梁凱，閆巧珍，王曉聞，朱俊玲

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 晉中 030801)

小米富含人體所需的各類營養(yǎng)物質(zhì)，有清熱、滋陰、健脾等入藥功效[1]。最值得一提的是，小米中含有豐富的多酚類物質(zhì)，多酚類物質(zhì)具有多種生理功能，對人體健康起著積極的作用[2]。當(dāng)人體內(nèi)有大量的自由基時，會使細(xì)胞膜受損，從而引發(fā)體內(nèi)各種疾病[3]。國內(nèi)外研究表明，小米中富含的多酚類化合物具有消除有害自由基、抗氧化、抑菌、食品保鮮等功效，可廣泛用于食品工業(yè)[4]。

在調(diào)味品等食品行業(yè)中，食品添加劑的應(yīng)用十分廣泛，但是市售調(diào)味品中所使用的添加劑大多數(shù)為人工合成，存在著一定的危險性，如：抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等。所以，天然提取物作為添加劑應(yīng)用在調(diào)味品等食品行業(yè)成為近些年來研究的熱點(diǎn)。丁培峰等[5]將納他霉素和茶多酚添加到醬油中，其防腐、抗氧化效果十分明顯且安全性大大提髙。張兆英等[6]研究了金絲小棗多酚的抗氧化性和抑菌活性，金絲小棗多酚對枯草芽孢桿菌、大腸杄菌、曲霉、根霉4種菌有不同程度的抑制作用，可作為天然食品添加劑應(yīng)用于食品保鮮。杜瑜欣等[7]綜述了甘蔗多酚在食品、調(diào)味品中的應(yīng)用。

目前，針對葡萄多酚、芒果多酚、茶多酚等的研究較多，關(guān)于小米多酚體外生物活性的研究鮮有報道。本試驗(yàn)對小米多酚的抗氧化性和降血糖活性進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小米多酚粗提物凍干粉(純度為31.80%)、小米多酚純化物凍干粉(純度72.80%)：均為實(shí)驗(yàn)室自制；纖維素酶(100000 U/g)、果膠酶(50000 U/g)、沒食子酸、福林酚、AB-8大孔樹脂、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、鄰二氮菲、三氯化鐵、三氯乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、菲洛嗪(Ferrozine)、三氯甲烷、冰乙酸、異辛烷、p-茴香胺、三氟化硼、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷(4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside， PNPG)、葡萄糖：均為分析純；α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶：生物試劑；阿卡波糖：純度>98%。

1.2 儀器與設(shè)備

T-AOC試劑盒；葡萄糖測定試劑盒；UV-1100可見分光光度計 上海美譜達(dá)儀器有限公司；SC-3610低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DHP-9032恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Varioskan Flash多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司；FA25高速組織分散均質(zhì)機(jī) 上海弗魯克流體機(jī)械制造有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 小米多酚類物質(zhì)的提取及分離純化

將小米粉碎，過80目塞，脫脂干燥處理后精確稱取5 g，加酶(纖維素酶∶果膠酶為7∶3)搖勻，按實(shí)驗(yàn)設(shè)計的方案調(diào)節(jié)溶液pH，在設(shè)定的溫度下水浴一定時間后，冷卻，離心取上清液得到待測液Ⅰ。取濾渣，加入70%乙醇，在40 ℃下水浴1 h，離心取上清液，得到待測液Ⅱ，合并提取液Ⅰ和Ⅱ，并通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至一定體積。然后參考王若蘭等[8]采用大孔樹脂分離純化小米多酚的方法和條件將小米多酚進(jìn)行分離純化。

1.3.2 小米多酚對DPPH自由基清除率的測定

配制小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL。實(shí)驗(yàn)采用Brandwilliams W等[9]和Cengiz S等的方法，略做改動。將不同樣品的各濃度溶液2 mL加入到比色管中，加入0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液2 mL于暗處反應(yīng)30 min后，于517 nm處測吸光值，同時用無水乙醇調(diào)零，以Vc作為陽性對照。根據(jù)公式(1)計算出其清除率和IC50值。

