張進忠，李悅淇，石 科，楊 亮，郭 丹

1.河南醫(yī)學高等?？茖W校檢驗系，河南 鄭州 451191；

2.鄭州大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，河南 鄭州 450000

ESCC中mTOR/p70S6K信號轉導通路高度激活，抑制mTOR/p70S6K信號轉導通路的活性使下游靶蛋白p70S6K和4E-BP1的磷酸化水平下降，抑制細胞的增殖和遷移能力［7］。激活m-TOR改變有絲分裂細胞的中心體定位，影響細胞定向分裂促進腎囊腫的形成［8］。抑制mTORC1激酶的活性使有絲分裂紡錘體形成的關鍵調節(jié)因子的定位受損，導致紡錘體組裝和胞質分裂缺陷［9］。研究［10］顯示，在膠質母細胞瘤中敲低PLK4的表達可增強硼替佐米的抗腫瘤作用，可能由PTEN/PI3K/AKT/mTOR 信號轉導通路介導，細胞凋亡和氧化應激過程被激活。然而，PLK4是否通過調節(jié)mTOR/p70S6K信號轉導通路參與ESCC的進程鮮見報道。本研究通過檢測ESCC細胞和組織中PLK4的表達水平，分析PLK4表達與臨床病理學特征之間的關系，下調PLK4的表達檢測ESCC細胞增殖及侵襲轉移能力的變化，并探索其可能的分子機制，為ESCC診斷和治療提供潛在的分子靶點。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

胎牛血清、胰蛋白酶和RPMI-1640細胞培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，TRIzol、反轉錄試劑盒和LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司，SYBR Green 實時熒光定量聚合酶鏈反應（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）試劑盒購自美國Thermo Fisher公司，PLK4抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司，mTOR抗體、p70S6K抗體、p-mTORSer2448抗體和p-p70S6KThr421/Ser424抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，HRP標記羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物工程有限公司，BCA蛋白濃度測定試劑盒和細胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術有限公司，transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 細胞株

正常食管上皮細胞Het-1A、人ESCC細胞系TE-1、TE-8和TE-13均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫/中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

1.3 病例資料

選取2017年1月—2019年12月河南醫(yī)學高等?？茖W校附屬醫(yī)院93例經(jīng)病理組織學檢查確診為ESCC患者的癌組織及其配對的癌旁組織（距原發(fā)灶邊緣5 cm以上）。入選標準：ESCC為原發(fā)性腫瘤并無其他腫瘤病史；未經(jīng)任何ESCC相關化療、免疫治療等；無食管手術治療史。其中男性43例，女性50例，年齡（55.32±10.23）歲。手術后立即將新鮮標本進行液氮凍存。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng)

Het-1A細胞和ESCC細胞（TE-1、TE-8和TE-13）加入含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基，置于37 ℃，CO2體積分數(shù)為5%的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

小鼠經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后,固定于平板上。75%酒精消毒頸部皮膚后,做1 c m長的切口,鈍性分離并暴露氣管,用1 mL注射器向肺內(nèi)注射50μL生理鹽水或LPS(5 mg/kg體重);將小鼠頭向上搖晃小鼠,讓液體在肺內(nèi)均勻分布;隨后將頸部切口縫合,讓自然蘇醒。

1.4.2 RTFQ-PCR檢測PLK4基因的表達

用TRIzol提取細胞總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA，用于RTFQ-PCR實驗檢測PLK4基因的表達。PLK4上游引物為5’-AATCAAGCACTCTCCAATC-3’，PLK4下游引物為5’-TGTGTCCTTCTGCAAATC-3’；β-actin上游引物為5’-GTTGCGTTACACCCTTT CTTG-3’，β-actin下游引物為5’-CACCTTCAC CGTTCCAGTTT-3’。反應體系：cDNA 0.2 μL，上下游引物各0.5 μL，SYBR緩沖溶液29.25 μL，Real Master Mix 35.7 μL，ddH2O 33.85 μL。反應條件為：94 ℃10 min，30個循環(huán)：94 ℃15 s，60 ℃32 s。采用2-ΔΔCt法計算PLK4基因的mRNA相對表達量。

