侯 凈，程紀(jì)淦，王 華，魏 娜，倪 青

貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽(yáng) 550002

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）發(fā)布的最新數(shù)據(jù)顯示，2020年全球乳腺癌新增病例數(shù)達(dá)226萬(wàn)［1］。近年來(lái)，在根據(jù)乳腺癌分子分型進(jìn)行分類治療的原則指導(dǎo)下，乳腺癌患者的預(yù)后得到顯著改善，但某些亞型如三陰性乳腺癌因其自身惡性程度較高且缺乏靶向藥物，目前治療仍較棘手。因三陰性乳腺癌伴有較高比例的BRCA基因突變且存在DNA修復(fù)缺陷，因此利用聯(lián)合致死策略治療三陰性乳腺癌一直是該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［2］。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly (ADP-ribose)polymerase，PARP］抑制劑是第一種成功利用聯(lián)合致死策略獲得批準(zhǔn)在臨床使用的抗癌藥物。目前，PARP抑制劑被美國(guó)食品藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)用于卵巢癌、原發(fā)性腹膜癌的治療［3］。隨著乳腺癌兩個(gè)Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果的公布，PARP抑制劑奧拉帕利（olaparib）已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療胚系BRCA突變的晚期乳腺癌［4］。另一個(gè)PARP抑制劑他拉唑帕尼（talazoparib）也被美國(guó)FDA授予優(yōu)先審評(píng)資格［5］。目前有關(guān)乳腺癌還有大量的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中，新的使用方法及新的適應(yīng)證不斷出現(xiàn)，進(jìn)一步為乳腺癌的治療增加選擇性。然而PARP抑制劑的應(yīng)用仍存在兩個(gè)問(wèn)題：一是目前僅用于伴BRCA突變的患者，能否拓展到其他類型的乳腺癌以使更多的患者獲益？二是耐藥問(wèn)題普遍存在。要解決這兩個(gè)問(wèn)題，一方面需要對(duì)PARP抑制劑的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，另一方面就是篩選能增加PARP抑制劑敏感性的藥物。本研究通過(guò)篩選能夠抑制DNA同源重組（homologous recombination，HR）修復(fù)的藥物找到硝呋齊特（nifuroxazide），并發(fā)現(xiàn)其與PARP抑制劑奧拉帕利有聯(lián)合增敏效應(yīng)，報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231，人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS及HEK-293T培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，向培養(yǎng)基中添加l0%的胎牛血清、1 mmol/L非必需氨基酸、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL的青霉素、100 mg/mL的鏈霉素，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度環(huán)境中培養(yǎng)。

1.2 See-Saw系統(tǒng)及藥物篩選

See-Saw系統(tǒng)的構(gòu)建：在綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的3’端克隆引入兩個(gè)方向相反的I-SceI靶點(diǎn)。I-SceI表達(dá)能誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）。當(dāng)DNA損傷通過(guò)非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）修復(fù)時(shí)，細(xì)胞表達(dá)GFP，若損傷通過(guò)HR修復(fù)時(shí)，細(xì)胞則表達(dá)紅色熒光蛋白（red fluorescent protein，RFP）。本研究使用帶有See-Saw 2.0報(bào)告系統(tǒng)的MCF-7細(xì)胞來(lái)分析DSB修復(fù)的效率。將See-Saw 2.0質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MCF-7細(xì)胞中，用G418篩選2周穩(wěn)定，然后用表達(dá)I-SceI的慢病毒感染細(xì)胞，6 h后接種細(xì)胞于96孔板中。24 h后，用指定藥物處理細(xì)胞。36 h后，收集細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）懸浮后用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)。

1.3 HR與NHEJ報(bào)告系統(tǒng)

將HEK-293T細(xì)胞鋪于24孔板中過(guò)夜，將HR報(bào)告基因（DR-GFP）或NHEJ報(bào)告基因（EJ5-GFP）以及pCBA-I-SceI和mCherry按2∶2∶1轉(zhuǎn)染細(xì)胞。6 h后用藥物處理，36 h后收集細(xì)胞，然后進(jìn)行FCM檢測(cè)分析。

1.4 克隆形成實(shí)驗(yàn)

將300～500個(gè)MCF-7、U2OS細(xì)胞接種到6孔板中。24 h后用藥物處理，然后培養(yǎng)10～14 d。用4%多聚甲醛溶液室溫固定20 min，用0.1%結(jié)晶紫室溫染色20 min。計(jì)數(shù)≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

