胞凋亡可引起遠(yuǎn)期腎小管間質(zhì)纖維化，且與Casepase過(guò)度表達(dá)較大關(guān)系[23,24]。

傳統(tǒng)理念一直把30min作為常溫下腎臟缺血損傷的極限時(shí)間，認(rèn)為一旦超過(guò)此極限時(shí)間，將導(dǎo)致腎臟功能及病理形態(tài)學(xué)發(fā)生不可逆性損傷[25,26]，但部分動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究卻認(rèn)為腎臟安全的熱缺血時(shí)間可以超過(guò)30min，甚至選擇性腎動(dòng)脈阻斷60或90min腎功能無(wú)明顯升高[27-29]，所以對(duì)IRI作用機(jī)制的研究并探討安全的熱缺血時(shí)間仍是泌尿外科及器官移植鄰域的研究熱點(diǎn)。線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，缺血、缺氧導(dǎo)致能量代謝障礙并由此引發(fā)的細(xì)胞凋亡是缺血再灌注損傷的重要原因，而CyP-D是構(gòu)成 MPTP關(guān)鍵性的調(diào)控因子，是反應(yīng)線粒體結(jié)構(gòu)及功能障礙的指標(biāo)。根據(jù)病理檢查、Cyp-D及Caspase-3蛋白及mRNA的表達(dá)研究結(jié)果得出小于30 min為腎臟熱缺血的安全時(shí)間，這與胡紅林等[30]在小鼠腎缺血再灌注損傷中發(fā)現(xiàn)30 min后血清肌酐、尿素和腎病理組織學(xué)評(píng)分均升高，35-45 min腎缺血時(shí)間熱缺血是制備腎缺血再灌注損傷模型較為理想的時(shí)間的結(jié)果是一致的。同樣Porpiglia等[31]、 Funahashi等[32]、徐輝照[33]研究腹腔鏡部分腎切除術(shù)術(shù)后患者腎功能變化，發(fā)現(xiàn)熱缺血時(shí)間超過(guò)30min近期及遠(yuǎn)期均能造成腎功能損害，術(shù)后一年僅部分功能恢復(fù)。

綜上所述，通過(guò)研究Cyp-D介導(dǎo)的線粒體功能障礙在大鼠腎缺血再灌注損傷中作用的發(fā)現(xiàn)，Cyp-D作為損傷蛋白能早期較好的反應(yīng)缺血再灌注損傷的程度，明確腎熱缺血再灌注時(shí)間，為臨床阻斷腎臟血流及器官移植提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)其過(guò)度表達(dá)誘導(dǎo)MPTP不可逆開放，可作為缺血再灌注損傷的作用靶點(diǎn)，對(duì)防止腎缺血再灌注損傷具有重要的臨床意義。