(1)

式中：Ai為不同濃度樣品溶液+DPPH溶液測得的吸光值；Aj為不同濃度樣品溶液+無水乙醇測得的吸光值；Ac為無水乙醇+DPPH溶液測得的吸光值。

1.3.3 小米多酚對羥基自由基清除率的測定(鄰二氮菲-Fe2+法)

配制小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，濃度分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL。采用閆巧珍等[10]的方法，略做改動。將1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、2 mL PBS溶液(0.1 mol/L， pH 7.4)、1 mL不同濃度樣品溶液混合均勻后，加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液繼續(xù)混勻后再加入1 mL 0.01% H2O2，置于37 ℃的水浴鍋中1 h，取出于536 nm處測定吸光值。同時設(shè)置空白，Vc作為陽性對照，根據(jù)公式(2)計算出清除率和IC50值。

(2)

式中：AS為加入樣品測得的吸光值；AB為未加樣品，蒸餾水代替H2O2測得的吸光值；AP為未加樣品，加入H2O2測得的吸光值。

表1 羥基自由基清除率測定的加樣方法

1.3.4 小米多酚還原力的測定

精確稱取小米多酚粗提物、小米多酚純化物、Vc，分別配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的溶液。采用Tsantili E等[11]的還原力的測定方法，稍做改動。分別在比色管中依次加入1 mL不同濃度的樣液、2.5 mL PBS溶液(0.2 mol/L，pH 6.6)、2 mL 1%的鐵氰化鉀混勻，置于50 ℃的水浴鍋中20 min，取出冷卻后再加入1 mL 10%的三氯乙酸混勻，在混合溶液中吸取2.5 mL液體，分別加蒸餾水2.5 mL、0.1%的三氯化鐵0.5 mL，于700 nm處測其吸光度。同時，以Vc作為陽性對照。

1.3.5 小米多酚對鐵離子絡(luò)合作用的測定

采用趙文婷[12]測定藜麥麩皮總皂苷對金屬離子螯合能力的方法，測定小米多酚對金屬離子的螯合率。EDTA作為陽性對照，根據(jù)公式(3)計算出其螯合率。

(3)

式中：A0為樣液+蒸餾水(對照組)所測得的吸光值；A為樣液+Ferrozine試劑(樣品組)所測得的吸光值。

1.3.6 總抗氧化能力(T-AOC)的測定(ABTS法)

配制ABTS工作液：2660 μL檢測緩沖液+175 μL ABTS溶液+140 μL過氧化物溶液(用雙蒸水稀釋40倍)于溫室避光保存，30 min內(nèi)使用完,配制過氧化物酶應(yīng)用液(40 μL過氧化物酶+360 μL檢測緩沖液)。繪制Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線。向空白孔中加入10 μL雙蒸水、20 μL過氧化物酶應(yīng)用液、170 μL ABTS工作液(A0)；測定孔中加入10 μL不同濃度的樣品溶液、20 μL過氧化物酶應(yīng)用液、170 μL ABTS工作液(A1)，室溫下反應(yīng)6 min，于405 nm處測定各孔的OD值。計算ABTS自由基清除率。

(4)

1.3.7 小米多酚抑制α-淀粉酶活性的實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用葉瓊仙等[13]的方法，并稍做改動。稱取一定量的小米多酚粗提物、純化物和陽性對照阿卡波糖，分別溶于0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)，配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的各樣品溶液，取500 μL與500 μL用0.1 mol/L，pH 6.8的PBS溶液配制成的α-淀粉酶溶液(12.5 U/mL)混合均勻，于37 ℃下反應(yīng)5 min。再向其中加入500 μL 1%可溶性淀粉，于37 ℃下反應(yīng)5 min。反應(yīng)完成后加入500 μL DNS顯色劑終止反應(yīng)，將其置于100 ℃水浴5 min，取出冷卻。將反應(yīng)體系用0.1 mol/L PBS溶液定容至10 mL,于540 nm處測定其吸光度值。根據(jù)公式(5)計算出小米多酚對α-淀粉酶的抑制率。

