葛欣竺，史宇星，王莎莎，劉智慧，蔡文杰，周敏，王世貴，唐斌

杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 311121

0 引言

【研究意義】相比于使用化學農(nóng)藥控制害蟲，天敵昆蟲在控制害蟲發(fā)生、防止抗藥性產(chǎn)生、保護環(huán)境、維持生態(tài)平衡等方面具有明顯優(yōu)勢。在捕食性瓢蟲中，異色瓢蟲（Harmonia axyridis）廣泛分布于中國各地，是一類重要的天敵昆蟲資源。但對該物種的開發(fā)利用一直受到各種因素的制約，比如人工飼料。昆蟲的生長發(fā)育與能量代謝密切相關(guān)，因此，探究異色瓢蟲的能量代謝有助于促進天敵昆蟲應用于害蟲防治?！厩叭搜芯窟M展】糖酵解是葡萄糖氧化的主要代謝途徑，為其他途徑提供能量和中間前體。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PYK）能催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為烯醇式丙酮酸，并產(chǎn)生ATP[1]。且丙酮酸激酶負責調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生之間的平衡[2]，因此它是能量代謝過程中的一個關(guān)鍵酶。據(jù)報道，大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）和棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）在滯育期間體內(nèi)主要的代謝酶為丙酮酸激酶[3-4]。美洲蟑螂（Periplaneta americana）和沙漠蝗（Schistocerca gregaria）的飛行肌肉中丙酮酸激酶的酶促反應符合 Michaelis-Menten動力學[5-6]。PAPADOPOULOS等研究發(fā)現(xiàn)，面對各種生理變化，比如傷害、饑餓、殺蟲劑、注射丙酮，黃粉蟲（Tenebrio molitor）體內(nèi)丙酮酸激酶的動力學特征發(fā)生變化[7]。丙酮酸激酶作為在糖酵解過程中催化形成第二個ATP反應的酶，在丙酮酸穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和昆蟲生命活動方面起著重要作用。在昆蟲中，海藻糖是一種非還原性的二糖，主要在脂肪體內(nèi)合成，既是一種貯藏性碳水化合物，也是應激代謝的重要產(chǎn)物[8]。海藻糖作為昆蟲的血糖，其在昆蟲生長發(fā)育和抵抗逆境方面扮演著重要的角色[9-10]。對于昆蟲，尿苷二磷酸葡萄糖和 6-磷酸葡萄糖首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的催化下合成 6-磷酸海藻糖，接著在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）催化下去磷酸化生成海藻糖，該過程被稱為 TPS/TPP途徑[9,11]。海藻糖酶（trehalase，TRE）是昆蟲體內(nèi)能夠水解海藻糖的酶類，每個海藻糖分子都可以通過海藻糖酶水解為兩個葡萄糖分子[11]。迄今為止，已鑒定出兩種形式的海藻糖酶，分別為可溶性海藻糖酶（TRE1）和在 N-羥基上具有跨膜結(jié)構(gòu)的膜結(jié)合型海藻糖酶（TRE2）[9,12-13]?！颈狙芯壳腥朦c】昆蟲海藻糖代謝是能量代謝的重要部分，不僅異色瓢蟲丙酮酸激酶基因（HaPYK）未見報道，而且有關(guān)丙酮酸激酶在海藻糖代謝中的功能研究幾乎空白?！緮M解決的關(guān)鍵問題】分析異色瓢蟲 HaPYK的序列特征和結(jié)構(gòu)，進一步抑制HaPYK在mRNA水平上的表達，檢測對海藻糖代謝的影響，為理解丙酮酸代謝與海藻糖代謝之間的聯(lián)系及后續(xù)研究 HaPYK在異色瓢蟲體內(nèi)的其他生物學功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗于2020年5月至2021年4月在杭州師范大學完成。

1.1 供試材料

將2020年5—7月從杭州師范大學倉前校區(qū)及周邊田間采集得到的異色瓢蟲與本實驗室長期飼養(yǎng)的種群混合飼養(yǎng)。首先種植蠶豆苗供豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）取食，然后將接有蚜蟲的蠶豆苗放入養(yǎng)蟲籠里供異色瓢蟲取食。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度（70±5）%，光周期為14L∶10D。