1.4.3 蛋白質印跡法（Western blot）檢測蛋白水平

離心收集細胞后用RIPA裂解液提取細胞總蛋白。臨床組織用液氮速凍后加入RIPA裂解液研磨提取組織總蛋白。BCA法測定蛋白質濃度，取20 μg蛋白質上樣進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），半干轉至PVDF膜，用5%脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，一抗4 ℃過夜溫育，然后與HRP標記的二抗室溫溫育1 h，ECL發(fā)光液進行顯影，掃描儀掃描條帶并用Image J分析。

1.4.4 利用siRNA技術抑制TE-13細胞中PLK4的表達

將處于對數(shù)生長期的TE-13細胞接種于6孔板，置于37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至融合度達60%～80%，棄去培養(yǎng)基，每孔加入2.0 mL無血清培養(yǎng)基，其中含10 μL LipofectamineTM2000試劑和10 μL si-PLK4 RNA（或si-control RNA）混合均勻，繼續(xù)置細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，6 h 后棄去含轉染復合物的培養(yǎng)基，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。本研究中si-PLK4 RNA序列順義鏈為5’-GACCTTATTCACCAGTTACTT-3’，反義鏈為5’-GACCTTATTCACCAGTT-3’；si-control RNA序列順義鏈為5’-UUCUCCG AACGUUGUCACGUTT-3’，反義鏈為5’-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.4.5 CCK-8和克隆形成實驗檢測細胞增殖能力

將細胞接種到96孔板中（2×104個/孔），細胞貼壁后每孔加入10 μL CCK-8測定液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標儀檢測細胞在450 nm處的吸光度（D）。細胞抑制率＝（D對照孔平均值-D實驗孔平均值）/D對照孔平均值×100%。

將細胞接種到6孔板中（1×103個/孔），置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞至兩周，每隔3天更換培養(yǎng)液一次，當克隆數(shù)停止增加時棄去培養(yǎng)基，用4%多聚甲醛固定細胞30 min，再用結晶紫染色，計算細胞克隆數(shù)。

1.4.6 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲能力

將transwell小室置于24孔培養(yǎng)板的孔中，下室加入600 μL含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。上室加入無血清RPMI-1640培養(yǎng)基和處理過的細胞。培養(yǎng)24 h后用4%的多聚甲醛固定細胞30 min，PBS清洗小室洗去多余的甲醛，加入1%的結晶紫室溫放置30 min，PBS清洗3次，用乙醇棉球擦拭上室未遷移的細胞，顯微鏡下取隨機視野觀察。

1.4.7 劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力

將細胞接種到6孔板中，待細胞的融合度達到90%，用劃痕儀在6孔板下部的中心劃痕，形成劃痕后置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0和48 h拍攝劃痕愈合單層的照片，計算每組細胞遷移率（%）=（0 h劃痕寬度-48 h劃痕寬度）/0 h劃痕寬度×100%。

1.5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。PLK4在各細胞中的表達差異用單因素方差分析。構建受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under curve，AUC）用于評估PLK4蛋白表達水平在診斷ESCC中的性能，計算cutoff值，統(tǒng)計PLK4蛋白表達診斷ESCC的靈敏度和特異度。用卡方檢驗分析組織標本中兩組間PLK4蛋白表達差異。Spearman相關性分析PLK4和ESCC病理學參數(shù)之間的相關性，Spearman偏相關性分析臨床分期和PLK4表達的凈相關。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PLK4在ESCC細胞和組織中的表達

與Het-1A細胞相比，PLK4基因的mRNA在ESCC細胞中均呈高表達，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖1）。Western blot檢測結果顯示，PLK4蛋白在各ESCC細胞中也呈高表達，與Het-1A相比，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，圖2）。

圖1 Het-1A和ESCC細胞株中的PLK4 mRNA表達Fig.1 Expression of PLK4 mRNA in Het-1A and ESCC cell lines

圖2 Het-1A和ESCC細胞株中的PLK4蛋白的表達Fig.2 Expression of PLK4 protein in Het-1A and ESCC cell lines