(5)

式中：A背景為用緩沖液代替α-淀粉酶溶液的吸光值；A樣品為加入樣品的吸光值；A陰性為用緩沖液代替樣品溶液的吸光值。

1.3.8 小米多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用Liu Y T等[14]的方法，并稍做改動。稱取一定量的小米多酚粗提物、純化物和陽性對照阿卡波糖分別溶于0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)，配制成濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mg/mL的各樣品溶液。取0.1 mol/L的PBS溶液(pH 6.8)1.2 mL和2 U/mL α-葡萄糖苷酶溶液(按酶活力計算，用0.1 mol/L PBS，pH 6.8溶液配制)0.25 mL混勻，取0.3 mL各濃度樣品溶液，在37 ℃恒溫水浴15 min，取出添加2.5 mmol/L PNPG溶液0.25 mL，搖勻后在37 ℃恒溫水浴25 min，取出加入1 mL 0.2 mol/L的Na2CO3溶液。在540 nm下測定其吸光度值，根據(jù)公式(6)計算出小米多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

(6)

式中：A背景為用緩沖液代替α-葡萄糖苷酶溶液的吸光值；A樣品為加入樣品的吸光值；A空白為用緩沖液代替樣品溶液的吸光值。

1.3.9 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定

小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定參照Sharma等[15]的方法，并稍做改動。將葡萄糖配制成濃度為50，100，200 mmol/L的溶液。精確稱取0.3 g小米多酚粗提物與純化物，分別將其用濃度為50，100，200 mmol/L的葡萄糖溶液定容到100 mL，則5，10，20 mmol為初始葡萄糖含量，用磁力攪拌器攪拌均勻后放置于37 ℃保存，吸附6 h后取出，離心(3000 r/min，10 min)，取上清液1 mL，適當(dāng)稀釋后，用葡萄糖測定試劑盒測定各組小米多酚葡萄糖溶液的葡萄糖含量。小米多酚對葡萄糖的吸收能力根據(jù)公式(7)計算。

(7)

式中：C2為葡萄糖初始含量，mmol；C1為吸收后葡萄糖含量，mmol；M為樣品重量，g。

1.3.10 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel錄入，采用Origin 9.1繪圖和SPSS 23.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，所有實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 小米多酚體外抗氧化性研究

2.1.1 小米多酚對DPPH自由基清除率的測定

由圖1可知，3種樣品對DPPH自由基的清除能力有所差別，對比Vc，純化物與粗提物相對較弱，其大小排序?yàn)閂c>純化物>粗提物。Vc是目前公認(rèn)的強(qiáng)抗氧化劑，在0.05 mg/mL的濃度下，清除率已經(jīng)為(51.32±1.68)%。在濃度為0.05～0.25 mg/mL的范圍內(nèi)，所有實(shí)驗(yàn)組的清除率都隨著濃度的增大而增大。粗提物的濃度為0.2 mg/mL時其抗氧化能力與0.05 mg/mL的純化物相當(dāng)，純化后小米多酚中雜質(zhì)減少，抗氧化成分含量升高，這說明純化起到了很好的效果。計算得到各樣品的IC50值分別為：Vc(21.91±3.26) μg/mL，粗提物(266.32±4.92) μg/mL，純化物(125.94±5.22) μg/mL。

圖1 DPPH自由基清除率的測定Fig.1 The determination of DPPH free radical scavenging rate

2.1.2 小米多酚對羥基自由基清除率的測定(鄰二氮菲-Fe2+法)

