郭亞軍，沈殿晶，趙 明，范添樂，王智超，陳小軍

(1 揚州市江都區(qū)農(nóng)業(yè)技術綜合服務中心，江蘇 揚州 225200； 2 揚州大學 園藝與植物保護學院/農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 揚州 225009)

中空微球是一種具有特殊結構的納米材料，與相似大小的材料相比，中空微球具有相對密度低、原材料使用少等優(yōu)點。但是，當中空微球表面沒有孔道時，內(nèi)腔藥物很難釋放出來，因此微球孔道的連通性至關重要[1-2]。中空介孔二氧化硅納米粒子(Hollow mesoporous silica nanoparticles, HMSNs)具有介孔和中空內(nèi)腔結構的雙重特點，并且其比表面積可觀以及具有較好的生物相容性和穩(wěn)定性，是負載農(nóng)藥的良好載體[3-6]。近年來，研究者也證明了HMSNs負載農(nóng)藥能夠提高農(nóng)藥利用效率。Gao等[7]以HMSNs為載體，制備出一種對pH敏感的阿維菌素納米農(nóng)藥，結果顯示HMSNs能夠大大提高阿維菌素的持效期。Tan等[8]通過硬模板法制備出粒徑為 80～100 nm 的 HMSNs，負載烯效唑的HMSNs具有良好的控釋特性，對水稻生長的阻滯作用有所改善。HMSNs的形成過程中，合成的模板起到了至關重要的作用，按照模板的合成機理主要可以分為硬模板法[9-12]、軟模板法[13-16]和自模板法[17-19]。自模板法的優(yōu)點在于可以以自身為模板，采用刻蝕劑進行刻蝕，從而轉換為HMSNs，便捷高效，不添加其他化學藥劑。

魚藤酮(Rotenone)是一種植物源殺蟲劑，對薊馬Thrips、蚜蟲Aphids和菜青蟲Pieris rapae等蔬菜害蟲具有良好的殺蟲活性[20-21]。但是，魚藤酮在環(huán)境中不穩(wěn)定，容易發(fā)生光解和水解，持效期短。此外，施藥后，只有少量魚藤酮進入植物體內(nèi)，利用率和防治效果大大降低。據(jù)統(tǒng)計，截至2021年2月，魚藤酮在中國取得登記的制劑產(chǎn)品有20個，原藥產(chǎn)品有2個[22]，未有相關魚藤酮納米劑型登記。斜紋夜蛾Spodoptera litura為鱗翅目夜蛾科雜食性害蟲，寄主植物廣泛，多達300多種[23]，主要危害十字花科蔬菜、煙草、花生、大豆、甘薯等大田農(nóng)作物。研究人員通過試驗發(fā)現(xiàn)，7.5%(w)魚藤酮乳油對斜紋夜蛾3齡幼蟲具有較高防效[24]，但是其在環(huán)境中的持效期較短。為了延長魚藤酮的持效期，提高其有效利用率，本研究采用自模板法，在合成實心介孔二氧化硅的基礎上，以水為刻蝕劑，通過調(diào)整刻蝕的時間與溫度，制備出粒徑250 nm、分散程度良好、內(nèi)腔體積較大以及介孔結構明顯的HMSNs，再采用溶劑揮發(fā)法制備負載魚藤酮的HMSNs納米顆粒(Rot＠HMSNs)，旨在提高魚藤酮的穩(wěn)定性、在植株中的吸收和傳導能力以及殺蟲活性。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

魚藤酮標準品(w為98%)購自美國Sigma-Aldrich公司；魚藤酮原藥(w為95.0%)購自豐順縣湯西嘉興福利化工廠；十六烷基三甲基氯化銨(CTAB，w為99%)、氨水(w為25%)、無水乙醇和正硅酸四乙酯(TEOS)購自國藥集團化學試劑有限公司；異硫氰酸熒光素(FITC)購自北京索萊寶科技有限公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，w為98%)購自阿拉丁(上海)有限公司；魚藤酮微乳劑(w為6%) 購自北京三浦百草綠色植物制劑有限公司。