通過Western blot檢測ESCC組織和癌旁正常組織中PLK4蛋白的水平，繪制ROC曲線。結果顯示，AUC為0.841，95% CI：0.786～0.895，采用約登指數(shù)最大法得到cutoff值為1.343，靈敏度為74.2%（69/93），特異度為89.2%（83/93），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.0001，圖3，表1）。

表1 PLK4蛋白在ESCC組織和癌旁正常組織中的水平Tab.1 Level of PLK4 protein in ESCC and para-cancerous tissues

圖3 ESCC和癌旁正常組織中PLK4蛋白的水平Fig.3 Level of PLK4 protein in ESCC and para-cancerous tissues

2.2 PLK4蛋白水平與臨床病理學參數(shù)的關系

ESCC組織中PLK4蛋白水平與性別、年齡和腫瘤大小均無關（均P＞0.05），但與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移有關（均P＜0.05）。ESCC分化程度越低，PLK4陽性率越高，其中低分化程度的ESCC組織中PLK4陽性率為86.7%，Ⅲ～Ⅳ期患者ESCC組織中PLK4蛋白陽性率為92.3%（表2）。

表2 ESCC組織中PLK4蛋白水平與臨床病理學參數(shù)的關系Tab.2 Relationship between protein level of PLK4 in ESCC and clinical parameters

2.3 PLK4表達與ESCC臨床分期的相關性分析

ESCC組織中PLK4表達與分化程度、淋巴結轉移和臨床分期均有相關性（P＜0.05），此外，PLK4表達與臨床分期呈正相關（r=0.604，P=0.000，表3）。為了研究臨床分期和PLK4表達的凈相關，經(jīng)Spearman偏相關控制分化程度和淋巴結轉移這兩個因素后，PLK4表達與臨床分期之間的凈相關系數(shù)r為0.539（P=0.000）。

表3 PLK4表達與ESCC臨床病理學參數(shù)相關性分析Tab.3 Correlation analysis between PLK4 expression and ESCC clinic opathological parameters

2.4 抑制PLK4基因的表達對TE-13細胞增殖、侵襲遷移的影響

采用si-RNA干擾技術抑制ESCC細胞TE-13中PLK4的表達，RTFQ-PCR和Western blot結果顯示成功抑制TE-13細胞中PLK4的表達（P＜0.05，圖3）。CCK-8結果顯示，siRNA抑制PLK4的表達后，TE-13的增殖速度顯著低于對照（P＜0.05，圖4A），克隆形成實驗結果顯示，si-PLK4組的克隆細胞數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05，圖4B和4C）。劃痕遷移實驗結果顯示，si-PLK4組的細胞遷移率為16.67%，顯著低于對照組（P＜0.05，圖4D）。Transwell小室實驗結果顯示，si-PLK4組的細胞侵襲數(shù)顯著低于對照組（P＜0.05，圖4E和4F）。

圖4 抑制食管鱗癌細胞TE-13中PLK4的表達Fig.4 Inhibition of PLK4 expression in esophageal squamous cell carcinoma TE-13

2.5 抑制PLK4的表達對mTOR/p70S6K信號轉導通路的影響

為了研究PLK4對TE-13細胞增殖、侵襲和遷移影響的潛在機制，通過Western blot檢測了mTOR/p70S6K信號轉導通路靶蛋白的表達水平。與對照組相比，si-PLK4組mTOR和p70S6K蛋白的表達水平降低，分別為0.69（P＜0.05）和0.56（P＜0.05），此外，p-mTORSer2448和p-p70S6KThr421/Ser424的蛋白水平顯著低于對照組，分別為0.20（P＜0.05）和0.19（P＜0.05，圖5、6）。

圖5 抑制PLK4的表達對TE-13細胞增殖、侵襲和遷移的影響Fig.5 Effect of inhibition of Plk4 expression on proliferation,invasion and migration of TE-13 cells

圖6 PLK4對TE-13細胞mTOR/p70S6K信號轉導通路活性的影響Fig.6 Effects of PSMD7 on the activity of mTOR/p70S6K pathway in TE-13 cells

