陳陽,冉雯雯,王璐,宋瑤琳,李廣起,邢曉明

(青島大學,山東 青島 266071 1 基礎醫(yī)學院病理學系；2 附屬醫(yī)院病理科)

結直腸癌(CRC)是胃腸道常見的惡性腫瘤之一，是全球范圍內(nèi)的第四大惡性腫瘤[1]。CRC起病隱匿，侵襲轉(zhuǎn)移能力強，晚期轉(zhuǎn)移是多數(shù)病人死亡的主要原因，但其轉(zhuǎn)移的分子機制目前尚不明確[2]。G蛋白信號調(diào)節(jié)蛋白1(GPSM1)為G蛋白信號激活蛋白家族Ⅱ(AGSⅡ)的成員，是1999年由英國科學家在對酵母進行遺傳學篩查時發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，該蛋白由N末端的7個四肽重復序列(TPR)和C末端的4個G蛋白調(diào)節(jié)模體(GPR)組成[3-4]。GPSM1在神經(jīng)組織、睪丸組織中廣泛分布，作為鳥嘌呤核苷酸解離抑制劑參與G蛋白信號通路的調(diào)節(jié)，以及神經(jīng)元分化和紡錘體形成等多種生物學進程[3-8]。近年來研究顯示，GPSM1在人食管鱗狀細胞癌、前列腺癌組織中異常表達并影響腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移及凋亡[9-10]。GPSM1也參與CRC細胞系HT29巨自噬的早期調(diào)控[11]，但GPSM1在CRC中的表達及作用尚不明確。大鼠肉瘤病毒(RAS)基因突變是癌癥最易發(fā)生的突變之一，約42%的CRC病人伴RAS基因突變[12]。RAS基因?qū)儆谠┗蚣易?，編碼KRAS、NRAS和HRAS，其中KRAS突變率最高(約占85%)[13]。RAS基因突變可使細胞信號傳導異常激活，持續(xù)傳遞有絲分裂信號，誘導細胞增殖分化，促進腫瘤發(fā)生[14]。美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)第8版癌癥分期系統(tǒng)明確指出，KRAS和NRAS是影響CRC預后的關鍵因素[15]。本研究旨在通過檢測GPSM1在CRC組織中的表達，探討GPSM1表達與KRAS、NRAS突變及病人臨床病理特征的相關性，以期為CRC防治提供新的分子標志物及治療靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2015年4月—2016年4月青島大學附屬醫(yī)院收治的150例CRC病人的石蠟組織樣本及臨床病理資料，臨床病理資料包括病人性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、淋巴結轉(zhuǎn)移、KRAS和NRAS突變情況等。所有病人均為原發(fā)性CRC，術前未行放化療和靶向治療。對150例CRC病人定期進行電話和門診隨訪，隨訪截止日期為2020年3月。150例病人均有完整的隨訪資料，其中52例病人死亡，9例病人發(fā)生了術后轉(zhuǎn)移復發(fā)。本研究經(jīng)青島大學附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1組織芯片制備 由兩名病理醫(yī)師對所有蠟塊進行復片，光學顯微鏡下選取典型區(qū)域并標記，使用Pathology Devices TMAjrTM組織芯片點樣儀制作孔徑為2.0 mm的組織芯片，4 μm切片。

1.2.2GPSM1免疫組織化學檢測 采用PV-6000法進行免疫組織化學染色。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化后，使用體積分數(shù)0.03的過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，高壓修復2 min(枸櫞酸鹽pH值6.0)；滴加GPSM1一抗(1∶200，NBP1-91968，NOVUS，美國)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4 ℃孵育過夜；滴加通用型二抗(北京中杉金橋生物技術有限公司)，37 ℃孵育30 min；DAB顯色3 min，使用蘇木精復染，脫水、封片。

每張切片由兩名資深病理醫(yī)師隨機選擇5個高倍視野，判讀GPSM1染色結果。GPSM1陽性染色定位于細胞漿。根據(jù)染色強度及陽性細胞率進行半定量評分。染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細胞率評分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51～75%為3分，>75%為4分。兩項評分相乘，≥4分為高表達，<4分為低表達[16]。

1.2.3KRAS及NRAS基因突變的檢測 使用石蠟包埋組織DNA提取試劑盒(TIANGEN公司，DP331-02，中國)提取150例CRC石蠟組織切片中的DNA，然后應用KRAS、NRAS突變檢測試劑盒(上海源奇生物制藥有限公司)檢測其突變情況。使用ABI7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific Inc，美國)進行擴增。KRAS基因突變擴增程序為：42 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、15 s，60 ℃、60 s；共40個循環(huán)；于60 ℃下采集熒光信號。NRAS基因突變擴增程序為：42 ℃、5 min；94 ℃、3 min；94 ℃、45 s，60 ℃、80 s；共40個循環(huán)；于60 ℃下采集熒光信號。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理。GPSM1表達與KRAS、NRAS突變及臨床病理特征的關系分析采用Pearsonχ2檢驗；GPSM1表達與病人術后生存時間的關系分析采用Kaplan-Meier生存分析和Log rank檢驗，生存曲線的繪制采用GraphPad Prism 7軟件。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 GPSM1在CRC組織中的表達

免疫組織化學檢測結果顯示，GPSM1在CRC組織細胞漿中呈高表達，在癌旁組織細胞漿呈低表達或不表達(圖1)。在CRC組織中，108例呈高表達，42例呈低表達；在癌旁組織中，21例呈高表達，129例呈低表達。GPSM1在CRC組織與癌旁組織中的表達差異具有統(tǒng)計學意義(χ2=102.938,P<0.001)。

A：GPSM1在癌旁組織中呈陰性表達；B：GPSM1在CRC組織中呈高表達。免疫組織化學染色。

2.2 KRAS及NRAS基因突變情況

實時熒光定量PCR檢測結果顯示，CRC組織KRAS及NRAS突變率分別為44.00%(66/150)和3.33%(5/150)。

2.3 GPSM1表達水平與CRC病人臨床病理特征的關系

GPSM1在CRC組織中的高表達與淋巴結轉(zhuǎn)移(χ2=5.429，P=0.020)以及KRAS突變(χ2=4.030，P=0.045)相關，而與性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、TNM分期、浸潤深度、遠處轉(zhuǎn)移、NRAS突變等均無相關性(P>0.05)。見表1。

表1 GPSM1表達與CRC病人臨床病理特征的關系(例(χ/%)

2.4 GPSM1表達與CRC病人預后的關系

根據(jù)GPSM1在CRC組織中的表達水平將CRC病人分為GPSM1高表達和低表達組，Kaplan Meier生存分析顯示，GPSM1高表達組(n=108)CRC病人的無病和總體生存期較GPSM1低表達組(n=42)明顯縮短(P=0.046、0.036)。見圖2。

A：不同GPSM1表達水平病人無病生存曲線；B：不同GPSM1表達水平病人總體生存曲線。

3 討 論

GPSM1是調(diào)節(jié)G蛋白信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的重要蛋白之一，生理狀態(tài)下其主要作用是介導G蛋白信號轉(zhuǎn)導通路的調(diào)控，參與神經(jīng)元分化以及紡錘體形成[3-5]。近年的研究發(fā)現(xiàn)，GPSM1在多種腫瘤組織中異常表達，包括人食管鱗狀細胞癌、胃癌、前列腺癌等，并且與腫瘤惡性程度及細胞增殖和侵襲性相關[9-10,17]。但GPSM1在CRC組織中的表達及意義尚缺乏相關研究。本研究通過免疫組織化學染色檢測顯示，GPSM1在CRC組織中的表達水平較其在癌旁組織明顯升高，且是CRC病人預后不良的指標，提示GPSM1可能參與了CRC的發(fā)生發(fā)展。

目前研究表明，GPSM1與多種腫瘤的發(fā)生密切相關。SHI等[9]研究顯示，食管鱗狀細胞癌組織中GPSM1的低表達狀態(tài)與腫瘤的分級呈正相關，GPSM1高表達的病人生存時間更長，GPSM1是食管鱗狀細胞癌病人獨立的預后因素；并且過表達GPSM1能夠明顯抑制食管鱗狀細胞癌細胞的增殖。ZHANG等[17]研究證實，GPSM1的DNA甲基化可能參與胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，并且與癌癥病人的預后顯著相關。ADEKOYA等[10]的研究結果表明，GPSM1在前列腺癌中表達水平明顯增高，前列腺癌細胞中過表達GPSM1可促進體內(nèi)、體外腫瘤細胞的增殖。本研究對CRC組織中GPSM1表達與病人臨床病理特征的相關性進行分析，結果顯示，CRC組織高表達GPSM1的病人更容易發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移，而GPSM1表達與病人年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤分化程度等均無關。進一步分析GPSM1表達與CRC病人預后關系顯示，GPSM1高表達病人預后較差，提示GPSM1可能參與了CRC的侵襲轉(zhuǎn)移，是CRC預后不良的預測指標。

目前，GPSM1在CRC中作用的分子機制及相關信號轉(zhuǎn)導通路尚未闡明。研究表明，Notch信號通路參與了CRC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程并調(diào)控腫瘤干細胞的形成，可促進CRC轉(zhuǎn)移以及腫瘤形成[18]。Wnt/β-catenin信號通路在腸隱窩底部激活、結直腸穩(wěn)態(tài)維持及腫瘤形成過程中均發(fā)揮至關重要的作用[19]。另外，核因子κB(NF-κB)、表皮生長因子受體(EGFR)、RAS等信號通路在調(diào)控CRC細胞凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移方面均發(fā)揮重要作用[20-22]。

KRAS突變是常見的致癌性突變，以12、13位密碼子突變最為多見。突變型KRAS能夠擺脫上游信號分子EGFR的調(diào)控，促進RAS-RAF-MEF-ERK信號通路的激活，增強腫瘤細胞對機體的適應性，促進腫瘤發(fā)生發(fā)展[23-24]。多項研究結果顯示，KRAS突變與CRC轉(zhuǎn)移顯著相關，是CRC轉(zhuǎn)移的潛在生物標志物[25-26]。本研究結果顯示，CRC組織中GPSM1表達水平與KRAS突變顯著相關。表明GPSM1可能與KRAS協(xié)同作用，促進CRC的發(fā)生與演進，或可作為臨床檢測CRC轉(zhuǎn)移的補充指標。KRAS突變可影響下游信號通路傳導，使腫瘤細胞對西妥昔單抗產(chǎn)生耐藥，且KRAS與GPSM1均可調(diào)控鳥嘌呤核苷酸的水解與結合，二者在功能上具有相似性[27-29]。這提示GPSM1可能與KRAS一同在西妥昔單抗的耐藥機制中發(fā)揮作用，或可成為西妥昔單抗耐藥的潛在指標。

綜上所述，GPSM1在CRC中呈高表達狀態(tài)，與CRC病人淋巴結轉(zhuǎn)移及KRAS突變存在相關性，并與不良預后相關，可作為CRC診斷、治療及預后判斷的潛在指標。