賀國(guó)洋，陳慶慶，鄧美靜，王高翔，王貝璽，王永霞，李 巍，千新來(lái)，朱會(huì)芳

1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453003；

2.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證教研室，河南 新鄉(xiāng) 453003；

3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453003；

4.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院病理科，河南 新鄉(xiāng) 453003；

5.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院結(jié)直腸肛門(mén)外科，河南 新鄉(xiāng) 453003

胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］，胃癌早期無(wú)特異性癥狀，80%的患者確診時(shí)已是中晚期［2］，腫瘤轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要原因。胃癌的危險(xiǎn)因素主要為幽門(mén)螺旋桿菌感染［3］。隨著傳統(tǒng)放療、化療和新輔助治療的進(jìn)步，早期胃癌患者的5年生存率可達(dá)到95%［1］。

Diaphanous相關(guān)成蛋白3（diaphanous-related formin 3，DIAPH3）是一種肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白，由FDD、FH1和FH2結(jié)構(gòu)域組成，位于人類(lèi)染色體13q21.1上，研究發(fā)現(xiàn)DIAPH3在減數(shù)分裂、有絲分裂、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中間接影響肌動(dòng)蛋白和微管網(wǎng)絡(luò)而發(fā)揮重要作用［4］。DIAPH3作為一種非典型的轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)因子，在腫瘤中可抑制細(xì)胞向阿米巴樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化［4］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，DIAPH3通過(guò)激活硒蛋白三R1介導(dǎo)的抗氧化作用促進(jìn)胰腺癌的進(jìn)展［5］。DIAPH3通過(guò)激活β-actin/TCF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)移［6］。在肺腺癌中，可以觀察到DIAPH3的表達(dá)，可能受到P53負(fù)調(diào)控［7］。細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）是一種致癌基因，在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，與細(xì)胞增殖密切相關(guān)［8］。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，EMT賦予腫瘤細(xì)胞起始和轉(zhuǎn)移的潛能［9］。但DIAPH3在胃癌中的作用及其分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。

本文主要探究DIAPH3對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響及分子機(jī)制，旨在為胃癌患者的診治尋找新的靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 臨床資料

62例胃癌患者的石蠟包埋癌組織及配對(duì)癌旁組織均來(lái)自于2020年1月—2020年12月年新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第四臨床學(xué)院病理科保存的石蠟標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者術(shù)前均未行放療、化療及免疫治療，具有手術(shù)治療適應(yīng)證，符合胃癌手術(shù)病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)。本研究獲得新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與主要試劑

胃癌細(xì)胞（HGC27、AGS、SGC7901、MKN28）均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)/中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。胃癌細(xì)胞系SGC7901、HGC27在含10%FBS和雙抗（青霉素100 U/mL，鏈霉素100 μg/mL）的高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，AGS在含10%FBS和雙抗F12K培養(yǎng)基中培養(yǎng)，MKN28在含10%FBS和雙抗RPMI-1640培養(yǎng)基中，放置在CO2體積分?jǐn)?shù)為5%、37 ℃的恒溫溫育箱中培養(yǎng)。高糖培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，Opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自浙江森瑞生物有限公司，胎牛血清FBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)皿、細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，RIPA裂解液、Western blot試劑盒上海碧云天生物技術(shù)有限公司，脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，TRIzol購(gòu)自美國(guó)Technologies公司，2×SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司，GAPDH（AP0066）抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DIAPH3（14342-1-AP）抗體和cyclin D1（26939-1-AP）抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，E-cadherin（#33541）抗體和vimentin（#38550）抗體購(gòu)自美國(guó)SAB公司，N-cadherin（CY5015）抗體購(gòu)自鄭州白蘋(píng)生物科技有限公司。過(guò)表達(dá)質(zhì)粒由擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成，DIAPH3小干擾片段（siRNA）、干擾對(duì)照片段（NC）、cyclin D1小干擾片段（siRNA）和vimentin小干擾片段（siRNA）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連結(jié)染色法，4%多聚甲醛固定標(biāo)本，石蠟包埋，切片，脫蠟，水化，PBS清洗。高壓修復(fù)、室溫冷卻，PBS清洗，加入3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次。山羊血清封閉3 h，甩干血清后，直接加入DIAPH3特異性抗體（1∶300），于4 ℃冰箱溫育過(guò)夜。次日，室溫下放置1 h。滴加山羊抗兔二抗，37 ℃溫育30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、流水藍(lán)化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。①根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例計(jì)算：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤25%計(jì)1分，26%～50%計(jì)2分，＞50%計(jì)3分。② 根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色程度計(jì)分：未染色計(jì)0分，淺黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分結(jié)果為陰性，4～6分結(jié)果為陽(yáng)性［10］。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