3 討 論

PLK4作為調節(jié)細胞周期的蛋白激酶，參與有絲分裂的多個步驟，如有絲分裂啟動、中心體成熟、胞質分裂等，同時還參與DNA損傷檢測點和有絲分裂中期檢測點的信號轉導［11-12］。有研究［13］結果顯示，PLK4在結直腸癌中的表達高于癌旁組織，并且與組織分化程度、淋巴結轉移和TNM分期有關。PLK4的高表達與腫瘤組織分級、惡性程度及腫瘤患者的預后呈正相關［14］，提示PLK4可能是腫瘤診斷、預后和化療的評價指標。

通過TCGA數(shù)據(jù)庫對PLK4 mRNA在食管腺癌和正常組織中的表達進行分析，發(fā)現(xiàn)食管腺癌組織中PLK4 mRNA表達的中位值是正常組織的8～9倍［15］，而PLK4在ESCC組織中的表達鮮見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，PLK4在各ESCC細胞中的mRNA表達和蛋白水平均顯著高于正常食管上皮細胞，且ESCC組織標本中PLK4蛋白的水平顯著高于癌旁正常組織。PLK4的表達水平診斷ESCC的AUC為0.841，靈敏度和特異度分別為74.2%和89.2%，PLK4蛋白水平與性別和年齡均無關（P＞0.05），但與分化程度、臨床分期和淋巴結轉移相關（P＜0.05），低分化程度的ESCC組織中PLK4陽性率最高，Ⅲ～Ⅳ期患者ESCC組織中PLK4陽性率最高，說明PLK4表達水平與ESCC的惡性程度有關，參與ESCC的發(fā)生、發(fā)展。

本研究結果表明PLK4表達與臨床分期呈正相關，控制分化程度和淋巴結轉移因素后，PLK4表達與臨床分期之間仍呈正相關。目前已經(jīng)鑒定了幾種PLK4的小分子抑制劑，其中一些正在臨床試驗中。CFI-400945是第一種口服PLK4抑制劑，CFI-400945在PLK4過表達的乳腺癌細胞中具有選擇性的抗腫瘤活性［16］。進一步的研究證明了CFI-400945在多種腫瘤中具有顯著的抗腫瘤作用，包括胰腺癌［17］、肺癌［18］、肝癌［19］和乳腺癌［20］。YLT-11是一種新設計的選擇性PLK4抑制劑，Lei等［21］的研究表明YLT-11能顯著抑制乳腺癌細胞的增殖，并導致中心體復制和有絲分裂缺陷的失調，從而增加腫瘤細胞對化療的敏感性。鑒于PLK4在ESCC中呈高表達，以及與臨床分期的正相關性，PLK4有望成為ESCC潛在的治療靶點。

在細胞增殖過程中mTOR/p70S6K信號轉導通路發(fā)揮關鍵作用，并受其他蛋白質的調節(jié)［22-23］。Wu等［24］探索了臨床ESCC組織標本中mTOR/p70S6K信號轉導通路中各種靶蛋白水平與臨床病理學因素以及患者預后之間的關系，發(fā)現(xiàn)mTOR、p-mTOR、p70S6K、p-p70S6K、延伸起始因子4E、結合蛋白-1等在腫瘤組織中顯著上調，mTOR和p70S6K的表達與總生存期相關，而p-mTOR與無進展生存期相關，并證實mTOR的過表達是ESCC總體生存的獨立不良預后因素。白血病患者的腫瘤細胞中誘導Plk1的表達后使mTOR信號轉導通路激活，促進腫瘤細胞的增殖，并抑制細胞的凋亡［25］。在ESCC細胞系中，mTOR/p70S6K信號轉導通路通過多個絲氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化被激活［26］，下調PLK4不僅降低mTOR和p70S6K的表達，還可抑制p-mTORSer2448和p-p70S6KThr421/Ser424的表達。本研究結果顯示，下調PLK4引起的ESCC細胞增殖和侵襲遷移能力的降低可能與mTOR/p70S6K信號轉導通路密切相關。

本研究結果證實，PLK4在ESCC細胞系和組織中的高表達，與分化程度、臨床分期及淋巴結轉移相關。進一步的機制研究表明，PLK4可能通過mTOR/p70S6K信號轉導通路抑制TE-13細胞的增殖和侵襲遷移能力。