1.2 HaPYK序列的生物信息學分析

從異色瓢蟲全基因組中獲得3條HaPYK序列，然后用在線工具ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測 HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2（GenBank登錄號：MZ327965、MZ327966、MZ327967）的開放閱讀框；利用ExPASy的ProtParam在線分析軟件（http://web.expasy.org/protparam/）對氨基酸序列進行理化性質(zhì)的預測；使用NCBI CD Search在線分析軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對HaPYK氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進行預測；用SOPMA在線分析軟件（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?apge=npsa_gor4.html）進行二級結(jié)構(gòu)預測；用 Biozentrum SWISS-MODEL在線分析軟件（http://www.swissmodel.expasy.org/）進行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預測；利用MEGA 5軟件的鄰接法構(gòu)建丙酮酸激酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3 雙鏈RNA合成

首先，采用Trizol法提取異色瓢蟲總RNA[14]，然后制備 1%的瓊脂糖凝膠用于電泳以檢測抽提出的總RNA的質(zhì)量，使用微量核酸測定儀NanoDropTM2000測定 RNA的濃度和純度。接著使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA的第一條鏈。

采用Primer 5軟件設(shè)計3個HaPYK雙鏈RNA（dsRNA）特異性引物用于 PCR反應（表 1），1%的瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產(chǎn)物。對特異性且片段大小合適的條帶進行切膠回收，根據(jù)膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0說明書的方法進行操作。使用載體pMD?18-T和DH5α感受態(tài)細胞對回收得到的PCR產(chǎn)物進行連接轉(zhuǎn)化，隨后將經(jīng)過菌落PCR驗證后的菌液送往浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進行測序并返回質(zhì)粒。使用帶T7啟動子的引物對測序正確的質(zhì)粒進行交叉PCR反應，接著根據(jù)dsRNA合成試劑盒Promega T7 RiboMAXTMExpress RNAi System說明書方法合成目的基因的dsRNA。同時，以注射綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的dsRNA為對照組，用相同的方法合成dsGFP。

表1 dsRNA合成和實時熒光定量PCR所需引物Table 1 Primers used for dsRNA synthesis and real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR)

1.4 顯微注射dsRNA

使用Eppendorf TransferMan? 4r顯微注射系統(tǒng)進行注射。注射齡期為羽化第1天的瓢蟲成蟲，未區(qū)分雌雄；注射部位為瓢蟲成蟲腹部柔軟部位；注射量為600 ng（濃度約5 000 ng·μL-1），注射后分別于48、72 h取材用于后續(xù)試驗，試驗材料未區(qū)分雌雄。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用TaKaRa TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒檢測，PCR反應體系（20 μL）為正反向引物各1 μL，TB Green試劑10 μL，異色瓢蟲cDNA 2 μL，滅菌水6 μL。PCR反應程序為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸20 s，40個循環(huán)。以核糖體蛋白質(zhì) 49（ribosomal protein 49，rp49；GenBank 登錄號：AB552923）為內(nèi)參基因[15]，qRT-PCR數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法進行分析[16]。

1.6 糖含量與海藻糖酶活性的檢測

將注射后3只成蟲放進同一個離心管中，并進行3次生物學重復。每個樣品先加入200 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）超聲破碎30 min，然后用PBS溶液補足至1 000 μL。在4℃，1 000×g條件下離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到兩個離心管中，各350 μL。一部分上清液用于檢測海藻糖、糖原、蛋白質(zhì)含量，另一部分上清液在4℃，20 800×g條件下繼續(xù)離心60 min。然后取300 μL上清液用于檢測葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及可溶性海藻糖酶活性，向原離心管中加入300 μL PBS混勻制成懸浮液，用于檢測葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及膜結(jié)合型海藻糖酶活性。海藻糖含量通過蒽酮法檢測，葡萄糖、糖原、酶活性的測定使用 Sigma葡萄糖分析試劑盒，蛋白質(zhì)含量使用貝博BCA試劑盒檢測。具體試驗步驟參考文獻[14]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2010軟件整理和分析試驗數(shù)據(jù)。以dsGFP注射組為對照，采用IBM SPSS Statistics 20軟件中獨立樣本T檢驗分析差異顯著性，*：P＜0.05，**：P＜0.01。使用 GraphPad Prism version 8.4.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 HaPYK理化性質(zhì)