S-4800Ⅱ場發(fā)射掃描電鏡，日本日立公司；Tecnai 12透射電鏡，荷蘭Philips公司；激光光散射儀，德國ALV公司；Autosorb IQ3比表面分析及孔徑綜合分析儀，美國Quantachrome Instruments公司；Tensor 27傅里葉紅外光譜儀，布魯克光譜儀器公司；L-2000型高效液相色譜，日本Hitachi公司；TEMBS210S型電子天平，德國Sartorius公司；H/T-16MM臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；Milli-Q超純水器，美國Millipore公司；SB25-12DTN型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技有限公司；LSM 880NLO雙光子激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司公司。

1.2 供試生物

斜紋夜蛾購自河南省濟源白云實業(yè)有限公司。在室內(nèi)培養(yǎng)3代后用于試驗，具體養(yǎng)殖條件為：使用紗網(wǎng)制作產(chǎn)卵籠，每個產(chǎn)卵籠放入20頭蟲蛹，將產(chǎn)卵籠置于光照培養(yǎng)箱中，設置光照12 h，溫度保持在25 ℃，保持濕度76%左右，成蟲孵出后，用棉球蘸取15%(w)的蜂蜜水為成蟲提供營養(yǎng)，將醫(yī)用紗布置于底部，每天收集紗布中的卵，剪下有卵部分，置于養(yǎng)蟲盒中，并加入飼料，以待幼蟲長至3齡期。

黃瓜的種植，先采用w為5%的H2O2將種子表面消毒30 min，然后采用去離子水徹底沖洗干凈；無菌種子在經(jīng)去離子水濕潤的濾紙上培養(yǎng)7 d后，將幼苗移栽到有營養(yǎng)土壤和蛭石的5 L塑料盆中。當植株發(fā)育出第5片葉子時進行試驗，采用涂抹法進行施藥處理。

1.3 試驗方法

1.3.1 HMSNs 和載魚藤酮 HMSNs(Rot＠HMSNs)的合成 采用自模板法[25]，先合成實心介孔二氧化硅 (Mesoporous silica nanoparticles, MSNs)，再以水為刻蝕劑，通過控制刻蝕的時間和溫度，合成HMSNs。將 0.16 g CTAB、26 mL 的無水乙醇和 55 mL的去離子水加入到圓底燒瓶中，混合攪拌使CTAB充分溶解，5 min 后加入 1 mL 氨水，然后以 1 mL/min的速率滴加1 mL的TEOS到上述混合溶液中，使其反應完全，保持室溫，待混合液混合反應3 h后，離心收集沉淀，將沉淀分別用乙醇和去離子水洗滌3次，即得到實心二氧化硅納米粒子，將合成得到的實心介孔二氧化硅納米粒子加入到100 mL的去離子水中，在60 ℃條件下持續(xù)攪拌24 h，隨后離心收集沉淀，用去離子水洗滌3次，即得到HMSNs。

分別稱取 200 mg 魚藤酮和 100 mg HMSNs進行載藥，具體步驟參考文獻[24]的載藥方法。

1.3.2 HMSNs和 Rot＠HMSNs 的表征 采用多種手段對HMSNs和Rot＠HMSN進行表征，具體參考文獻[26]的方法，包括采用掃描電鏡和透射電鏡進行形貌分析；采用激光散射儀進行粒徑分析；采用比表面積測定儀測定物理吸附特性；采用傅里葉紅外光譜對其是否制備成功進行分析。

1.3.3 Rot＠HMSNs 載藥率的測定 載藥率的測定參考文獻 [26]的方法，稱取 5 mg Rot＠HMSNs，加入25 mL乙腈，超聲分散2 h，使所載的魚藤酮完全從HMSNs中釋放出來，試驗重復3次。魚藤酮的含量采用高效液相色譜儀進行檢測，具體檢測條件參考文獻[27-28]。

