席孝忠,李國強,肖雷,姚坤厚

(1 信陽市中心醫(yī)院腫瘤外科,河南 信陽 464000；2 河南大學(xué)淮河醫(yī)院普通外科)

結(jié)腸癌是消化道癌癥主要表型，其惡性程度較高[1]，病死率位居惡性腫瘤前列，且呈逐年上升趨勢，地域和人群差異顯著[2]。研究表明，腫瘤干細胞分離和鑒定極大地推動了實體腫瘤如肺癌、消化道癌、生殖系統(tǒng)癌癥等的深入研究[3-5]。細胞表面標志物，如CD133、CD44等，已被廣泛用于各類惡性腫瘤干細胞的鑒定，如消化道癌等[6]。此外，miRNA是一類可以通過阻斷mRNA翻譯或者降解目標mRNA，從而發(fā)揮基因抑制的內(nèi)源性非編碼的小RNA。miRNA異常表達已被證實與癌細胞增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等關(guān)聯(lián)密切，并參與惡性腫瘤進程，其中miR-21在結(jié)腸癌中高表達[7]。本研究基于生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)成纖維細胞生長因子18(FGF18)為促癌基因[8]，是miR-21-5p靶基因之一，然而有關(guān)其在結(jié)腸癌中的研究尚未見報道。基于此，本研究主要探究了miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌腫瘤干細胞增殖、遷移和侵襲的作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

結(jié)腸癌HT29細胞(中國科學(xué)院上海細胞生物學(xué)研究所提供)；胰蛋白酶(Hyclone公司，USA)；DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco公司，USA)；細胞轉(zhuǎn)染序列(上海奇駿牛物科技有限公司)；分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；倒置光學(xué)顯微鏡(寧波舜宇光學(xué)科技(集團)有限公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(Sigma公司，USA)；miR-21-5p、FGF18引物合成(Takara，大連寶生物工程有限公司)；熒光定量PCR儀(ABI，USA)；BCA試劑盒(廣州威佳生物科技有限公司)；Western blotting試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細胞分選 將結(jié)腸癌HT29細胞進行常規(guī)消化，參照既往文獻的方法[9]，采用流式細胞分選技術(shù)分離篩選CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細胞。將分選后細胞重懸，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2條件下于6孔板中培養(yǎng)。以供后續(xù)細胞增殖、遷移和侵襲及凋亡等實驗應(yīng)用。

1.2.2CD133+/CD44+細胞培養(yǎng)、分組及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染觀察CD133+/CD44+細胞的生長狀況，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代培養(yǎng)過程中，對細胞進行離心和消化處理，吹打成單個細胞。重復(fù)上述操作，離心、棄細胞沉淀，吹打混勻成單細胞懸液后，轉(zhuǎn)至6孔板相同條件繼續(xù)培養(yǎng)備用。選取傳代后3～5 d處于對數(shù)生長期的狀態(tài)良好的細胞凍存?zhèn)溆谩?/p>

取細胞分為如下6組：空白對照組(A組，Blank組)、陰性對照組(B組，NC組)、miR-21-5p模擬物組(C組，miR-21-5p mimic組)、miR-21-5p抑制劑組(D組，miR-21-5p inhibitor組)、FGF18沉默表達組(E組，si-FGF18組)、FGF18沉默表達+ miR-21-5p模擬物組(F組，si-FGF18+miR-21-5p mimic組)。按照不同分組轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，具體轉(zhuǎn)染操作如下。①Blank組：不轉(zhuǎn)染任何序列。②NC組：轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒。③miR-21-5p mimic組：轉(zhuǎn)染miR-21-5p mimic質(zhì)粒。④miR-21-5p inhibitor組：轉(zhuǎn)染miR-21-5p inhibitor質(zhì)粒。⑤si-FGF18組：轉(zhuǎn)染si-FGF18質(zhì)粒。⑥si-FGF18+miR-21-5p mimic組：轉(zhuǎn)染si-FGF18和 miR-21-5p mimic質(zhì)粒。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖抑制率 細胞增殖測定根據(jù)細胞計數(shù)試劑盒說明書進行操作。取各組轉(zhuǎn)染細胞混懸液加入96孔板中，每組設(shè)6個復(fù)孔，置于常規(guī)細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每孔加入CCK8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)。采用分光光度計測量450 nm波長處吸光度值，計算細胞增殖抑制率。

1.2.4Transwell小室法檢測細胞的遷移和侵襲能力 取各組轉(zhuǎn)染細胞，消化離心后重懸計數(shù)。按常規(guī)操作程序分別進行細胞遷移和侵襲實驗。細胞遷移實驗步驟如下：細胞培養(yǎng)后取Transwell小室，使用40 g/L多聚甲醛固定，5 g/L結(jié)晶紫溶液染色并拭去未遷移細胞，光學(xué)顯微鏡下觀察并求取平均值。細胞侵襲實驗過程中，應(yīng)用Matrigel稀釋液包被Transwell小室底部膜的上室，并在37 ℃條件下將實驗樣品自然風(fēng)干，其余操作同細胞遷移實驗。比較各組細胞遷移和侵襲能力。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 各組細胞轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞于流式管，胰蛋白酶消化液處理細胞，低溫離心處理后調(diào)節(jié)細胞密度。采集細胞懸液，按照Annexin-V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒說明進行操作，檢測細胞凋亡率。