由圖2可知，Vc、小米多酚粗提物、小米多酚純化物對羥基自由基都有一定的清除能力，但在同等濃度下3種樣品對羥基自由基表現(xiàn)出不同的清除能力，均為陽性對照Vc>純化物>粗提物。當(dāng)樣品濃度大于1.0 mg/mL時，各樣品的清除率增長趨于平緩，并無明顯增大。小米多酚對羥基自由基的清除效果可能與小米多酚的結(jié)構(gòu)相關(guān)，有關(guān)研究表明多酚苯環(huán)上的酚羥基數(shù)量越多則對羥基自由基的清除能力越大，故純化后小米多酚的清除率有所增強(qiáng)。計算得到各樣品的IC50值分別為：Vc(0.12±0.32) mg/mL，粗提物(9.04±0.26) mg/mL，純化物(2.52±0.16) mg/mL。

圖2 羥基自由基清除率的測定Fig.2 The determination of hydroxyl radical scavenging rate

2.1.3 小米多酚還原力的測定

由圖3可知，在濃度范圍為0.5～2.5 mg/mL內(nèi)，粗提物與純化物的還原力遠(yuǎn)低于Vc，表明小米多酚對Fe3+的還原能力較差。此外，純化物的還原力始終高于等濃度下的粗提物，尤其是當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL后，純化物的還原力都達(dá)到粗提物的3倍以上。

圖3 還原力的測定

2.1.4 小米多酚對鐵離子絡(luò)合作用的測定

由圖4可知，在濃度為0.2～1.0 mg/mL內(nèi)，3種樣品的金屬離子螯合率逐漸增大。粗提物對金屬離子的螯合能力遠(yuǎn)低于純化物和EDTA，其絡(luò)合作用依次為EDTA>純化物>粗提物。當(dāng)粗提物濃度為0.2 mg/mL時，粗提物基本無螯合作用。濃度為1.0 mg/mL時，純化物的螯合率是粗提物的2倍。

圖4 對金屬離子的螯合作用

2.1.5 總抗氧化能力(T-AOC)的測定(ABTS法)

2.1.5.1 ABTS自由基清除率的計算

由圖5可知，Vc與小米多酚純化物對ABTS自由基具有明顯的清除效果。在濃度為0.05～0.25 mg/mL的范圍內(nèi)，各種樣品濃度與清除率呈現(xiàn)出正相關(guān)。當(dāng)濃度達(dá)到0.25 mg/mL時，純化物與粗提物的清除率明顯增大，此時對ABTS自由基的清除率分別為Vc的63.23%、20.82%。通過計算可得出各樣品的IC50值分別是Vc(0.03±0.02) mg/mL，純化物(0.24±0.03) mg/mL，粗提物(0.92±0.05) mg/mL。

圖5 ABTS自由基清除率的測定

2.1.5.2 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖6 Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線

得到的回歸方程為y =-0.9814x+1.1201，R2=0.9972，表現(xiàn)出良好的相關(guān)性。

2.1.5.3 總抗氧化能力(T-AOC)的表示

通過計算得到各樣品的總抗氧化能力，其結(jié)果分別表示為：Vc(5.69±0.87) mmol/g，純化物(1.92±0.24) mmol/g，粗提物(0.58±0.32) mmol/g。其中，3個樣品中，Vc與純化物的總抗氧化能力明顯強(qiáng)于粗提物，粗提物中含有的非抗氧化性雜質(zhì)較多，純化后多酚物質(zhì)所占含量升高，故表現(xiàn)出優(yōu)異的抗氧化性。

2.2 小米多酚降血糖活性的研究

2.2.1 小米多酚抑制α-淀粉酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖7可知，在0.5～2.5 mg/mL內(nèi)，3種樣品的濃度與其對α-淀粉酶的抑制率呈現(xiàn)出正相關(guān)，粗提物和純化物的抑制率均低于等濃度下的陽性對照阿卡波糖。粗提物濃度增大到2.5 mg/mL時，抑制率仍低于20%，抑制效果不明顯，而純化物在濃度為1.0 mg/mL時就達(dá)到了(24.72±0.5)%，這說明小米多酚純化物具有較強(qiáng)的抑制α-淀粉酶活性的能力。通過計算得出各樣品的IC50值分別為：阿卡波糖(0.81±1.08) mg/mL，純化物(2.49±0.98) mg/mL，粗提物(7.55±1.22) mg/mL。