1.3.4 Rot＠HMSNs的緩釋性能測定 取 50 g 黃瓜植株提取液，加入100 mL含30%(φ)乙腈的去離子水，制備成稀釋的黃瓜汁液，以其作為釋放溶液模擬其釋放環(huán)境，探究Rot＠HMSNs在植物體內(nèi)的釋放特性，方法參考文獻[26]。為了進一步分析其釋放行為和合理解釋農(nóng)藥的釋放規(guī)律，采用4種釋放模型進行擬合分析，分別是零階釋放模型[29]、一階釋放模型散[30]、Higuchi釋放模型[29]和Ritger-Peppas釋放模型[31]。

1.3.5 Rot＠HMSNs的殺蟲活性 以斜紋夜蛾 3 齡幼蟲為供試材料，將Rot＠HMSNs分散于含1.0 g/L吐溫-80的去離子水溶液中，分別配制成500、250、125、62.5和31.25 mg/L的梯度溶液。試驗選取直徑為6 cm的新鮮甘藍葉片，將甘藍葉片分別浸潤于5種溶液中30 s，拿出后待葉片晾干，置于培養(yǎng)皿中。分別選取15頭健康的斜紋夜蛾3齡幼蟲放入培養(yǎng)皿中，喂養(yǎng)24、48、72 h后觀察幼蟲的存活情況，每個濃度設置3組重復，并且設置5 g/L的魚藤酮微乳劑為對照組。隨后利用濃度和死亡率計算出對應的毒力回歸曲線，計算致死中濃度LC50。

1.3.6 FITC 標記的 HMSNs(FITC-HMSNs)的合成為了示蹤HMSNs在黃瓜植物中的系統(tǒng)分布，采用APTES作為交聯(lián)劑將熒光素FITC接枝到HMSNs上，得到FITC-HMSNs的可視化研究。FITC-HMSNs的合成參照 Hussain 等[32]的方法。將 20 mg HMSNs、20 mL 二甲基甲酰胺和 10 μL APTES 混合后，劇烈攪拌1 d，用乙醇洗滌3次后去除多余ATPES。隨后將功能化 HMSNs與 10 mL 乙醇和 1 mg FITC 混合，繼續(xù)劇烈攪拌1 d，最后分別用去離子水和乙醇洗滌3次，得到FITC-HMSNs。

1.3.7 FITC-HMSNs 的施藥、取樣和可視化觀察取種植的黃瓜植株進行內(nèi)吸傳導性試驗，用毛筆將已配制好的200 mg/L的FITC-HMSNs懸浮液輕輕涂布在植株中部的成熟葉片上，待葉片上藥液變干后，再重復涂布一定體積的藥劑，葉片上涂布的藥液總量為0.5 mL。施藥24 h后，分別采集處理葉片的葉柄、上部莖稈、下部莖稈和根，并將各部位的切片置于共聚焦顯微鏡下觀察，可視化觀察HMSNs在黃瓜植株中的系統(tǒng)分布情況。

1.3.8 黃瓜植株的前處理方法 分別稱取 1 g 黃瓜葉片或根于勻漿杯中，加入5 mL乙腈，在勻漿器中高速勻漿 1 min，隨后加入 0.3 g 氯化鈉和 1.2 g無水硫酸鎂，旋渦振蕩，4 000 r/min 離心 5 min；取上清液 2 mL 到盛有 150 mg 無水硫酸鎂、50 mg PSA 和 25 mg C18 的離心管中，4 000 r/min 離心 5 min；取上清液 0.70 mL，加入 0.30 mL 水后混勻，0.22 μm有機相濾膜過濾處理，高效液相色譜儀檢測分析。