轉(zhuǎn)染時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%，根據(jù)說(shuō)明書(shū)將2 μg 表達(dá)質(zhì)粒/4 μL RNAi片段分別利用4 μL LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，6～8 h后換無(wú)雙抗10%FBS培養(yǎng)基，24～48 h后收集細(xì)胞做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為干擾對(duì)照組（NC組）、干擾DIAPH3組（si-DIAPH3組）、過(guò)表達(dá)對(duì)照組（control組）、過(guò)表達(dá)DIAPH3組（DIAPH3組）、過(guò)表達(dá)DIAPH3干擾cyclin D1組（DIAPH3+si-cyclin D1組）和過(guò)表達(dá)DIAPH3干擾vimentin組（DIAPH3+si-vimentin組）。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞利用TRIzol法提取總RNA，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，RTFQPCR反應(yīng)體系為10 μL，包括上下游引物各0.25 μL，cDNA模板為2 μL，雙蒸水2.5 μL，SYBR Green染料5 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃10 min；95℃ 15 s；53℃ 45 s，40個(gè)循環(huán)。β-actin上游引物為5'-CGCGAGATGACCCAGAT-3'，下游引物為5'-TCACCGGATCCATCACGAT-3'；DIAPH3上游引物為5'-TGAATAACTTCAGAA CCACATT-3'，下游引物為5'-CTCCTGTCTC ATCACCCT-3'。干擾NC片段5'-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAA TT-3'，干擾si-1片段5'-GCCUGGAUAUCCAAC UUAATTUUAAGUUGGAUAUCCAGGCTT-3'，干擾si-2片段5'-GCUCAAACCUUCGGAUUUA TTUAAAUCCGAAGGUUUGAGCTT-3'，cyclin D1干擾片段為5'-AAACACGCGCAGACCTTCG TTGCCTTGCACTGCGGCCACC-3'，vimentin干擾片段為5'-ACCAGCTAACCAACGACAAAGC CCGTGCCAGAGACGCATTGTCAACA-3'。根據(jù)2-ΔΔCt值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算平均值。

1.3.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)

提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量蛋白濃度，取30 μg蛋白用于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE）。清洗玻璃板，置于烘箱中烘干備用；檢漏后分別配濃縮膠和分離膠，待膠凝固后將玻璃板取出置于電泳槽中，加入電泳液，拔出梳子，加樣，80 V展開(kāi)濃縮膠，120 V展開(kāi)分離膠；260 mA恒流轉(zhuǎn)至PVDF膜180 min；轉(zhuǎn)膜完畢后，將膜取出，放置于5%牛血清白蛋白中封閉2 h；用鑷子將膜取出，分別溫育一抗DIAPH3抗體（1∶1000）、cyclin D1抗體（1∶1000）、E-cadherin抗體（1∶1000）、vimentin抗體（1∶1000）、N-cadherin抗體（1∶1000）4 ℃過(guò)夜；洗膜緩沖液（trisbuffered saline Tween，TBST）洗膜3次，每次15 min；室溫溫育二抗（1∶5000）1 h；TBST洗膜3 次，每次15 min；電化學(xué)發(fā)光（electrochemical luminescence，ECL）顯影。以GAPDH為內(nèi)參，結(jié)果以不同處理組與GAPDH的灰度值比值表示。

1.3.5 CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

取轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶1 mL消化，以2×103個(gè)/孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別于第1～5天每孔加入10 μL CCK-8，37 ℃恒溫溫育箱培育2 h，利用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處每孔的吸光度（D）值。

1.3.6 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞接種到6孔板中，按上述轉(zhuǎn)染方式進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，行劃痕操作，并用 PBS 沖洗以去除細(xì)胞碎片。在0、24和48 h觀察細(xì)胞的遷移情況，并拍照記錄。

1.3.7 Transwell小室實(shí)驗(yàn)

將胃癌細(xì)胞接種到6孔板中，按上述轉(zhuǎn)染方式進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用不含血清的培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞密度為5×105個(gè)/mL，上室加入200 μL細(xì)胞懸液，下室加入600 μL含10%FBS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用移液器吸嘴吸去上室培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛組織固定液30 min，PBS洗2遍，再加1 mL 0.1%結(jié)晶紫染液于24孔板中，放入小室，固定染色30 min；PBS洗凈并倒置風(fēng)干，正置顯微鏡下觀察拍照。每張膜選5個(gè)視野，計(jì)算平均細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)中所獲得的數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料均以表示。圖表采用GraphPad Prism 8.2軟件繪制。兩組間比較采用t檢驗(yàn)分析；多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DIAPH3在胃癌組織中的表達(dá)升高

GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)［11］在線分析顯示，與癌旁組織相比，胃癌組織中DIAPH3在mRNA水平顯著上調(diào)（P＜0.05）。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，DIAPH3主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，為棕褐色顆粒；胃癌組織中DIAPH3的陽(yáng)性率為70.97%（44/62），高于癌旁組織的16.13%（10/62），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖1）。

圖1 DIAPH3在胃癌中表達(dá)升高Fig.1 Higher expression of DIAPH3 in gastric cancer tissues

2.2 胃癌組織中DIAPH3表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的相關(guān)性

免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，與高中分化組相比，低分化組中DIAPH3蛋白質(zhì)水平顯著升高（P＜0.05）；與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中DIAPH3蛋白質(zhì)水平顯著升高（P＜0.05）。而DIPAH3蛋白質(zhì)水平與患者性別、年齡和腫瘤直徑無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05，表1）。

表1 胃癌組織中DIAPH3表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系Tab.1 Relationship between DIAPH3 expression and clinicopathological characteristics in gastric carcinoma

2.3 基因修飾后胃癌細(xì)胞中DIAPH3蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)

Western blot和RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在4株胃癌細(xì)胞中DIAPH3蛋白質(zhì)和mRNA的表達(dá)由高到低依次為HGC27、AGS、SGC7901和MKN28（圖2）。在HGC27和AGS細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染干擾片段后，si-DIAPH3-1組和si-DIAPH3-2組DIAPH3蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)顯著低于干擾對(duì)照組（P＜0.05），本研究選取效率最高的干擾片段1進(jìn)行后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。在SGC7901和M KN28 細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染DIAPH3 質(zhì)粒后，過(guò)表達(dá)組中DIAPH3表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，圖2）。

圖2 DIAPH3在敲低或過(guò)表達(dá)胃癌細(xì)胞中的效率驗(yàn)證Fig.2 Efficiency verification of DIAPH3 in gastric cancer cells after knocking down or over-expressing DIAPH3

2.4 DIAPH3通過(guò)增強(qiáng)cyclin D1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，si-DIAPH3組HGC27和AGS細(xì)胞的增殖活力顯著下降（P＜0.05)；與對(duì)照組相比，DIAPH3過(guò)表達(dá)組SGC7901和MKN28細(xì)胞的增殖活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，si-DIAPH3組HGC27和AGS細(xì)胞中cyclin D1蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；Western blot和RTFQ-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DIAPH3+si-cyclin D1組蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加，與DIAPH3組比較，DIAPH3+si-cyclin D1組蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，DIAPH3+si-cyclin D1組細(xì)胞增殖活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），與DIAPH3組相比，DIAPH3+sicyclin D1組細(xì)胞增殖活力顯著下降（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示，DIAPH3通過(guò)增強(qiáng)cyclin D1表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖（圖3）。

圖3 DIAPH3通過(guò)增強(qiáng)cyclin D1的表達(dá)促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖Fig.3 DIAPH3 promotes the proliferation of gastric cancer cells through enhancing the expression of cyclin D1

2.5 DIAPH3通過(guò)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與干擾對(duì)照組比較，si-DIAPH3組HGC27和AGS 細(xì)胞的遷移和侵襲能力均顯著下降（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，DIAPH3過(guò)表達(dá)組SGC7901和MKN28細(xì)胞的遷移和侵襲的能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。EMT是上皮來(lái)源的腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的重要生物學(xué)過(guò)程，在這一過(guò)程中，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性，獲得了較高的遷移、侵襲和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型。我們進(jìn)一步通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾DIAPH3組HGC27和AGS細(xì)胞中E-cadherin蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增高，N-cadherin和vimentin蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，DIAPH3過(guò)表達(dá)組SGC7901和MKN28細(xì)胞中E-cadherin蛋白質(zhì)表達(dá)顯著降低，N-cadherin和vimentin蛋白質(zhì)表達(dá)顯著增高（P＜0.05）。為了證明DIAPH3通過(guò)EMT促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，我們用SGC7901和MKN28細(xì)胞，過(guò)表達(dá)DIAPH3后干擾vimentin，檢測(cè)胃癌細(xì)胞中vimentin的表達(dá)量。Western blot和RTFQ-PCR結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，DIAPH3+si-vimentin組vimentin轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著增加；與DIAPH3過(guò)表達(dá)組相比，DIAPH3+si-vimentin組vimentin轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，DIAPH3+si-vimentin組SGC7901和MKN28細(xì)胞的遷移和侵襲的能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05）；與DIAPH3過(guò)表達(dá)組相比，SGC7901和MKN28細(xì)胞的遷移和侵襲的能力均顯著降低（P＜0.05，圖4）。