1.2.6實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-21-5p表達及FGF18mRNA表達 經(jīng)細胞RNA沉淀、洗滌、溶解和濃度測定后，分別提取各組轉(zhuǎn)染后CD133+/CD44+細胞總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，參照說明書進行。取反應(yīng)液進行熒光定量PCR，參照說明書進行操作。采用相對定量法分別計算目的基因miR-21-5p和FGF18相對于內(nèi)參照(U6)的相對表達量。

1.2.7Western blotting檢測CD133、CD44以及FGF18蛋白表達 待細胞生長至匯合狀態(tài)(80%)，收集細胞加入裂解緩沖液，離心處理后提取各組CD133+/CD44+細胞總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白濃度。根據(jù)不同濃度進行定量，待樣本處理完畢后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、室溫下脫脂奶粉中置于搖床中封閉。滴加一抗兔抗人CD133、CD44和鼠抗人FGF18，4 ℃過夜，PBS洗滌，然后應(yīng)用HRP標記的羊抗兔IgG抗體孵育(全程避光)。內(nèi)參照為GAPDH。顯影和定影后，采用Image J系統(tǒng)分析計算蛋白相對含量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 miR-21-5p與FGF18靶向關(guān)系

通過在線分析軟件分析顯示，F(xiàn)GF18基因與miR-21-5p序列間存在特異結(jié)合區(qū)域(圖1)，確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。這一靶向關(guān)聯(lián)為本文細胞實驗奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 FGF18基因與miR-21-5p序列間的特異結(jié)合區(qū)域

2.2 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細胞增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞增殖抑制率明顯降低(F=16.28，P<0.05)，miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組明顯升高(F=26.53、23.96，P均<0.05)，si-FGF18+miR-21-5p mimic組無明顯差異(P>0.05)。而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞增殖抑制率下降，差異有顯著性(t=6.181，P<0.05)。見表1。

2.3 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細胞遷移和侵襲影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞遷移和侵襲能力顯著升高；miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組細胞遷移和侵襲能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F遷移=11.23～19.55，F(xiàn)侵襲=21.68～52.85，P均<0.05)；si-FGF18+miR-21-5p mimic組細胞遷移和侵襲能力無明顯差異(P均>0.05)。而與si-FGF18組細胞相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組細胞遷移和侵襲能力明顯上升(t=4.927、8.073，P均<0.05)。見圖2。

a：細胞遷移率柱狀圖；b：細胞侵襲率柱狀圖；c：細胞侵襲能力實驗檢測。A：Blank組，B：NC組，C：miR-21-5p mimic組，D：miR-21-5p inhibitor組，E：si-FGF18組，F(xiàn)：si-FGF18+miR-21-5p mimic組。與Blank組和NC組相比，*P <0.05；與si-FGF18組相比，#P <0.05。

2.4 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞早、晚期凋亡率呈下降趨勢；而miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組凋亡率則上升(F早期=17.22～35.88，F(xiàn)晚期=24.12～109.80，P均<0.05)；si-FGF18+miR-21-5p mimic組凋亡率差異無顯著性(P均>0.05)。而與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD133+/CD44+細胞早、晚期凋亡下降(t=10.73、13.47，P均<0.05)。見表1。

2.5 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對miR-21-5p和FGF18相對表達影響

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，與Blank組和NC組相比，miR-21-5p mimic組FGF18mRNA和miR-21-5p的表達水平均顯著上升，miR-21-5p inhibitor組FGF18mRNA和miR-21-5p表達水平均顯著下調(diào)(FFGF18=29.44、886.10，F(xiàn)miR-21-5p=12.18、764.70，P均<0.05)；si-FGF18組miR-21-5p表達差異無顯著性(P>0.05)，而FGF18mRNA表達水平顯著下降(F=32.90，P<0.05)；且si-FGF18+miR-21-5p mimic組miR-21-5p表達水平顯著上升(F=509.10，P<0.05)，而FGF18表達無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌干細胞生物學(xué)行為及兩者mRNA表達影響

2.6 miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對CD44、CD133和FGF18蛋白表達影響

Western blotting結(jié)果顯示，與Blank組和NC組細胞相比較，miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平均顯著上升(F=109.00～551.90，P均<0.05)；miR-21-5p inhibitor組和si-FGF18組的蛋白表達水平則顯著下降(F=9.31～36.45，P均<0.05)，si-FGF18+miR-21-5p mimic組的蛋白表達水平無明顯變化(P均>0.05)。與si-FGF18組相比，si-FGF18+miR-21-5p mimic組CD44、CD133和FGF18表達均呈上升趨勢(t=3.253～10.18，P均<0.05)。見圖3。

a：CD44、CD133和FGF18蛋白表達電泳圖；b：CD44、CD133和FGF18蛋白表達水平柱狀圖。A：Blank組，B：NC組，C：miR-21-5p mimic組，D：miR-21-5p inhibitor組，E：si-FGF18組，F(xiàn)：si-FGF18+miR-21-5p mimic組。與Blank組和NC組相比(n=3)，*P<0.05；與si-FGF18組相比，#P<0.05。