1.3.9 Rot＠HMSNs中魚藤酮在黃瓜植株中的系統(tǒng)分布 施藥方法同“1.3.7”。待涂布 0、1、3、5、7、10和14 d后，分別取涂布藥液的成熟葉片、涂藥葉片上部葉片、涂藥部位下部葉片和根。同時分別設置6 g/L的魚藤酮微乳劑、清水的對照處理組，每處理重復3次。采集處理黃瓜植株的各部位，經(jīng)樣品前處理后，采用HPLC檢測分析各處理植株各部位中的魚藤酮含量。并采用轉移因子(TFs)[33]評價Rot＠HMSNs在黃瓜植株中的轉移能力，轉移因子的計算公式分別為：

式中，TF1、TF2和TF3分別為上部葉、下部葉和根的轉移因子；ρ1、ρ2、ρ3和ρ4分別為上部葉、下部葉、根和處理葉的魚藤酮質量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用SPSS25.0對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，并通過單因素方差分析(ANOVA)對試驗數(shù)據(jù)進行處理，用LSD法比較處理組及對照組之間的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 HMSNs和 Rot＠HMSNs的表征

掃描電鏡的觀察結果顯示，所制備的HMSNs呈球形、粒徑大小均勻、表面結構粗糙，具有致密的介孔結構(圖1A、1B)。進一步的透射電鏡觀察結果顯示，HMSNs的粒徑均一、介孔結構清晰以及內(nèi)腔空間可觀(圖1C)。負載魚藤酮之后，HMSNs的內(nèi)腔空間變小，陰影部分面積加深，說明魚藤酮被成功負載(圖1D)。

圖1 電鏡圖Fig. 1 Electron micrograph

激光光散射儀分析結果表明HMSNs和Rot＠HMSNs在水中具有良好的分散性，并且載藥后的Rot＠HMSNs具有和HMSNs相似的粒徑(圖2A)。從圖2A可知，HMSNs的粒徑分布較為集中，粒徑主要在250 nm左右。同樣地，Rot＠HMSNs的粒徑分布也較為集中，也主要為250 nm。此外，Rot＠HMSNs在 5 000 nm左右存在 1 個弱峰，這可能是由于部分的HMSNs在載魚藤酮以后發(fā)生了團聚。HMSNs和Rot＠HMSNs的聚合物分散系數(shù)分別為0.259和0.367。上述研究結果表明本研究采用的載藥方法在達到可觀的載藥率的同時，還能保持相似的粒徑。

圖2 HMSNs 和 Rot＠HMSNs 的表征分析Fig. 2 Characterization analysis of HMSNs and Rot＠HMSNs

HMSNs等溫線為典型的Ⅳ型等溫曲線，分壓在0.3～1.0時，出現(xiàn)了1個長而寬的H4類滯后環(huán)(圖2B)，表明其具有平行板結構的介孔。Rot＠HMSNs的等溫線由于魚藤酮分子的填充而改變，其吸附量遠遠小于HMSNs。研究表明HMSNs的比表面積為 999.4 m2/g，孔容積為 0.62 cm3/g，孔徑為 3.3 nm，而Rot＠HMSNs的比表面積等各項指標都因魚藤酮的負載而急劇下降，比表面積為21.8 m2/g，孔容積為 0.16 cm3/g，孔徑為 3.1 nm，因此也證明了魚藤酮成功占據(jù)了HMSNs的介孔結構。

紅外光譜測定結果顯示Rot＠HMSNs在相應的位置出現(xiàn)了魚藤酮和HMSNs的特征峰，在457、813 cm-1處出現(xiàn)了 Si—O 鍵對稱伸縮峰；在 1 085 cm-1處出現(xiàn)了 Si—O—Si反對稱伸縮振動峰，3 658 cm-1處的弱峰為結構水—OH反對稱伸縮振動峰；另外在1 454、1 514、1 610 和 1 674 cm-1處出現(xiàn)了與魚藤酮相同的特征吸收峰(圖2C)，為苯環(huán)的振動峰[34]。由此可以證明，魚藤酮成功負載到HMSNs孔道中，且未發(fā)生氧化光解等變化。此外，并未發(fā)現(xiàn)模板劑CTAB的特征峰，說明模板劑已經(jīng)完全去除。通過HPLC檢測超聲2 h后含有Rot＠HMSNs乙醇溶液的魚藤酮含量，結果表明HMSNs的載藥率為46.7%。