對3條異色瓢蟲HaPYK的mRNA序列進行生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的開放閱讀框分別為1 350、1 569、1 656 bp，蛋白大小分別為449、522、551 aa，其他具體信息見表2。

表2 HaPYK序列的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of HaPYK sequences

2.2 HaPYK序列結(jié)構(gòu)預測

HaPYK1-1和HaPYK1-2氨基酸有兩個特異性位點，分別是pyruv_kin和PykF（圖1-A、1-B）。3條HaPYK均為Pyruvate_kinase超家族成員（圖1）。利用SOPMA對3條HaPYK蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測（圖2），發(fā)現(xiàn)HaPYK的開放閱讀框蛋白序列的二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（藍色）和無規(guī)則卷曲（紫色），另外也含有延伸鏈（紅色）和β-轉(zhuǎn)角（綠色）。HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2預測得到α-螺旋所占比例分別為37.64%、36.02%、35.93%；無規(guī)則卷曲所占的比例分別為30.73%、34.87%、36.48%；延伸鏈所占比例分別為21.60%、20.50%、19.96%；β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為10.02%、8.62%、7.62%。圖3為三維結(jié)構(gòu)預測結(jié)果，HaPYK1-1基于Template 6du6.1.A建立，序列同源性為72.79%，建模范圍為2—440；HaPYK1-2和HaPYK2均基于Template 1aqf.1.A建立，序列同源性分別為52.64%和33.08%，建模范圍分別為12—522、26—538。3條序列的寡聚物類型均為同源四聚體。

2.3 HaPYK的進化樹分析

選取赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、德國小蠊（Blattella germanica）、東方黏蟲（Mythimna separata）等昆蟲的丙酮酸激酶采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)進化樹（圖 4）。結(jié)果表明，HaPYK1-1和HaPYK1-2聚在一支，與同為鞘翅目的馬鈴薯甲蟲 PYK1（LdPYK1）親緣關(guān)系更近。而HaPYK2與同為鞘翅目的赤擬谷盜PYK（TcPYK）聚為一支。

2.4 異色瓢蟲目的基因干擾效果評價

注射dsHaPYK1-1后，在48和72 h檢測到HaPYK1-1和HaPYK1-2在mRNA水平的表達量極顯著降低，而HaPYK2在48 h表現(xiàn)為極顯著升高（P＜0.01）（圖5）。當注射dsHaPYK1-2后，靶標基因HaPYK1-2在兩個時間點的檢測結(jié)果均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)（圖 5-B）。另外，HaPYK2的表達水平也受到影響，在48和72 h檢測結(jié)果為顯著升高（P＜0.05）。而注射 dsHaPYK2組與對照組相比，僅在48 h時HaPYK2極顯著下調(diào)，在72 h后HaPYK2表達量上升，抑制作用減弱（圖5-C）。

2.5 RNAi后對海藻糖代謝途徑相關(guān)基因表達量的影響

研究結(jié)果顯示，當抑制HaPYK1-1表達后72 h，qRT-PCR檢測得到僅HaTRE1-4的表達水平顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖6-D），多個基因表現(xiàn)為上調(diào)，其中包括 HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS（圖6-A、6-B、6-F、6-H）。dsHaPYK1-2組與對照dsGFP注射組相比，在48 h檢測到HaTRE1-1、HaTRE1-3、HaTPS在mRNA水平的表達量顯著升高（圖6-A、6-C、6-H），在 72 h檢測到 HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS表達水平也顯著升高（圖6-A、6-B、6-E、6-G、6-H）。注射 dsHaPYK2后，與對照組相比，在48 h發(fā)現(xiàn)僅HaTRE1-1的表達量極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖 6-A），而 HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5的表達水平顯著下降（圖6-C、6-D、6-E），在 72 h發(fā)現(xiàn) HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2-like、HaTRE2的表達水平均表現(xiàn)為顯著或極顯著下調(diào)（圖6-C、6-E、6-F、6-G）。

2.6 HaPYK RNAi后對海藻糖酶活性的影響

與對照組相比，僅dsHaPYK1-2組的可溶性海藻糖酶的活性在48 h表現(xiàn)為極顯著減弱（P＜0.01）（圖7-A）。根據(jù)圖7-B結(jié)果顯示，與注射dsGFP組相比，注射后72 h dsHaPYK組膜結(jié)合型海藻糖酶的活性均有所上升，其中dsHaPYK1-1和dsHaPYK2組具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.7 HaPYK RNAi后葡萄糖、海藻糖及糖原含量的變化