1.5 MTS檢測(cè)

將2000～4000個(gè)MCF-7、MDA-MB-231細(xì)胞接種到96孔板中。貼壁后用不同濃度藥物處理，然后培養(yǎng)72 h。加入MTS，溫育2～4 h后檢測(cè)490 nm處的吸光度（D）值。

1.6 免疫熒光染色

免疫熒光染色用于檢測(cè)藥物處理后γH2AX焦點(diǎn)的形成情況以了解DNA損傷的程度及修復(fù)能力。簡(jiǎn)要步驟如下：在6孔板中爬片過(guò)夜，然后用藥物處理1、8 h，用4%多聚甲醛溶液固定，室溫溫育10～20 min；用PBS洗滌3次，每次5 min，0.2%Triton透化處理5～10 min；用含3%牛血清白蛋白的PBS室溫封閉1 h；PBS洗滌3次，每次5 min；一抗4 ℃溫育過(guò)夜，然后用PBS洗滌3次，每次5 min；二抗室溫溫育1 h，PBS洗滌3次，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染，封片，在共聚焦顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用Graphpad Prism 8軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)均以x±s表示。采用雙側(cè)t檢驗(yàn)比較實(shí)驗(yàn)組之間的差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硝呋齊特抑制細(xì)胞HR修復(fù)

HR修復(fù)在DNA雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮重要作用，從而維持基因組的穩(wěn)定性。然而，癌細(xì)胞可能通過(guò)不同機(jī)制上調(diào)HR能力并引起治療耐受。因此，誘導(dǎo)HR修復(fù)缺陷（HR deficiency，HRD）是一種可行的克服細(xì)胞對(duì)DNA損傷藥物耐藥的策略。為此，本研究利用See-Saw 2.0報(bào)告基因系統(tǒng)篩選潛在的能抑制HR的藥物。See-Saw 2.0系統(tǒng)是一種研究DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的新工具，其中RFP陽(yáng)性細(xì)胞和GFP陽(yáng)性細(xì)胞分別代表HR或NHEJ對(duì)I-Scel誘導(dǎo)的雙鏈損傷修復(fù)。本研究使用TargetMOL（目錄編號(hào)：L8200）小分子藥物庫(kù)（包含240種藥物）處理含有See-Saw 2.0體系的MCF-7細(xì)胞。然后檢測(cè)HR和NHEJ效率。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化RFP與GFP比值，藥物被分為兩類。RFP與GFP比例小于1表示目標(biāo)藥物能抑制HR，RFP與GFP比值大于等于1的藥物表示能促進(jìn)HR（圖1A）。在抑制HR的候選藥物中，我們發(fā)現(xiàn)硝呋齊特抑制作用顯著，因此選擇該藥物用于后續(xù)研究。為進(jìn)一步驗(yàn)證硝呋齊特能抑制HR，在HEK-293T細(xì)胞中采用DR-GFP報(bào)告基因檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證。硝呋齊特處理細(xì)胞后顯著抑制HR效率，抑制程度與劑量相關(guān)，而對(duì)NHEJ無(wú)明顯影響（圖1B）。

圖1 硝呋齊特抑制DNA HR修復(fù)Fig.1 Nifuroxazide inhibits HR repair of DNA

2.2 硝呋齊特增加奧拉帕利致DNA損傷程度

因?yàn)橄踹积R特能抑制HR，我們推測(cè)其能增加PARP抑制劑所造成的DNA損傷程度。為驗(yàn)證這一假設(shè)，本研究利用免疫熒光檢測(cè)硝呋齊特單用或聯(lián)合PAR P抑制劑奧拉帕利處理細(xì)胞后DNA損傷標(biāo)志物γH2AX（組蛋白H2AX上的第139位絲氨酸發(fā)生磷酸化修飾）焦點(diǎn)形成情況，發(fā)現(xiàn)單用硝呋齊特處理細(xì)胞后無(wú)明顯γH2AX焦點(diǎn)形成，提示硝呋齊特不會(huì)引起DNA雙鏈斷裂，單用奧拉帕利后有少量γH2AX焦點(diǎn)形成，8 h后基本修復(fù)。而聯(lián)用后γH2AX焦點(diǎn)形成數(shù)目明顯增加，且8 h后仍有較多γH2AX焦點(diǎn)（圖2），表示硝呋齊特能增加奧拉帕利致DNA損傷程度并降低損傷修復(fù)能力。

圖2 硝呋齊特增加奧拉帕利致DNA損傷程度，延遲損傷修復(fù)時(shí)間Fig.2 Nifuroxazide increases DNA damage induced by olaparib and delays damage repair