2.2 Rot＠HMSNs 的釋放性能

釋放時間在0～10 h時，魚藤酮的釋放量略大于Rot＠HMSNs，此時由于HMSNs孔道的束縛和大量魚藤酮聚集于HMSNs內(nèi)腔中，限制了魚藤酮的釋放。當釋放時間大于10 h后，HMSNs表面和孔道中的魚藤酮已經(jīng)完全釋放，內(nèi)腔的魚藤酮釋放不再受到限制，釋放量開始大于魚藤酮原藥，在168 h后Rot＠HMSNs的魚藤酮釋放量達到74%，魚藤酮原藥的釋放量為67%，并且還有緩慢上升的趨勢(圖2D)。由表1可知，在4種擬合模型中，Rot＠HMSNs的釋放曲線在Ritger-Peppas擬合模型下具有最高的擬合度，決定系數(shù)為 0.990 3，Rot＠HMSNs擬合方程的n值為0.44，介于0.43～0.85，符合不規(guī)則擴散行為，說明其釋放過程中Rot＠HMSNs的釋放行為存在Fickian擴散和骨架的溶蝕擴散，這是因為HMSNs的合成方法是通過刻蝕法，將實心MSNs轉變?yōu)镠MSNs，在釋放過程中，受到釋放介質的侵蝕，球體表面破裂，魚藤酮從HMSNs中釋放出來。

表1 魚藤酮和 Rot＠HMSNs的釋放曲線擬合結果Table 1 The release curve fitting results of rotenone and Rot＠HMSNs

2.3 Rot＠HMSNs的殺蟲活性

由表2可知，空白HMSNs對斜紋夜蛾3齡幼蟲的 LC50遠大于 1 000 mg/L；Rot＠HMSNs對斜紋夜蛾3齡幼蟲處理24、48和72 h的LC50分別為133.8、104.5 和 84.0 mg/L，并且其殺蟲活性高于5 g/L的魚藤酮微乳劑，說明Rot＠HMSNs具有更好的持效性和殺蟲活性。取食HMSNs處理的甘藍葉片以后，斜紋夜蛾3齡幼蟲出現(xiàn)了行動緩慢、體積縮小和不取食葉片等現(xiàn)象，說明HMSNs作為魚藤酮載體具有一定的增效作用。

表2 HMSNs 和 Rot＠HMSNs 對斜紋夜蛾的殺蟲活性Table 2 Insecticidal activity of HMSNs and Rot＠HMSNs against Spodoptera litura

2.4 HMSNs在黃瓜植株中的吸收和傳導特性

通過激光共聚集顯微鏡觀察到，在經(jīng)過FITCHMSNs葉面處理24 h以后，在黃瓜植株的處理葉葉柄、處理葉以上部位莖稈、處理葉以下部位莖稈和根部均能夠發(fā)現(xiàn)較強的綠色熒光，綠色熒光主要集中在植株的細胞壁和維管束，只有少量出現(xiàn)在細胞中，這是由于FITC-HMSNs粒徑的限制，無法通過細胞壁的孔進入細胞內(nèi)部(圖3)。為了去除黃瓜植株自發(fā)綠色熒光帶來的干擾，本研究采用雙光子激發(fā)，紅色熒光顯示的即為植物葉綠體，而綠色熒光與紅色熒光不重合部分即為被植物吸收的FITCHMSNs，說明HMSNs都能被黃瓜葉片吸收，從而傳導到黃瓜植株各個部位，具有負載輸送農(nóng)藥的巨大潛力。

