楊茜,鄭憲鑫,朱亮,唐錫龍,李永紅

(青島大學(xué),山東 青島 266100 1 附屬醫(yī)院心內(nèi)科；2 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；3 附屬醫(yī)院急診內(nèi)科)

心血管病是全球發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一。動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為是心血管疾病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[1]。血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)的死亡參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理生理過(guò)程[2]。鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種形式，以細(xì)胞內(nèi)鐵依賴(lài)性和脂質(zhì)活性氧(ROS)的積累為特征[3]。多種化學(xué)和生物因素都能誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡。erastin是一種能夠選擇性殺死表達(dá)小T癌蛋白和大鼠肉瘤蛋白的工程腫瘤細(xì)胞小分子化合物，也是一種高效的鐵死亡誘導(dǎo)劑[4]?；ㄉ南┧?5-脂氧合酶 (ALOX15)是一種酶,參與了早期的炎癥反應(yīng)[5]。研究表明，ALOX15誘導(dǎo)VSMCs在調(diào)節(jié)血管張力和血管壁重塑中發(fā)揮重要作用[6]。然而，ALOX15能否參與調(diào)控VSMC的鐵死亡途徑尚未明確。本研究旨在探討ALOX15對(duì)VSMCs鐵死亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人主動(dòng)脈VSMCs購(gòu)自美國(guó)ATCC公司;DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)緩沖液、胰酶、40 g/L多聚甲醛-通用型組織固定液購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司;胎牛血清(FBS)購(gòu)自中國(guó)吉泰依科賽公司;ALOX15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒購(gòu)自于上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;erastin購(gòu)自于美國(guó)Abmole公司;Lipfectamine 3000購(gòu)自賽默飛世爾科技公司；RIPA裂解液(高強(qiáng)度)、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒、Hoechst 33342/PI雙染試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;PAGE凝膠試劑盒購(gòu)于上海雅酶生物科技有限公司;ALOX15抗體購(gòu)自santa cruz生物技術(shù)有限公司,β-actin抗體及羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購(gòu)自affinity公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與處理 復(fù)蘇VSMCs后，加入含體積分?jǐn)?shù)0.10 FBS、100 mg/L青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)90%時(shí)傳代。

1.2.2Western blot檢測(cè)ALOX15蛋白表達(dá)水平在6孔板中培養(yǎng)VSMCs，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，將其分為對(duì)照組(A組，未處理)、空載組(B組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Empty Vector)、ALOX15組(C組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15)，轉(zhuǎn)染24 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，加入細(xì)胞裂解液并提取蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取等質(zhì)量蛋白樣品，在蛋白中加入適量的上樣緩沖液，在98 ℃金屬浴中加熱10 min。采用PAGE凝膠制備試劑盒制膠，每孔取30 μg蛋白進(jìn)行上樣。80 V恒壓電泳2.5 h，恒流(250 mA)轉(zhuǎn)膜1 h，將膜放置于質(zhì)量濃度為50 g/L脫脂奶粉封閉液中搖床孵育1 h。TBST洗滌(10 min，3次)，加入β-actin(1∶2 000)、ALOX15一抗(1∶2 000)，4 ℃過(guò)夜孵育。TBST洗滌(10 min，3次)后加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗滌(10 min，3次)后，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，通過(guò)Fusion Solos化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶，使用Image J軟件處理圖像,分析ALOX15蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.3PI染色檢測(cè)VSMCs死亡率 在24孔板中培養(yǎng)VSMCs，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時(shí)，分為對(duì)照組(未處理)、erastin組(加erastin)、Empty Vector+erastin組(轉(zhuǎn)染Empty Vector 12 h后加erastin)和質(zhì)粒ALOX15+erastin組(轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15 12 h后加erastin)。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15及Empty Vector，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求操作。各組處理完后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。將24孔板置于冰上，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗3次，用細(xì)胞固定液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定，30 min后棄掉細(xì)胞固定液，PBS洗3次，使用Hoechst 33342/PI雙染試劑盒檢測(cè)VSMCs死亡率，根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求操作。最后于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞死亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組ALOX15蛋白表達(dá)的比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組、空載組、ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)分別為0.26±0.03、0.20±0.02和1.09±0.06，與對(duì)照組和空載組比較，ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=425.2,P<0.01)。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15明顯上調(diào)了VSMCs中ALOX15的表達(dá)。見(jiàn)圖1。

A：對(duì)照組，B：空載組，C：ALOX15組。

2.2 過(guò)表達(dá)ALOX15對(duì)細(xì)胞死亡的影響

PI染色的結(jié)果顯示，對(duì)照組、erastin組、Empty Vector+erastin組和質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率分別為(0.60±0.36)%、(9.29±0.16)%、(9.79±0.59)%和(21.41±2.42)%，各組之間比較差異有顯著意義(F=138.1,P<0.01)。其中質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率明顯高于其他3組，差異有顯著性(t=8.098～14.760，P<0.01)。

3 討 論

伴隨著我國(guó)人民生活水平的明顯提高、城鎮(zhèn)化進(jìn)程的加速以及人口老齡化，心血管疾病的發(fā)病人數(shù)持續(xù)增加，其中以動(dòng)脈粥樣硬化為基礎(chǔ)病變的腦卒中和冠心病死亡率居高不下，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了腫瘤及其他疾病。動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展過(guò)程中，VSMCs等細(xì)胞的死亡發(fā)揮著重要作用[2]。包括動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病的病理生理過(guò)程涉及VSMCs的死亡[1]。因此，闡明VSMCs死亡的分子機(jī)制對(duì)改善血管疾病的治療有重要意義，有助于尋找新的治療靶點(diǎn)。盡管一些細(xì)胞死亡類(lèi)型如細(xì)胞凋亡、焦亡和自噬已被闡明和VSMCs功能相關(guān)[7],但VSMCs鐵死亡作用尚未明確。

本研究為了探討ALOX15對(duì)VSMCs鐵死亡的影響，首先構(gòu)建了erastin誘導(dǎo)VSMCs鐵死亡的細(xì)胞模型。erastin是一種鐵死亡誘導(dǎo)劑，能夠?qū)Π┘?xì)胞產(chǎn)生致命性損傷，這一功能是通過(guò)作用于線粒體電壓依賴(lài)性陰離子通道來(lái)發(fā)揮的[8]。在HT1080細(xì)胞中，erastin誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡引發(fā)了細(xì)胞ROS的累積，而且其誘導(dǎo)的氧化性死亡是鐵依賴(lài)性的。此外，非依賴(lài)性胱氨酸/谷氨酸逆向轉(zhuǎn)運(yùn)體系統(tǒng)的活性也能夠被erastin所抑制[9]。將VSMCs暴露于erastin后可觸發(fā)其鐵死亡。因此，應(yīng)用erastin誘導(dǎo)VSMCs鐵死亡是一種理想VSMCs鐵死亡模型。

在多種組織和腫瘤表達(dá)的脂氧合酶(LOXs)是一種非血紅素鐵雙加氧酶。癌細(xì)胞會(huì)積聚鐵，而鐵蛋白受體介導(dǎo)的細(xì)胞外途徑和鐵蛋白吞噬所涉及的細(xì)胞內(nèi)途徑提供的鐵對(duì)于促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡至關(guān)重要[10-12]。鐵可能直接催化脂質(zhì)自由基的形成和參與脂質(zhì)過(guò)氧化的傳播，但是由LOXs催化的脂質(zhì)氧化途徑產(chǎn)生的氧化多不飽和脂肪酸可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡[13]。ALOX15為L(zhǎng)OXs家族成員[5,14]，既往研究關(guān)注于ALOX15參與VSMCs的炎癥、增殖和遷移作用，但是ALOX15是否參與調(diào)控VSMCs中的鐵死亡尚不清楚。本研究Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組組和空載組比較，ALOX15組的ALOX15蛋白表達(dá)明顯升高，這表明在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15后VSMCs中的ALOX15表達(dá)明顯升高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證ALOX15是否也參與調(diào)控VSMCs的鐵死亡，本研究應(yīng)用PI染色檢測(cè)VSMCs死亡率。結(jié)果顯示，與對(duì)照組、erastin組、Empty Vector+erastin組相比較，質(zhì)粒ALOX15+erastin組細(xì)胞死亡率明顯增加，表明ALOX15明顯促進(jìn)了erastin誘導(dǎo)的VSMCs死亡。推測(cè)ALOX15可能參與了erastin誘導(dǎo)下的細(xì)胞死亡。但有關(guān)鐵死亡與VSMCs關(guān)系的具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步闡明。

總之，VSMCs轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15后ALOX15蛋白表達(dá)升高，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染質(zhì)粒ALOX15可以促進(jìn)erastin誘導(dǎo)的VSMCs的死亡，但其作用具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。