2.3 硝呋齊特增加奧拉帕利治療敏感性

基于上述結(jié)果，我們推測(cè)硝呋齊特能增加奧拉帕利治療敏感性，我們采用MTS方法檢測(cè)奧拉帕利單用或聯(lián)合硝呋齊特處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MDA-MB-231后的細(xì)胞增殖情況，聯(lián)用硝呋齊特可增加奧拉帕利對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用（圖3）。此外，克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示，奧拉帕利和硝呋齊特聯(lián)用能顯著抑制細(xì)胞的克隆形成效率（圖4）。且該效應(yīng)在U2OS細(xì)胞中也得到證實(shí)，表明硝呋齊特對(duì)奧拉帕利的增敏作用不限于乳腺癌細(xì)胞。

圖3 硝呋齊特增加奧拉帕利對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用Fig.3 Nifuroxazide increases the inhibitory effect of olaparib on breast cancer cells

圖4 硝呋齊特增加奧拉帕利克隆形成抑制作用Fig.4 Nifuroxazide increases the inhibitory effect olaparib on clone formation

3 討 論

對(duì)于攜帶BRCA突變的乳腺癌患者，目前主要的治療方式包括手術(shù)治療和藥物治療，其中藥物治療包括鉑類藥物及PARP抑制劑治療。作為一種利用合成致死效應(yīng)對(duì)存在DNA HR修復(fù)缺陷的患者具有選擇性毒性的靶向藥物，PARP抑制劑最初被批準(zhǔn)用于卵巢癌的治療，但其快速發(fā)展使乳腺癌患者獲益［6］。隨著PARP抑制劑奧拉帕利治療乳腺癌的Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果［4］的公布，其已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于治療胚系BRCA突變的晚期乳腺癌患者；另一個(gè)PARP抑制劑talazoparib也于2018年獲得美國(guó)FDA批準(zhǔn)用于人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陰性伴有BRCA突變的局部晚期或轉(zhuǎn)移性乳腺癌［5］的治療。

從藥理作用上講，PARP抑制劑主要針對(duì)的是存在DNA HR修復(fù)缺陷的腫瘤，研究［7］發(fā)現(xiàn)，除BRCA突變?cè)斐傻腍R修復(fù)缺陷外，其他參與HR修復(fù)的基因如ATM、ATR、PALB2和FANC等亦可發(fā)生變異而降低HR修復(fù)能力，這一現(xiàn)象被稱為“BRCAness”。存在BRCAness的腫瘤對(duì)PARP抑制劑也較敏感，這在理論上擴(kuò)寬了PARP抑制劑的應(yīng)用范圍。因此，這為非BRCA突變的乳腺癌患者應(yīng)用PARP抑制劑提供了理論依據(jù)。一種行之有效的方式為篩選能降低HR修復(fù)效率的已知藥物，而后與PARP抑制劑聯(lián)合使用［8］。以此為切入點(diǎn)，本研究使用可誘導(dǎo)雙鏈斷裂繼而檢測(cè)DNA修復(fù)能力的See-Saw 2.0系統(tǒng)篩選了240種小分子抑制劑，發(fā)現(xiàn)約20個(gè)藥物能在一定程度上抑制乳腺癌細(xì)胞HR修復(fù)，其中效果比較顯著的藥物包括硝呋齊特。因硝呋齊特已被臨床用于治療結(jié)腸炎和腹瀉，且有研究顯示，硝呋齊特是一種STAT3抑制劑［9-10］。此外，有研究報(bào)道［11-12］靶向STAT3可增加奧拉帕利敏感性，因此本研究選擇硝呋齊特進(jìn)一步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硝呋齊特能增加奧拉帕利所致的DNA損傷程度并降低DNA的修復(fù)能力，細(xì)胞增殖及克隆形成實(shí)驗(yàn)也顯示，硝呋齊特對(duì)奧拉帕利有增敏效應(yīng)。雖然本研究?jī)H為表型上的初步探索，但仍有一定臨床意義：首先，硝呋齊特的確能增加奧拉帕利的敏感性；其次，選用的MCF-7細(xì)胞及U2OS細(xì)胞為BRCA野生型，說(shuō)明硝呋齊特的作用不受BRCA突變狀態(tài)的影響；此外，因硝呋齊特已用于臨床，這種老藥新用的策略為藥物開(kāi)發(fā)節(jié)省了研究成本。綜上，硝呋齊特作為一種奧拉帕利的潛在增敏劑，值得進(jìn)一步研究探索。