3 討 論

本研究首先通過生物學(xué)預(yù)測軟件確定FGF18是miR-21-5p的靶基因。進而采用細胞培養(yǎng)并構(gòu)建質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法，探究miR-21-5p調(diào)控FGF18表達對結(jié)腸癌腫瘤干細胞生物學(xué)行為的影響。本研究選用流式細胞分選技術(shù)篩選CD133+/CD44+結(jié)腸癌干細胞的臨床意義在于，上皮來源的惡性腫瘤的發(fā)生可能與腫瘤干細胞的增殖、分化等潛能存在關(guān)聯(lián)性[10]。針對腫瘤細胞的惡性特征，既往眾多研究已發(fā)現(xiàn)腫瘤的進程可歸因于腫瘤干細胞的特征，如其可自我更新、增殖分裂等，從而導(dǎo)致腫瘤細胞的耐藥性、治療失敗、癌癥復(fù)發(fā)等不良后果。腫瘤治療多采用外源性干預(yù)手段抑制此類干細胞的自我更新，從而阻斷細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡，最終實現(xiàn)逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞增殖分化、轉(zhuǎn)移等[11]。作為腫瘤細胞的標志物，CD133、CD44已被證實在肝癌、骨肉瘤等中呈顯著高表達，其表達上調(diào)可能與激活下游信號通路、抑制腫瘤細胞凋亡等相關(guān)聯(lián)[12-13]。另外，miR-21-5p已被報道與人類消化道癌癥等密切相關(guān)[14-15]，并通過作用眾多的基因靶點參與腫瘤進展，為腫瘤靶向治療提供新途徑。WU等[16]研究顯示，miR-21-5p高表達可通過抑制PTEN、激活P13K/Akt信號通路、誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等機制促進食管癌發(fā)生進程。因此，作者推測miR-21-5p有可能通過特定靶基因，干預(yù)結(jié)腸癌干細胞生物學(xué)進程。FGF18作為成纖維細胞因子，屬于纖維細胞因子(FGF)家族，是典型的促癌基因。FGF家族成員在血管生成、組織細胞增殖、成纖維細胞增生等方面發(fā)揮重要作用，通過翻譯轉(zhuǎn)錄可發(fā)揮多種潛在功能[17]。FGF18在癌癥中呈高表達，如在卵巢高級漿膜癌中呈顯著高表達，促進癌癥進展[18]。

本研究結(jié)果表明，下調(diào)miR-21-5p表達和沉默F(xiàn)GF18表達后CD133+/CD44+細胞增殖抑制率和凋亡率顯著提升，而遷移和侵襲能力顯著降低；而上調(diào)miR-21-5p表達結(jié)果與此相反；且在上調(diào)miR-21-5p表達基礎(chǔ)上沉默F(xiàn)GF18表達，逆轉(zhuǎn)了沉默F(xiàn)GF18表達對細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的作用。本文結(jié)果提示，miR-21-5p低表達可在結(jié)腸癌干細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮正向作用；同時，下調(diào)miR-21-5p表達可抑制FGF18表達，進一步凸顯了對結(jié)腸癌干細胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用。此外，上調(diào)miR-21-5p表達后導(dǎo)致FGF18、CD133、CD44蛋白表達水平顯著上升；而下調(diào)miR-21-5p表達，靶向抑制FGF18，上述因子的表達水平均顯著逆轉(zhuǎn)。就其機制而言，微小RNA通常通過靶基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后表達。我們推測其可能與FGF18為miR-21-5p靶基因，miR-21-5p通過與其3′端非翻譯區(qū)特異性結(jié)合，抑制作為促癌基因FGF18的表達水平，從而達到抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞凋亡的結(jié)果。LU等[19]報道，過表達miR-21-5p可靶向15-PGDH，促進膽管癌生長。YAN等[20]亦在其研究中通過基因組微陣列數(shù)據(jù)和靶向預(yù)測miR-21-5p可靶向PIK3R1，抑制腫瘤細胞遷移和侵襲，降低PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在乳癌中發(fā)揮重要作用。本研究亦通過類似機制性探討，初步顯示miR-21-5p與其靶基因FGF18在結(jié)腸癌腫瘤干細胞中的作用，為臨床探究結(jié)腸癌治療提供了一定的實驗依據(jù)。

綜上所述，本研究證實抑制miR-21-5p表達并沉默F(xiàn)GF18表達，可抑制結(jié)腸癌腫瘤干細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡。本實驗為靶向miR-21-5p和FGF18的分子治療策略提供了實驗基礎(chǔ)。同時，本研究有待進一步的動物移植瘤實驗驗證，并佐以進一步的實驗探究抑制miR-21-5p表達對腫瘤細胞藥物敏感性以及臨床病人預(yù)后方面的影響。