圖7 小米多酚對α-淀粉酶活性的抑制率

2.2.2 小米多酚抑制α-葡萄糖苷酶活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖8可知，隨著濃度不斷增大，阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率迅速升高，而粗提物和純化物均升高較慢。在0.5～2.5 mg/mL的濃度內(nèi)，純化物對α-葡萄糖苷酶的抑制率僅僅稍高于等濃度下的粗提物，兩者均表現(xiàn)出較差的抑制效果。當(dāng)濃度升高到2.5 mg/mL時，粗提物和純化物的抑制率分別為(16.24±0.70)%、(21.20±0.70)%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于陽性對照阿卡波糖，僅為等濃度下阿卡波糖的30.07%、39.26%，這說明小米多酚對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，但是效果不是很好。通過計算得出各樣品的IC50值分別為：阿卡波糖(2.34±1.26) mg/mL，純化物(7.01±1.08) mg/mL，粗提物(9.18±0.96) mg/mL。

圖8 小米多酚對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.8 The inhibition rate of millet polyphenols on α-glucosidase activity

2.2.3 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定結(jié)果

由表2可知，小米多酚對葡萄糖有一定的吸收能力，同時隨著初始含量的增加，兩者對葡萄糖的吸收能力都有所上升，說明小米多酚對葡萄糖的吸收并沒有達(dá)到飽和，且純化物的吸收能力大于粗提物，這可能與小米多酚的結(jié)構(gòu)特殊性相關(guān)，降低了葡萄糖溶液的流動性，從而提高了對葡萄糖的吸收能力，這也是多酚類物質(zhì)能降低血糖水平的原理之一。

表2 小米多酚對葡萄糖吸收能力的測定

3 結(jié)論

本試驗(yàn)研究了小米多酚的體外抗氧化活性和降血糖活性。通過抗氧化性試驗(yàn)可以看出，小米中的多酚類物質(zhì)具有優(yōu)異的抗氧化性，通過純化后其抗氧化性進(jìn)一步提高，也說明小米提取物中除多酚類物質(zhì)外的一些雜質(zhì)其抗氧化性非常弱甚至無抗氧化性。降血糖試驗(yàn)表明純化后的小米多酚對α-淀粉酶的抑制率較高，而對α-葡萄糖苷酶的抑制率稍高于等濃度下的粗提物，兩者均表現(xiàn)出較差的抑制效果。即使對小米多酚進(jìn)行分離純化后抑制率也沒有明顯提高，所以推斷，對α-葡萄糖苷酶的抑制效果可能與小米中多酚類物質(zhì)的種類相關(guān)，某種多酚類特定的結(jié)構(gòu)會對α-葡萄糖苷酶的抑制起到明顯作用，而小米中多酚類物質(zhì)種類含量單一，起決定性作用的物質(zhì)含量甚微，所以對α-葡萄糖苷酶的抑制效果較差，可進(jìn)一步從小米多酚的結(jié)構(gòu)方面對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)說明小米多酚作為一種天然的抗氧化劑，能夠在食品添加劑和調(diào)味品行業(yè)進(jìn)行深入開發(fā)及應(yīng)用。小米多酚可作為天然的防腐劑添加到動物性食品中，延長食品的保鮮期，亦可作為調(diào)味品添加到果汁、糕點(diǎn)等食品中，保持食品的色澤穩(wěn)定，提高食品的營養(yǎng)價值。本硏究結(jié)果為小米多酚的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化加工提供了一定理論依據(jù)和技術(shù)參照。