圖3 施用 FITC-HMSNs 24 h 后黃瓜植株各部位的激光共聚焦圖Fig. 3 Figures of various parts of cucumber plant 24 h after applying FITC-HMSNs using laser confocal microscope

2.5 Rot＠HMSNs 在黃瓜植株中的吸收和傳導特性

高效液相色譜儀檢測分析結果表明，在處理葉片中Rot＠HMSNs處理組的魚藤酮含量遠大于魚藤酮微乳劑處理組，并且在14 d以后還能檢測出大量的魚藤酮，而魚藤酮微乳劑處理組7 d后已經(jīng)檢測不到魚藤酮。上部葉片只有在1、3和5 d檢測到魚藤酮，并且Rot＠HMSNs處理組的魚藤酮含量遠低于魚藤酮微乳劑處理組的含量，說明Rot＠HMSNs中心魚藤酮向上傳導量較低(圖4)。但是，Rot＠HMSNs處理組的黃瓜下部葉片和根部均檢測出魚藤酮的存在，并且其含量遠高于魚藤酮微乳劑處理組的含量。研究結果表明Rot＠HMSNs具有一定的向上和向下傳導的能力，但上部葉片的轉移因子遠小于下部葉片和根，轉移因子的值越大傳導能力越強(表3)，因此Rot＠HMSNs中心魚藤酮在植株中向下傳導的能力遠大于向上傳導的能力。

圖4 黃瓜植株各部位中魚藤酮的含量Fig. 4 Content of rotenone in various parts of cucumber plants

表3 不同處理時間 Rot＠HMSNs 在黃瓜植株不同部位中的轉移因子Table 3 Transfer factors of Rot＠HMSNs in different parts of cucumber plant under different treatment time

由Rot＠HMSNs和魚藤酮微乳劑處理組的黃瓜植株中魚藤酮的總含量分布圖(圖5)可知，Rot＠HMSNs處理過后，魚藤酮在黃瓜中的總含量遠大于魚藤酮微乳劑處理組。雖然魚藤酮微乳劑處理組的黃瓜植株能夠使少量魚藤酮被植物吸收，但是大量的魚藤酮在施加到處理葉片后，直接裸露于環(huán)境中，容易受到光照、空氣和水等環(huán)境因素的影響，導致魚藤酮無法到達目標部位，大大降低了利用率。然而HMSNs能夠大量負載魚藤酮于孔道和內(nèi)腔中，避免魚藤酮受外界環(huán)境影響而發(fā)生光降解、水解和氧化等反應，有利于加強魚藤酮的穩(wěn)定性，提高持效期，從而提高魚藤酮的有效利用率。對施藥黃瓜植株的果實進行了魚藤酮含量測定，結果顯示黃瓜果實中的魚藤酮濃度低于檢出限0.004 mg/L(在本色譜條件下，魚藤酮在0.01～25 mg/L內(nèi)峰面積與其質量濃度間線性關系良好)，即黃瓜果實中魚藤酮的殘留量小于0.04 mg/kg，我國規(guī)定的魚藤酮在結球甘藍中的最大殘留限量為0.5 mg/kg[35]，此時收獲的黃瓜食用安全。

圖5 黃瓜植株中魚藤酮的總含量Fig. 5 Total content of rotenone in cucumber plants

3 結論

采用自模板合成法，制備的HMSNs具有較小的粒徑，對魚藤酮的載藥率達46.7%，所制備的Rot＠HMSNs的粒徑均一，具有較好的分散性和緩釋釋放特性，增強了魚藤酮對斜紋夜蛾的殺蟲活性，且納米載體HMSNs有效促進了魚藤酮在黃瓜植株中的吸收和傳導。本研究對減少農(nóng)藥的使用量、降低環(huán)境污染、保障糧食、蔬菜食品及生態(tài)安全，促進農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展均具有重要意義。