與dsGFP組相比，注射dsHaPYK1-1和dsHaPYK2后48 h可以檢測到葡萄糖含量極顯著下降（P＜0.01），而 72 h葡萄糖含量在兩組中表現(xiàn)為顯著上升（P＜0.05）（圖 8-A）。在注射后 48 h，檢測結(jié)果顯示dsHaPYK1-2組海藻糖含量極顯著上升（P＜0.01），而dsHaPYK2組顯著降低；在注射后72 h，dsHaPYK1-1和dsHaPYK2兩組海藻糖含量均顯著升高（P＜0.05）（圖8-B）。糖原含量在注射dsHaPYK1-2或dsHaPYK2后48 h極顯著上升（P＜0.01）（圖8-C）。

3 討論

目前，丙酮酸激酶基因在多種生物體內(nèi)被鑒定和克隆，包括雙翅目埃及伊蚊[17]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[18]，半翅目褐飛虱（Nilaparvata lugens）[19]、桃蚜（Myzus persicae）[20]，等翅目黑胸散白蟻（Reticulitermes chinensis）[21]，鱗翅目家蠶（Bombyx mori）[22]。分析結(jié)果顯示異色瓢蟲3條HaPYK均屬于Pyruvate_kinase超家族（圖1），但在HaPYK2中未發(fā)現(xiàn)特異性位點，可能與所得的片段并非全長有關(guān)。在埃及伊蚊中鑒定出編碼丙酮酸激酶的兩種可變剪接的mRNA變體，即AaPYK1和AaPYK2[17]。蜜蜂和果蠅體內(nèi)也存在多條能編碼 PYK的基因[19]。本文根據(jù)編碼的蛋白與馬鈴薯甲蟲LdPYK1和LdPYK2的親緣關(guān)系（圖4），分別命名為HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2。張志林等研究表明，家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）丙酮酸激酶的蛋白二級結(jié)構(gòu)預測顯示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%的無規(guī)則卷曲[23]，同樣地，異色瓢蟲 HaPYK也具有這些特征，但所占比例存在差異。大多數(shù)情況下，PYK是以相同亞基的四聚體形式存在[24-25]，本研究結(jié)果與此一致（圖3）。

本研究首先檢測了靶標基因的表達水平是否被成功抑制。結(jié)果顯示，注射dsHaPYK1-1后48 h，不僅HaPYK1-1的表達水平顯著下降，HaPYK1-2的表達水平也受到影響，但抑制程度不及HaPYK1-1（圖5）。這可能是由于HaPYK1-1和HaPYK1-2的序列同源性較高，合成的 dsHaPYK1-1片段同時也作用于HaPYK1-2。合成的dsHaPYK1-2和dsHaPYK2的特異性高，只作用于靶標基因（圖 5）。由此可證明本研究 RNAi效果明顯，后續(xù)試驗結(jié)果可靠。但當HaPYK1-1和HaPYK1-2被抑制表達時，HaPYK2的表達水平顯著上升，推測HaPYK2可能具有協(xié)調(diào)平衡的作用。在弓形蟲（Toxoplasma gondii）中表達兩種PYK，雖然數(shù)據(jù)表明PYK1為主要酶，但是在PYK1耗盡時，PYK2就表現(xiàn)出其重要性[26]。由此可見，昆蟲可能通過調(diào)節(jié)多個PYK的表達水平來維持丙酮酸穩(wěn)態(tài)。

昆蟲的各類生命活動離不開能量代謝，其中海藻糖代謝尤為重要。研究證實，海藻糖用于細胞代謝之前必須先由海藻糖酶分解成葡萄糖，然后葡萄糖可用于合成糖原或者通過糖酵解以及戊糖磷酸途徑被分解[27]。糖原可經(jīng)過多步反應轉(zhuǎn)化為尿苷二磷酸葡萄糖，接著可在TPS和TPP的催化下合成海藻糖[14]。為滿足細胞需求，葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的速率受到己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的嚴格調(diào)控[25]。本研究結(jié)果表明，HaPYK與海藻糖代謝關(guān)鍵基因之間調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)。注射dsHaPYK1-1后48 h，所測基因的表達水平均無差異性變化，推測與檢測時間有關(guān)，影響可能延遲；進一步檢測72 h的影響情況，發(fā)現(xiàn)部分HaTRE的表達水平升高，而HaTRE1-4等基因表現(xiàn)為下調(diào)表達，推測以上結(jié)果綜合導致海藻糖酶（TRE）活性無顯著性變化（圖6、圖 7）。另外，dsHaPYK1-1注射組瓢蟲海藻糖在72 h時積累可能是受HaTPS表達水平增加的影響，但HaTRE的表達水平上調(diào)又促進海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖（圖6、圖8）。在dsHaPYK1-2組中，推測在可溶性海藻糖酶（TRE1）活性降低，HaTPS表達量增加的共同作用下使得48 h時海藻糖含量升高，之后在海藻糖酶的催化下海藻糖不斷被消耗利用，從而導致含量減少（圖6—圖8）。然而，生物體內(nèi)的調(diào)控機制是精密而復雜的，如dsHaPYK2組中2個HaTRE2的表達水平顯著下調(diào)，但膜結(jié)合型海藻糖酶（TRE2）的活性卻增加（圖6、圖7）。推測原因在于基因轉(zhuǎn)錄水平到酶代謝水平中間還存在有待研究的調(diào)控機制。此外，3個HaPYK單獨被RNAi后，引起3個基因的表達水平存在差異（圖5），進而導致對海藻糖代謝途徑的影響情況不同。在關(guān)于弓形蟲的研究中也提到，敲除PYK1后會提高丙酮酸上游的大多數(shù)糖酵解代謝物，包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸的豐度，而丙酮酸、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸的水平降低[26]。這些結(jié)果表明PYK在生物碳代謝中起著穩(wěn)態(tài)的作用。結(jié)合三唑磷和dsPYK處理，GE等檢測發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)可溶性糖含量降低[19]。除了 PYK外，磷酸果糖激酶（PFK）也是糖酵解通路的限速酶，邱玲玉研究發(fā)現(xiàn)調(diào)低其表達后，褐飛虱海藻糖酶基因 TRE1-1、TRE1-2、TRE2的表達量顯著下調(diào)，膜結(jié)合型海藻糖酶活性明顯下降，海藻糖含量無差異表現(xiàn)，葡萄糖和糖原含量顯著上升[28]。綜上可知，糖酵解與海藻糖代謝之間聯(lián)系緊密。實際上，不僅PYK可調(diào)控碳水化合物水平，反之碳水化合物水平也可對PYK產(chǎn)生影響。在哺乳動物中，PYK以4種不同的組織特異性同工酶L、R、M1和 M2類型存在[29]。FAN 等[30]在草魚（Ctenopharyngodon idella）中克隆得到3個PYK，分別為PYKL、PYKMa和PYKMb，且發(fā)現(xiàn)飼喂草魚高碳水化合物飼料會顯著提高 PYK的表達水平?？傮w來看，抑制PYK表達會對海藻糖代謝產(chǎn)生影響。

雌激素相關(guān)受體（ERR）在發(fā)育、能量代謝中起著不可或缺的作用，已有多篇論文證實ERR和糖酵解限速酶（己糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶）之間存在調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)，從而調(diào)控能量代謝影響昆蟲胚胎發(fā)育和繁殖力[20,22,31]。在埃及伊蚊和黑腹果蠅胚胎發(fā)生過程中，丙酮酸激酶的活性也被證明升高，表明在胚胎中糖酵解增加[18,32]。從中可以推斷出丙酮酸激酶可能在昆蟲繁殖力中起作用。GE等[19]研究表明，褐飛虱NlPYK可能通過增加葡萄糖代謝而在昆蟲繁殖力中起作用。然而，在異色瓢蟲中未見報道，將來可進一步研究HaPYK表達與成蟲繁殖力之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

異色瓢蟲體內(nèi)存在 3個 HaPYK，HaPYK屬于Pyruvate_kinase超家族，二級結(jié)構(gòu)較簡單，以相同亞基的四聚體形式存在。此外，通過RNAi技術(shù)能成功干擾靶標基因的表達水平，且抑制表達后海藻糖代謝會受到影響，但3個HaPYK的調(diào)控機制存在差異。