圖4 DIAPH3促進(jìn)胃癌細(xì)胞遷移Fig.4 DIAPH3 promotes the migration capacity of gastric cancer cells

圖6 DIAPH3促進(jìn)胃癌細(xì)胞EMT進(jìn)程Fig.6 DIAPH3 promotes EMT progression of gastric cancer

3 討 論

胃癌是全球第5大常見(jiàn)惡性腫瘤，也是癌癥死亡第3大原因。胃癌的危險(xiǎn)因素主要為幽門(mén)螺桿菌感染［3］。胃癌的組織分型90%為腺癌［12］，盡管外科手術(shù)、放療、化療和新輔助治療技術(shù)不斷進(jìn)步，但患者預(yù)后仍較差［10］。根據(jù)調(diào)查分析，年輕人患胃癌的發(fā)病率正在逐漸增加［13］。由于早期胃癌診斷率過(guò)低，大部分患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就為中晚期胃癌，從而錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致胃癌患者死亡的重要原因。因此針對(duì)胃癌尋找新的診療靶點(diǎn)，是目前研究的重點(diǎn)。

DIAPH3 基因定位于染色體13q 21.2，是diaphanous相關(guān)成蛋白［14］家族的一員。Diaphanous相關(guān)成蛋白［14］家族成員廣泛參與肌動(dòng)蛋白重塑和調(diào)節(jié)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和黏附，如內(nèi)吞運(yùn)輸、有絲分裂、細(xì)胞極性和遷移等［15］。在腫瘤轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生改變是由細(xì)胞骨架控制的。另有研究證實(shí)DIAPH3在肺癌［17］、前列腺癌和乳腺癌［4］中均發(fā)揮重要作用。目前，DIAPH3在胃癌中的作用及其分子機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析和免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)胃癌組織中DIAPH3表達(dá)顯著增高。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，干擾DIAPH3后胃癌細(xì)胞的增殖能力下降，而過(guò)表達(dá)DIAPH3后胃癌的增殖能力增強(qiáng)。已有研究證實(shí)，cyclin D1通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶結(jié)合，使細(xì)胞通過(guò)G1期進(jìn)入S期完成分裂增殖，cyclin D1的過(guò)度表達(dá)縮短了G1期的時(shí)限，促使細(xì)胞發(fā)生惡性增殖，因而cyclin D1的水平變化可用于多種腫瘤診斷及預(yù)后判斷［16-18］。干擾DIAPH3后胃癌細(xì)胞中cyclin D1蛋白質(zhì)表達(dá)下降，過(guò)表達(dá)DIAPH3后胃癌細(xì)胞中cyclin D1蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)DIAPH3后干擾cyclin D1，胃癌細(xì)胞增殖能力較過(guò)表達(dá)DIAPH3的增殖能力降低。本研究結(jié)果提示，DIAPH3通過(guò)增強(qiáng)cyclin D1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾DIAPH3后，胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降，而過(guò)表達(dá)DIAPH3后，胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力增強(qiáng)。過(guò)表達(dá)DIAPH3后干擾vimentin，胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力較過(guò)表達(dá)DIAPH3胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中起著重要作用，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步，在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞失去細(xì)胞極性，形成具有遷移能力的間質(zhì)細(xì)胞［19-20］。為了明確DIAPH3是否通過(guò)EMT進(jìn)程促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干擾DIAPH3后，胃癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白質(zhì)表達(dá)增高，N-cadherin和vimentin蛋白質(zhì)表達(dá)降低，而過(guò)表達(dá)DIAPH3后，胃癌細(xì)胞中E-cadherin蛋白質(zhì)表達(dá)降低，N-cadherin和vimentin蛋白質(zhì)表達(dá)增高。我們的研究結(jié)果表明，DIAPH3通過(guò)EMT進(jìn)程促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

綜上所述，DIAPH3在胃癌中表達(dá)增高，且DIAPH3表達(dá)與腫瘤分化和有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，DIAPH3通過(guò)增強(qiáng)cyclin D1的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖。DIAPH3通過(guò)EMT進(jìn)程促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲。